Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

جيل من البلازميد ناقلات معربا عن بروتينات الموسومة FLAG تحت تنظيم الاستطالة الإنسان عامل-1α المروج عن طريق الجمعية جيبسون

Published: February 9, 2015 doi: 10.3791/52235
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center

Abstract

جيبسون التجمع (GA) الاستنساخ يوفر بديلا السريع، وموثوق بها، ومرنة لأساليب استنساخ DNA التقليدية. كنا GA لخلق البلازميدات مخصصة للتعبير عن الجينات الخارجية في الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs). التعبير عن الجينات الخارجية تحت سيطرة SV40 أو المروجين الفيروس المضخم للخلايا البشرية يقلل بسرعة بعد ترنسفكأيشن إلى mESCs. وهناك علاج لهذا التعبير تقلص هو استخدام البشري استطالة عامل 1 ألفا (hEF1α) المروج لدفع التعبير الجيني. ناقلات البلازميد التي تحتوي على hEF1α ليست كما المتاحة على نطاق واسع SV40- أو البلازميدات التي تحتوي على CMV، وخاصة تلك التي تحتوي على N-أيضا محطة 3xFLAG-العلامات. بروتوكول الموصوفة هنا هو طريقة سريعة لخلق البلازميدات معربا-FLAG الموسومة CstF-64 وCstF-64 متحولة تحت تنظيم التعبيري من المروج hEF1α. يستخدم GA مزيج من نوكلياز خارجية DNA، البلمرة DNA ويغاز DNA لجعل استنساخ تداخل نهايات شظايا الحمض النووي الممكنة.واستنادا إلى السلطات الوطنية المعينة قالب كان لدينا المتاحة، قمنا بتصميم يبني لدينا ليتم تجميعها في تسلسل واحد. تصميم لدينا تستخدم في أربعة أجزاء DNA: pcDNA 3.1 ناقلات العمود الفقري، hEF1α المروج جزء 1، hEF1α المروج جزء 2 (الذي يتضمن 3xFLAG العلامة شراؤها باعتبارها جزء DNA الاصطناعية المزدوج تقطعت بهم السبل)، وإما CstF-64 أو محدد CstF-64 متحولة. تم تحميلها متواليات من هذه الشظايا إلى جيل أداة التمهيدي لتصميم الاشعال PCR المناسبة لتوليد شظايا الحمض النووي. بعد PCR، كانت مختلطة مع شظايا الحمض النووي تم تجميعها متجه تحتوي على علامة انتقائية ورد فعل الاستنساخ GA. تم عزل البلازميدات من المستعمرات البكتيرية تحولت الفردية. وقد تم الشاشة الأولى من البلازميدات من تقييد الهضم، تليها التسلسل. في الختام، GA يسمح لنا لخلق البلازميدات مخصصة للتعبير الجينات في 5 أيام، بما في ذلك بناء شاشات والتحقق.

Introduction

تعتمد إجراءات استنساخ DNA التقليدية على استخدام الانزيمات تقييد ليلتصق الحمض النووي والحمض النووي يغاز للانضمام إلى شظايا الحمض النووي معا. جيل من بنيات التعبير مخصص يحتوي شظايا الحمض النووي مختلفة هو إجراء متسلسل يتضمن الانقسام من الحمض النووي مع واحد و / أو نوكليازات الاقتطاع الداخلية المتعددة والإدراج لاحق من شظايا الحمض النووي من خلال ربط. العيب الرئيسي من هذا الإجراء هو أن إنزيمات تقييد مناسبة لواحدة من شظايا الحمض النووي قد يكون من الصعب تحديد (أي، قد يكون لديك عدة مواقع الانقسام) تقديم استنساخ DNA الناجح للبروتين كامل طول الاهتمام مستحيلة. ولذلك، جيل التعبير العرف يبني تحت تنظيم النسخي من نوع محدد المروجين خلية فعالة مع تخصيص البروتين علامات يتطلب تصميم دقيق للغاية. وإنما هو أيضا تقنية الزمنية وتستغرق والعمل. في الآونة الأخيرة، وصفت عدة تقارير منهجيات لتجميع multipلو مختلفة شظايا الحمض النووي الاصطناعي في تسلسل مستمر في نفس الوقت في أي ردود فعل واحد أو خطوتين من دون استخدام تقييد الانزيمات 1-3. والاستنساخ رد فعل من خطوة واحدة (باستثناء جميع الخطوات التحضيرية)، ويعتمد على استخدام مزيج من نوكلياز خارجية DNA، البلمرة DNA، DNA يغاز 2،3 وينتهي متداخلة من شظايا الحمض النووي (الشكل 1). حيث لا يوجد استخدام الانزيمات التقييد، شظايا الحمض النووي من أي حجم وتكوين تسلسل (باستثناء تسلسلات متكررة جدا) يمكن أن تنصهر معا في بناء سلس. في الآونة الأخيرة، عدة التجارية (جيبسون التجمع؛ GA) أصبحت لردود الفعل استنساخ خطوة واحدة المتاحة. هذه المجموعة تسمح التجمع كفاءة السريع وتكلفة أي شظايا الحمض النووي في ناقل واحد مع المروجين مخصصة وعلامات البروتين.

والمتاحة على نطاق واسع ناقلات التعبير البلازميد استعمالها للتعبير عن البروتينات الخارجية في الثدييات نماذج ثقافة الخلية غالبا ما تكون تحت ريج النسخيulation من الفيروس المضخم للخلايا الفيروسية (CMV) أو قردي فيروس 40 (SV40) المروجين. توفر هذه المروجين الفيروسي التعبير عابرة القوي للبروتينات الخارجية في معظم نماذج الثدييات القائمة على الثقافة الخلية. ومع ذلك، جيل من خطوط الخلايا معربا عن ستابلي البروتينات الخارجية غالبا ما يكون غير ناجحة بسبب إسكات النسخي من CMV أو المروجين SV40 خلال 4،5 عملية التأسيس. وبالإضافة إلى ذلك، فإن SV40 وCMV الفيروسي المروجين لا تشجع بما فيه الكفاية للتعبير عن البروتينات الخارجية في الخلايا اللمفاوية من النسب أو الخلايا الجذعية الجنينية 6،7. الحل لبقصور المروجين الفيروسي هو استخدام قوي التأسيسي المروجين غير الفيروسية 8-10. واحد يتميز جيدا المروج غير الفيروسية التأسيسي قوي المنشأ البشري هو عامل استطالة 1α (hEF1α) المروج (تشارك hEF1α في الحفز للجمعية التي تعتمد على GTP من أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال لريبوسوم 11). ومع ذلك،ناقلات التعبير التي تحتوي على مروج hEF1α ليست كما المتاحة على نطاق واسع للمروج الفيروسي تحتوي على البلازميدات، وخاصة تلك التي تحتوي على أيضا 3 × FLAG في نهاية محطة الأمينية من البروتين من الفائدة.

وتشارك 64،000 ميغاواط بروتين عامل تحفيز الانقسام (CstF-64) في 3 "معالجة نهاية معظم من mRNAs 12،13، بما في ذلك تعتمد على التكرار من mRNAs هيستون 14،15. وأعرب عن CstF-64 في جميع الأنسجة الجسمية 12. في عزر الاعتراف RNA بربط سلاسل RNA GU الغنية على محاضر الوليدة المصب للانشقاق وتذييل بعديد الأدينيلات الموقع 16. هذا الربط من CstF-64 إلى ما قبل مرنا يعزز الانقسام endonucleolytic كفاءة نص الناشئ.

هنا، يتم وصف بروتوكول يستخدم PCR التضخيم من شظايا الحمض النووي، وهو جيبسون عدة التجمع الاستنساخ (والذي يتضمن الخلايا البكتيرية المختصة كيميائيا) لإنتاج ناقلات مخصصة ل3xFLAG الموسومة م[أوس] CstF-64 أو متحولة CstF-64 إلى الأمينية نهاية طرفية في ظل تعبير عن hEF1α المروج 1.

Protocol

1. في السيليكون تصميم من البلازميد والجيل من الاشعال تداخل

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو تجميع كامل تسلسل النوكليوتيدات من بناء وتصميم الاشعال لاستخدامها لتوليد شظايا متداخلة مع نهايات لGA الاستنساخ.

  1. تصميم تسلسل النوكليوتيدات المستمر لتمثيل البلازميد النهائي.
  2. الحصول على أو سرد البلازميدات الفعلية وشظايا الحمض النووي التي سيتم استخدامها كقوالب في PCR.
    ويمكن أن يؤمر بمثابة شظايا واحد أو عدة الاصطناعية المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (sDNA) - شظايا الحمض النووي التي لا تتوفر بسهولة - مثل مجموعة مختلفة من العلامات والمروجين: ملاحظة. وهذه الشظايا المتاحة تجاريا بتكلفة منخفضة نسبيا، ويمكن أن تصل إلى 2 كيلو بايت في الطول (انظر جدول المواد).
  3. تقسيم تسلسل النوكليوتيدات المستمر لبناء تجميعها في الخطوة 1.1 إلى شظايا الحمض النووي مناسبة لPCR. Confirم أن شظايا تطابق البلازميدات المتاحة وشظايا sDNA. تجنب DNA أجزاء أصغر من 200 الإقليم الشمالي.
  4. الوصول إلى الجيل الأداة التمهيدي (انظر الجدول المعدات). حدد القائمة "تعيين تفضيلات". اختيار الإعدادات المناسبة من خلال النقر على "بادئات أختر" في علامة التبويب "تغيير إعدادات الجمعية جيبسون" نافذة منبثقة.
    ملاحظة: يمكن أيضا تصميم التمهيدي أن يؤديها من دون استخدام الجيل الأداة التمهيدي. ومع ذلك، فإن استخدام الجيل الأداة التمهيدي يبسط العملية.
  5. البدء في بناء بناء عن طريق اختيار "بناء تعبيد" القائمة. إدراج شظايا الحمض النووي انقسام في التمهيدي بالتتابع الجيل أداة من 5 'إلى نهاية 3'.
    ملاحظة: جزء DNA تستخدم العمود الفقري البلازميد ويمكن تقسيم ملائم إلى قطعتين. في المنتج النهائي PCR ترتبط 5 'نهاية هذا الجزء الأول و3' نهاية الجزء الأخير معا في واحدة DN المستمروهناك جزء تمثل العمود الفقري النواقل.
  6. لصق جزء DNA الأول تمثل 5 'نهاية DNA ناقلات في شكل FASTA (تمثيل يستند إلى نص من تسلسل النوكليوتيدات) في "أدخل المتجهات أو إدراج مقطع" نافذة منبثقة. تسمية جزء DNA. اختيار الطريقة المناسبة للحصول على جزء DNA، إما PCR، RE دايجست أو التجميعي. انقر فوق علامة التبويب "متابعة".
  7. إذا كانت هناك حاجة لإضافة النيوكليوتيدات إضافية / مواقع تقييد عند تقاطع للبناء النهائي استخدام مساحات "FWD أو القس التمهيدي الفاصل" المنصوص عليها في "إضافة جزء الإدراج إلى التجمع" النافذة. إضافة النيوكليوتيدات إضافية / مواقع تقييد واحد فقط من شظايا الحمض النووي وليس على كل من شظايا. انقر على "تم" علامة التبويب.
  8. أكرر للجميع من شظايا حتى اكتمال بناء. حدد القائمة "عرض الاشعال" وإعادة النظر في تسلسل التمهيدي.
  9. أكرر للجميع يبني (ناقلات بackbones وإدراج)، أو للشظايا الحمض النووي التي تختلف.

2. التضخيم من شظايا الحمض النووي عن طريق PCR عن طريق حار البدء التدقيق DNA البلمرة (2X ميكس ماجستير)

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو الحصول على DNA كافية للتفاعل التجمع باستخدام PCR.

  1. شراء الاشعال PCR مصمم في الخطوة السابقة عن المنتجات المحلاة وعلى أصغر نطاق ممكن. تمييع لهم إلى 10 ميكرومتر في الماء أو TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9، 1 ملم EDTA).
  2. شراء شظايا الحمض النووي التي لا تتوفر بسهولة كأجزاء sDNA.
  3. تمييع كل شظايا الحمض النووي، بما في ذلك أجزاء sDNA التي سيتم استخدامها كقوالب للتقارير إنجاز المشروعات إلى 1 نانوغرام / ميكرولتر في الماء.
  4. تجميع ردود الفعل PCR في درجة حرارة الغرفة. لفترة وجيزة، واستخدام 2.5 ميكرولتر (من 10 ميكرومتر حل الأسهم) من كل التمهيدي الخاص بكل من الزوج التمهيدي (1)، ميكرولتر (من 1 نانوغرام / ميكرولتر حل الأسهم) من جزء DNA القالب، 25 μلتر من بداية ساخنة تصحيح التجارب المطبعية البلمرة DNA (الحمض النووي بول، 2X مزيج الرئيسي؛ انظر جدول المواد) و 19 ميكرولتر المياه. مزيج من أنبوب من قبل عبها لطيف وجمع قطرات سائلة بواسطة الطرد المركزي وجيزة.
  5. تضخيم في وقت واحد في أنابيب منفصلة شظايا الحمض النووي مشابهة من حيث الحجم وفقا لتوصيات لبول DNA. أداء 25-28 دورات PCR أو تحديد عدد الدورات التي تنتج غلة كافية DNA.
  6. تشغيل 10٪ من حجم رد الفعل PCR (5 ميكرولتر) على معيار الاغاروز الكهربائي هلام ملطخة إيثيديوم بروميد (0.2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي). تأكد من أن الفرقة DNA واحدة تمثل المنتج PCR مرئيا. تحديد حجم وكمية النسبي للشظايا الحمض النووي DNA باستخدام معايير الوزن الجزيئي. إذا لزم الأمر، كرر PCR للحصول على كمية كافية من شظايا الحمض النووي.

3. DpnI الهضم من المنتجات PCR

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو digeالحادي بلازميد المتبقية قالب DNA من تقارير إنجاز المشروعات في القسم 2. DpnI سوف هضم DNA البلازميد إلا إذا كان ميثليته، مثلما يحدث لالبلازميد الحمض النووي التي تزرع في سد + السلالات البكتيرية. ولذلك، لا تعامل مع DpnI إذا كان سيتم استخدام البلازميد الحمض النووي DNA كما شظية في رد فعل GA.

  1. إضافة 2 ميكرولتر من DpnI انزيم التقييد إلى 45 ميكرولتر من المنتجات PCR المنتجة في القسم 2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. المضي قدما في القسم 4 أو التجميد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.

4. تنقية وتركيز من شظايا الحمض النووي DNA على تنقية الخرز المغناطيسي

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو لتنقية وتركيز المنتجات PCR تم الحصول عليها في أقسام 2 و 3. طرق تنقية PCR أخرى يمكن أن تستخدم أيضا.

  1. تتوازن تنقية DNA حبات مغناطيسية إلى درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الخرز من قبل vortexing وجيزة.
  2. نقل تقارير إنجاز المشروعات واي قبل هضمهاال DpnI إلى 1.5 مل أنابيب وإضافة 81 ميكرولتر من تنقية DNA حبات مغناطيسية إلى كل أنبوب. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  3. وضع أنابيب على جامع المغناطيسي لحوالي 2 دقيقة. تجاهل واضح السائل باستخدام ماصة. غسل مرتين مع 200 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية.
  4. السماح للالكريات لتجف. إبقاء غطاء من الأنابيب مفتوحة، مع أنابيب المتمركزة على جامع المغناطيسي.
  5. إعادة تعليق الخرز المجففة في 10 ميكرولتر من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. تدور لفترة وجيزة لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنابيب.
  6. وضع أنابيب على جامع المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. إزالة 8،5 حتي 10 ميكرولتر من حل واضح ووضعه في أنبوب وصفت ما قبل الجديد. تحديد تركيز شظايا الحمض النووي عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول المعدات).

5. الجمعية الاستنساخ التفاعل والتحول من المنتجات في E. القولونية

<ص الطبقة = "jove_content"> ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو لحساب 3: 1 نسبة إدراج: ناقلات وتنفيذ رد فعل التجمع.

  1. استخدام لا يقل عن 100 نانوغرام من جزء DNA التي تمثل العمود الفقري ناقلات أو جزء DNA تحمل علامة انتقائية. حساب الفائض المولي 3 أضعاف عن شظايا الحمض النووي التي سيتم استخدامها كما تدرج.
  2. تحويل فائض المولي-NG في حاجة من كل إدراج معين.
    ملاحظة: هناك طريقة مريحة للقيام بهذه العمليات الحسابية هو استخدام التطبيق على شبكة الإنترنت (انظر الجدول المعدات).
  3. خلط كميات محسوبة من شظايا الحمض النووي في أنبوب PCR، وضبط مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي GA (2X، انظر جدول المواد). احتضان رد الفعل عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتجميع 4-6 شظايا أو 15 دقيقة لتجميع شظايا 2-3 في cycler الحرارية PCR.
  4. المضي قدما في التحول من المنتج التجميع في أكفاء E. القولونية أو تجميد المنتجات في -20° C، لحين الحاجة إليها.
  5. اتبع الإجراء التحول الذي يصاحب الخلايا المختصة الكهربائية الكيميائية أو. عادة، استخدام 2 ميكرولتر من رد فعل التجمع في رد فعل التحول.
  6. بعد التحول الكامل، ونشر الخلايا تحولت على لوحات أجار تستكمل مع المضادات الحيوية الانتقائية المناسبة.

6. البلازميد عزل، تقييد انزيم الهضم وتسلسلها

ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو عزل DNA البلازميد من E. القولونية، ثم التحقق من بناء طريق الهضم التقييد والتسلسل.

  1. نشر عدة مستعمرات واحدة لمحضرات صغيرة وبلازميد العزلة. بين عشية وضحاها LB ثقافة استخدام 2-5 مل السائلة تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة. عزل البلازميدات المقابلة باتباع الإجراء الموضح في عدة الإعدادية مصغرة الذي يتم استخدامه.
  2. تحديد كمية وتركيز البلازميدات تم الحصول عليها باستخدام الطيفمضواء.
  3. أداء تقييد الهضم مع واحد أو عدة نوكليازات الاقتطاع الداخلية إلى ~ 0.5 ميكروغرام من البلازميدات المنقى. استخدام أنزيمات التقييد التي توفر نمط متميز من الهضم مميزة ليبني DNA.
  4. تأكيد نجاح استنساخ الحمض النووي عن طريق تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات محددة أو القياسية. تحليل البيانات تسلسل للتأكد من دقتها.

Representative Results

ويرد سير العمل من البروتوكول الذي تم المتبعة في الشكل 2A. أردنا أن استنساخ CstF-64 ومتحولة CstF-64 بروتينات تنصهر ل3xFLAG العلامة تحت تنظيم التعبيري من hEF1α المروج (الشكل 2B) والشكل (3). كان البلازميد التي تحتوي على hEF1α تليها 3xFLAG العلامة غير متوفرة بالنسبة لنا. ومع ذلك، كانت البلازميدات التالية متوفرة: pcDNA 3.1 MYC-صاحب (A؛ هدية سخية من ميكايلا يانسن)، hEF1α تحتوي على البلازميد (هدية سخية من ملادن Yovchev) والفأرة CstF-64 البلازميدات 12 (الشكل 3). تم تجميع تسلسل كامل لبناء (ق) باستخدام تطبيقات النوكليوتيدات وتحرير النص (الشكل 3؛ انظر الجدول المعدات). وفي وقت لاحق، تم تقسيم تسلسل (ق) في أربع قطع مريحة (الشكل 2B، وكتل حمراء والشكل 3) المقابلة لالسلطات الوطنية المعينة بلازميد المتاحة. التضخيم صوقد صممت rimers باستخدام الجيل التمهيدي أداة (انظر الجدول المعدات) مع قيود 4-6 شظايا مع الحد الأدنى من التداخل من 25 الإقليم الشمالي، التي أنشئت في "تغيير إعدادات الجمعية جيبسون" نافذة منبثقة. وأدرجت NheI وNOTI مواقع تقييد في تصميم التمهيدي لغرض تحديد البلازميدات تجميعها بشكل صحيح. يقع الموقع NheI في تسلسل التمهيدي بين pcDNA 3.1 و 5 'نهاية المروج hEF1α. يقع الموقع NOTI بعد توقف كودون (UGA) من CstF-64 وpcDNA 3.1 ناقلات العمود الفقري. على الهضم في وقت واحد مع كل من الانزيمات جزء DNA تتكون من hEF1α المروج، 3xFLAG وCstF-64 أو متحولة CstF-64 سيتم الافراج عنهم (انظر أدناه والشكل 2B). وقد أمر الاشعال في أصغر نطاق ممكن والمحلاة. الجزء الثاني من المروج hEF1α تحتوي على 3xFLAG العلامة DNA جزء (490 سنة مضت، الشكل 2B، الشكل 3) تم شراؤها باعتباره sDNA جزء واحد (قه ه جدول المواد). وتضخمت شظايا الحمض النووي المستخدمة في رد فعل التجمع باستخدام بول الحمض النووي (انظر الجدول من المواد). وتضخمت شظايا الحمض النووي من hEF1α المروج جزء 1، جزء 2 hEF1α المروج، كامل طول ومتحولة CstF-64 في وقت واحد في أنابيب منفصلة لمدة 28 دورات (الشكل 4A)، بناء على توصيات من المورد للبول DNA (انظر جدول المواد ، لكل تمسخ دورة كان 7 ثانية في 98 ° C، الصلب و 45 ثانية في 55 درجة مئوية، واستطالة 90 ثانية في 72 ° C). في البداية، تم تضخيمه العمود الفقري pcDNA 3.1 لمدة 22 دورات (باستخدام نفس الشروط المذكورة أعلاه باستثناء الوقت استطالة، والتي كان من المقرر ان 3 دقائق عند 72 ° C). ومع ذلك، كان العائد DNA الناتجة لا يكفي لاستخدامها في رد فعل التجمع (الشكل 4A). ولذلك، تم إجراء تضخيم إضافي للحصول على DNA كافية.

المنتجات PCR الحصول علىيجب أن يتم هضمها إد من قالب البلازميد مع DpnI انزيم التقييد لإزالة DNA البلازميد، والتي لولاها تلوث الناجم المنتجات رد فعل التجمع وسوف تنتج المستعمرات إيجابية كاذبة المقاوم للأدوية البكتيرية. ولذلك، تم هضم منتجات PCR مع DpnI تقييد الانزيم، الذي يشق DNA البلازميد مميثل ونصفي ميثليته عزل من سد + E. سلالات القولونية. المنتجات PCR تم الحصول عليها باستخدام شظايا الحمض النووي الاصطناعية، كقوالب لا تحتاج إلى أن يتفاعل مع DpnI منذ DNA تصنيعه كيميائيا لا تحتوي على قواعد مميثل أو نصفي ميثليته.

وتنقيته شظايا الحمض النووي وتتركز على تنقية DNA حبات مغناطيسية (انظر جدول المواد) كما هو موضح في الخطوة بروتوكول 4. تم الجمع بين تقارير إتمام المشروعات لpcDNA 3.1 ناقلات العمود الفقري معا وتم تعديل مبلغ تنقية DNA حبات مغناطيسية تستخدم وفقا لذلك. تم تحديد العائد DNAباستخدام مقياس الطيف الضوئي (الجدول 1 والجدول المعدات). تم تجميع ردود الفعل التجمع من أجل CstF-64 ومتحولة CstF-64 يبني على الجليد (الجدول 1). تم استخدام فائض المولي 3 أضعاف من شظايا الحمض النووي تعتبر "إدراج" (الجدول 1، الشكل 3). تم تعديل الحجم النهائي من شظايا الحمض النووي مختلطة إلى 10 ميكرولتر مع الماء و10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي التجمع (2X) وأضيف. كانت مختلطة ردود الفعل وحضنت عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تم تجميع رد فعل السيطرة إيجابي أيضا وفقا لتوصية دليل عدة GA وحضنت في وقت واحد مع CstF-64 ومتحولة CstF-64 ردود الفعل. على النحو الموصى به في البروتوكول، تم تحويل 2 ميكرولتر من كل من ردود الفعل التجميع في E. المختصة كيميائيا زودت القولونية مع عدة التجمع الاستنساخ (انظر جدول المواد). وقد أجريت عملية التحول من كما هو موضح في عدةدليل. تم اختيار الحيوانات المستنسخة إيجابية على الأمبيسلين أجار لوحات / LB. وقد تم اختيار 6 المستعمرات في كل رد فعل التجمع بشكل عشوائي ليتم نشرها. تم عزل البلازميد السلطات الوطنية المعينة باستخدام طقم مصغرة بلازميد العزلة (انظر جدول المواد). وفي سيليكون والهضم من يبني مع تقييد الانزيمات أدى NheI ونوتي في اثنين من شظايا بأحجام من 4،590 سنة مضت، 3،032 شركة بريتيش بتروليوم لCstF-64 و 4،590 سنة مضت، 2،711 بي بي لمتحولة CstF-64 (الشكل 2B) والشكل (4B). الهضم مع تقييد الانزيمات أدى HindIII ونوتي في ثلاثة أجزاء مع الأحجام التالية: 5،872 سنة مضت، 1005 سنة مضت، و745 سنة مضت (CstF-64) و5،872 سنة مضت، 1005 سنة مضت، و 424 سنة مضت (متحولة CstF-64، والشكل 2B الشكل 4C). في الواقع، والهضم من البلازميدات معزولة عرض أنماط مميزة المتوقع (الشكل 4B، C). لاحظ أن جزء DNA 424 شركة بريتيش بتروليوم التي تنتجها الهضم مع HindIII وNOTI من متحولة CstF-64اتسخت البلازميدات على الشكل 4C ضعيفة نظرا لصغر حجمها. تم إرسال 2 من 6 البلازميدات معزولة عن التسلسل. نحن التسلسل المروج hEF1α، وCstF-64 أو متحولة CstF-64 أجزاء من يبني للتحقق من عدم وجود الحذف، الإدراج أو بدائل. ونحن نوصي بشدة تسلسل يبني DNA الناتجة عن هذا أو أي بروتوكول PCR القائم. أظهر تسلسل أن واحدا من كل بلازميد التسلسل الوارد تسلسل المتوقع في منطقة hEF1α، 3xFLAG العلامة وCstF-64 أو متحولة CstF-64. كل من البلازميدات أخرى كان طفرة نقطة أدخلت خلال التضخيم من جزء DNA المقابل. التعبير عن البلازميد التي تحتوي على CstF-64 في الخلايا الجذعية الجنينية، أنتجت كمية وفيرة من البروتين خارجي مشابه لنوع البرية التعبير 17.

الشكل (1)
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لآلية الجمعية جيبسون. شظايا الحمض النووي مع التداخل نهايات تم تجميع isothermally في تسلسل مستمر واحد. تداخل ينتهي أولا ويمضغ الظهر بنسبة 5 "نوكلياز خارجية، والتي هي الحرارة تدريجيا المعطل. وبالتالي، فإن شظايا الحمض النووي مع نهايات مختلفة متداخلة يصلب isothermally. سوف البلمرة DNA في ملء الفجوات ويغاز DNA بالحرارة ligates النكات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. (A) مخطط انسيابي للبروتوكول وصفها لتجميع الاستنساخ. (ب) تمثيل البلازميد، PGA-CstF-64 تم إنشاؤها باستخدام GA عدة الأحمر - شظايا الحمض النووي المستخدمة في رد فعل التجمع: pcDNA3.1؛ hEF1α المروج جزء 1 (hEF1a - 1)؛ hEF1α المروج جزء 2 (hEF1a - 2) أمر باعتباره DNA الاصطناعية. الماوس CstF-64 (mCstF-64). الزرقاء - إطارات القراءة المفتوحة. البنفسجي - المروجين الفيروسية وغير الفيروسية. الخضراء - انشقاق وتذييل بعديد الأدينيلات المناطق الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
وتمثل الشكل 3. تصميم وتركيب جبسون CstF-64 البلازميد. الأسود صناديق شظايا الحمض النووي التي كانت متاحة لتصميم جيبسون التجمع واحد CstF-64 في تسلسل سيليكون. وفي وقت لاحق، تم تقسيم تسلسل في أربع قطع DNA، والتي تم تضخيمها من قبل PCR. ملاحظة أنه نظرا لصغر حجم 3xFLAG العلامة صمم تسلسل باعتباره sDNA جنبا إلى جنب مع العلاقات العامة hEF1α جزء omoter 2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
بداية ساخنة باستخدام عالية الدقة مزيج الرئيسي 2x لشظايا الحمض النووي المستخدمة في ردود الفعل التجمع الشكل 4. PCR من شظايا الحمض النووي المستخدمة في الاستنساخ وردود الفعل التمثيلي الهضم انزيم التقييد من البلازميدات التي تم الحصول عليها (A) تقارير إنجاز المشروعات التمثيلية: (B) الممثل. البلازميدات من hEF1α، كامل طول CstF-64، pcDNA 3.1 بناء (PGA-CstF-64) وhEF1α، متحولة CstF-64، pcDNA 3.1 بناء (PGA-mutCstF-64) يتفاعل مع NheI وNOTI. (C) نفس البلازميدات كما في B هضمها مع HindIII وNOTI الانزيمات."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم شظايا الحمض النووي حجم المتوقعة (بي بي) Concn. (نانوغرام / ميكرولتر) المخفف إلى (نانوغرام / ميكرولتر) ميكرولتر المستخدمة في GA CstF-64 من المخفف ميكرولتر المستخدمة في GA mutCstF-64، من المخفف نسبة المولي (الإضافية: مركزنا)
pcDNA 3.1 (ناقلات) 4،618 158 مخفف 1 1
hEF1_ المروج جزء 1 825 213 75 1 1 3: 1
hEF1_ المروج جزء 2 لCstF-64 516 229 50 1 3: 1
Cstf-64 1،796 161 مخفف 1 3: 1
hEF1_ المروج جزء 2 لمتحولة CstF-64 516 199 50 1 3: 1
متحولة CstF-64 1،448 201 171 1 3: 1

الجدول 1. العائد من شظايا الحمض النووي بعد التركيز على حبات مغناطيسية، تخفيف واقامة ردود الفعل التجمع.

Discussion

الاستخدام الناجح للGA الاستنساخ ينبغي أن يسبق دائما إلى تصميم دقيق للبناء كاملة (الشكل 2 والشكل 3).

ينصح التحقق دقيق لتسلسل التمهيدي التي صممها جيل الأداة التمهيدي أيضا إلى حد كبير. قد يتم إنشاء الاشعال لGA دون استخدام الجيل الأداة التمهيدي. ومع ذلك، استخدام الأداة هو التوصية للغاية، لأنه يبسط عملية. عموما، يجب أن يكون التمهيدي لGA استنساخ اثنين من سلاسل مختلفة وظيفيا. تسلسل الحمض النووي الأول هو تفتيت محددة، ويسمح للالتضخيم من شظية باستخدام PCR. تسلسل الثاني يتداخل مع جزء المجاور، وهو أمر ضروري لGA التجمع. ومن شأن تسلسل الحمض النووي جزء معين نموذجي يكون 18-22 الإقليم الشمالي في الطول. يجب تسلسل الحمض النووي جزء محددة تستخدم لتضخيم DNA نفسه يكون درجات الحرارة ذوبان مماثلة والمحتوى GC. وينبغي أن يكون تسلسل متداخلة على الأقل من 15الإقليم الشمالي في الطول مع درجة حرارة انصهار لا يقل عن 48 ° C. سوف تجميع أكثر من 4 شظايا الحمض النووي تتطلب تسلسل تداخل أن تكون على الأقل 20 الإقليم الشمالي. سوف التداخل أطول تسمح خصوصية زيادة من الصلب مما أدى إلى شظايا الحمض النووي تجميعها أكثر بشكل صحيح. فمن المستحسن لتجنب متواليات التي تميل في GC أو AT المحتوى في تطوير متواليات متداخلة، لأن تسلسل منحرفة قد بخرق التجمع DNA الصحيح.

نقترح أيضا باستخدام كعنصر تحكم السلبية، التي لا ينبغي أن تنتج أي المستعمرات البكتيرية المقاومة للأدوية، مجرد جزء DNA الموافق العمود الفقري ناقلات في رد فعل GA. بدلا من ذلك، واحدة من شظايا الحمض النووي التي تضم "إدراج" قد حذفت من رد فعل GA، والتي ينبغي أن يؤدي أيضا إلى أي المستعمرات البكتيرية المقاومة للعقاقير. السبب لن تنمو المستعمرات سيكون عدم وجود نهايات متداخلة من شظايا الحمض النووي المجاورة، والتي سوف تجعل التجمع من مجمعات للبلازميد مؤسسة التدريب الأوروبية.

في وصف البروتوكول، وتداخل متواليات من 25 الإقليم الشمالي لتوليد استخدمت مجموعات التمهيدي، نظرا لوجود عدد من شظايا الحمض النووي المستخدمة (الشكل 3). على توصية من أداة موقع الجيل التمهيدي (انظر الجدول المعدات) هو استخدام لا يقل عن 20 متواليات متداخلة الإقليم الشمالي لتجميع 4-6 شظايا الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يعد تداخل تسلسل وضمان تكامل السليم للحمض النووي (انظر الشكل 1) زيادة عدد المنتجات تجميعها بدقة.

حاليا، تتوفر عدة نظم لاستنساخ سلس. ومع ذلك، فإن بعض هذه النظم لا تزال تستخدم أنزيمات التقييد (أي، جولدن جيت استنساخ 18). ويستخدم آخرون يمزج الملكية من الانزيمات بناء على فيروس اللقاحية البلمرة DNA واحدة حبلا الحمض النووي ملزمة البروتين من نفس المصدر البيولوجي 19. كلا النظامين تقتصر بالمقارنة مع GA قبل شورطول ثالثا تداخل متواليات. لأن تسلسل متداخلة أقصر قد لا توفر خصوصية كافية لالخطوة الصلب من شظايا الحمض النووي المجاورة، مما يجعل التجمع السليم لأكثر من 23 شظايا الحمض النووي إشكالية. هذه العيوب ليست موجودة في نظام GA.

وينبغي النظر في حجم شظايا الحمض النووي ليتم تضخيمها أيضا حتى لا يتجاوز حجم amplifiable موثوق بواسطة PCR (أي أقل من 8 KBP في الطول). حتى مع تحسن في وظيفة بلمرة DNA في السنوات ال 10 الماضية، وسوف تتضخم شظايا الحمض النووي كبيرة مع أقل كفاءة ودقة. إذا لزم الأمر، يمكن الحصول على شظايا الحمض النووي أكبر من مصادر أخرى بديلة لPCR، على سبيل المثال، من خلال عزل البلازميد والهضم DNA المناسب مع الانزيمات قيود. على وجه التحديد، لبروتوكول موضح في مخطوطة الحالية، لدينا عقلانية لاستخدام PCR واستند على حجم شظايا الحمض النووي المتاحة، التي كانت كلها أقل من5 KBP. إذا كان هناك أكثر من منتج واحد PCR التي حددها الاغاروز الكهربائي للهلام، ويوصى هلام تنقية حجم جزء المرغوب فيه باستخدام أي من تقنيات البيولوجيا الجزيئية المتاحة أو مجموعات المناسبة. في البروتوكول الحالي يتم استخدام البلمرة DNA بالحرارة (انظر جدول المواد). لكن أي البلمرة DNA توفير الدقة العالية والعائد سوف تكون مناسبة ليتم استخدامها مع هذا البروتوكول. إذا عالية الدقة بلمرة DNA مختلفة من وصفها في البروتوكول متوفرة، استخدم إعداد الشروط كما هو موضح في كتيبات منها. في البروتوكول الحالي، E. المختصة كيميائيا وتستخدم خلايا القولونية التي يتم توفيرها مع عدة GA. بدلا من ذلك، الكهربائية المختصة كيميائيا أو E. سلالات القولونية مثل DH5α أو DH10B يمكن استخدامها.

الجمعية استنساخ مزيج الرئيسي 2X سهل الاستخدام مع الحد الأدنى من التدريب العملي في الوقت المحدد. ومع ذلك، مطلوب pipetting لدقيقة بسبب كميات صغيرة شمال شرقeded إلى أن تكون مختلطة معا. تحتاج جيدة تقنية البيولوجيا الجزيئية إلى أن تمارس في كل الأوقات أيضا.

استنساخ GA يوفر إمكانيات غير محدودة لبناء شظايا الحمض النووي، والبلازميدات وناقلات، والتي هي أطول من 3 KBP في الحجم. وبالإضافة إلى ذلك فإن لها تأثيرا أوسع في مجال البيولوجيا الاصطناعية، لأنه يسمح تركيب وتجميع، على سبيل المثال، البكتيري (الفطرانية الميكوبلازما) الجينوم بأكمله أو الخميرة (خميرة الخباز) كروموسوم 20،21. تقنية ينطبق أيضا على الاستنساخ التقليدية يحتاج لتوليد بنيات سلس.

وفي الختام، GA الاستنساخ يوفر بديلا سريعا وموثوقة ومرنة لإجراء استنساخ الحمض النووي التقليدي.

Acknowledgments

ونود أن نشكر ميكايلا يانسن في مركز جامعة تكساس للتكنولوجيا العلوم الصحية، لوبوك، تكساس، وملادن Yovchev في جامعة بيتسبرغ المركز الطبي، بيتسبرغ، PA لتوفير بسخاء pcDNA 3.1 MYC-صاحب (A) وhEF1α المروج التي تحتوي على البلازميدات . وأيد البحوث ورد في هذه النشرة من قبل كينيدي شرايفر المعهد الوطني يونيس لصحة الطفل والتنمية البشرية من المعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة عدد R01HD037109 (لCCM). كان دعم إضافي من معهد لورا بوش لصحة المرأة (لCCM وPNG). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) Integrated DNA Technologies We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.
DNA purification magnetic beads Beckman Coulter A63880 Agencourt AMPure XP - PCR Purification system
Plasmid Isolation Mini Kit Omega Bio-Tek Inc D6942-01 E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I
Gibson Assembly Cloning Kit New England BioLabs E5510S
DNA polymerase New England BioLabs M0494S Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix
DpnI New England BioLabs R0176S
NheI New England BioLabs R3131S
NotI New England BioLabs R3189S
HindIII New England BioLabs R3104S
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop device
EditSeq DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
SeqBuilder DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
Word Microsoft Part of Microsoft Office
NEBuilder New England BioLabs primer generation tool: http://nebuilder.neb.com
NEBioCalculator New England BioLabs ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
  2. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
  3. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
  4. Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
  5. Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
  6. Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
  7. Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
  8. Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
  9. Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
  10. Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
  11. Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
  12. Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
  13. MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
  14. Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
  15. Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
  16. Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
  17. Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
  18. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
  19. Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
  20. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
  21. Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 96، EF1α الإنسان، المروج، SV40 المروج، CMV المروج، جيبسون التجمع، والخلايا الجذعية الجنينية، والبروتين التعبير، وسم فلاج، البيولوجيا التركيبية
جيل من البلازميد ناقلات معربا عن بروتينات الموسومة FLAG تحت تنظيم الاستطالة الإنسان عامل-1α المروج عن طريق الجمعية جيبسون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C.… More

Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1α Promoter Using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235, doi:10.3791/52235 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter