Abstract
Гибсон в сборе (GA) клонирование предлагает быстрый, надежный и гибкую альтернативу традиционным методам клонирования ДНК. Мы использовали GA, чтобы создать индивидуальные плазмиды для экспрессии экзогенных генов в мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). Выражение экзогенных генов под контролем промоторов SV40 или цитомегаловируса человека быстро уменьшается после трансфекции в mESCs. Средство для этого уменьшенного выражения использовать человеческий фактор элонгации-1 альфа (hEF1α) промотор для управления экспрессией гена. Плазмидные векторы, содержащие hEF1α не так широко доступны, как SV40- или ЦМВ, содержащие плазмиды, особенно те, содержащих также N-концевых 3xFLAG-тегов. Протокол, описанный здесь метод ускоренного создания плазмиды, экспрессирующие FLAG-меченого CstF-64 и CstF-64 мутант под экспрессивного регулирования промотора hEF1α. А. использует смесь экзонуклеазы ДНК, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы, чтобы клонирование перекрытия концы фрагментов ДНК возможных.На основе шаблона ДНК мы имели в наличии, мы разработали наши конструкции должны быть собраны в одной последовательности. Наш дизайн используется четыре фрагмента ДНК: pcDNA 3,1 вектор позвоночника, hEF1α промоутер часть 1, hEF1α промоутер часть 2 (в котором содержится 3xFLAG-тег, закупаемые в качестве синтетического фрагмента двухцепочечной ДНК), и либо CstF-64 или конкретных CstF-64 мутант. Последовательности этих фрагментов были загружены в генерации инструмента праймера для разработки соответствующих ПЦР-праймеров для генерации фрагментов ДНК. После ПЦР ДНК-фрагменты смешивали с вектором, содержащим селективный маркер и реакцию клонирования GA была собрана. Плазмиды из отдельных трансформированных бактериальных колоний были выделены. Начальный экран плазмид было сделано рестрикцией, а затем путем секвенирования. В заключение, GA позволили нам создать индивидуальные плазмиды для экспрессии генов в 5 дней, в том числе построить экраны и проверки.
Introduction
Обычные процедуры клонирования ДНК, основаны на использовании ферментов рестрикции расщеплять ДНК и ДНК-лигазы для соединения фрагментов ДНК друг с другом. Генерация пользовательских экспрессирующие конструкции, содержащие различные фрагменты ДНК является последовательная процедура, которая включает расщепление ДНК с одним и / или нескольких рестрикционных эндонуклеаз и последующей вставки ДНК фрагментов через лигирования. Основным недостатком этой процедуры является то, что подходящие ферменты рестрикции для одного из фрагментов ДНК может быть трудно определить (т.е., может иметь несколько сайтов расщепления) оказание успешном клонировании ДНК полной длины, представляющего интерес белка невозможно. Таким образом, поколение пользовательского выражения строит под регуляции транскрипции типоспецифических промоутеров эффективной камеры с настраиваемыми белка-тегов требует очень тщательной проработки. Это также времени и трудоемкая техника. В последнее время несколько сообщений описано методологии, чтобы собрать MULTIPле различные фрагменты синтетической ДНК в непрерывной последовательности, в то же время ни в одном одно- или двухступенчатых реакций без использования ферментов рестрикции 1-3. Один шаг клонирования реакции (за исключением все подготовительные шаги), в зависимости от использования смеси экзонуклеазы ДНК, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы 2,3 и перекрывающиеся концы фрагментов ДНК (рисунок 1). Поскольку нет использование ферментов рестрикции, ДНК-фрагменты любого размера и состава последовательностей (за исключением высокой повторяющихся последовательностей) могут быть слиты вместе в бесшовной конструкции. Недавно коммерческого набора (Gibson сборка; GA) для одноступенчатых клонирования реакций стали доступны. Этот комплект позволяет быстро и экономически эффективной сборки любых фрагментов ДНК в одном векторе с настраиваемыми промоутеров и белковых меток.
Широко доступные векторы экспрессии плазмиды, используемые для экспрессии экзогенных белков в млекопитающих моделей клеточных культур часто находятся под транскрипции облавляет вирусного цитомегаловирус (ЦМВ) или обезьяньего вируса 40 (SV40) промоутеров. Эти вирусные промоторы обеспечивают надежную временную экспрессию экзогенных белков в большинстве млекопитающих моделей, основанных на клеточных культурах. Тем не менее, образование клеточных линий, стабильно экспрессирующих экзогенных белков часто безуспешными из-транскрипционного молчания в CMV или SV40 промоторы в процессе установления 4,5. Кроме того, SV40 и вирусные промоторы CMV не будет в достаточной степени способствуют экспрессии экзогенных белков в клетки из лимфоидной линии или эмбриональных стволовых клеток 6,7. Решение присущего ограничения вирусных промоторов использовать сильные учредительные без вирусные промоторы 8-10. Одним из хорошо характеризуется сильного конститутивного невирусных промотор человеческого происхождения является фактор элонгации 1α (hEF1α) промотор (hEF1α участвует в катализе GTP-зависимой ассоциации аминоацил-тРНК на рибосомах 11). Тем не менее,экспрессирующие векторы, содержащие промотор hEF1α не так широко доступны, как вирусного промотора, содержащего плазмиды, в особенности те, также содержащий 3 × флаг на концевой аминогруппой белка, представляющего интерес.
Коэффициент стимуляции расщепления 64000 МВт белка (CstF-64) принимает участие в конечной обработки 3'большинстве мРНК 12,13, включая репликации в зависимости от гистонов мРНК 14,15. CstF-64 экспрессируется во всех соматических тканей 12. Его мотив признания РНК связывается с ГУ-богатых последовательностей РНК на зарождающихся транскриптов ниже по течению от расщепления и полиаденилирования сайте 16. Это связывание CstF-64 к пре-мРНК способствует эффективному эндонуклеолитическим расщепление зарождающейся стенограмму.
Здесь протокол описан, который использует ПЦР-амплификации ДНК-фрагментов, Gibson сборки Cloning Kit (который включает в себя химически компетентных бактериальных клеток) для получения пользовательских векторов 3xFLAG-меченой мУЗ CstF-64 или мутант CstF-64 их амино-конце под выражением hEF1α промотора 1.
Protocol
1. В Silico Дизайн плазмиды и генерации перекрывающихся праймеров
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага заключается в сборке полную последовательность нуклеотидов конструкции и дизайна праймеры, которые будут использоваться для получения фрагментов с перекрывающимися концами для GA клонирования.
- Дизайн непрерывную последовательность нуклеотидов представлять окончательный плазмиды.
- Получить или список действительных плазмиды и фрагментов ДНК, которые будут использоваться в качестве матриц в ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: фрагменты ДНК, которые не являются легко доступными - таких, как различные комбинации тегов и промоутеров - можно заказать как одного или нескольких синтетических двухцепочечных фрагментов ДНК (sDNA). Эти фрагменты являются коммерчески доступны по относительно низкой цене и может быть до 2 кб в длину (табл материалов). - Разделить непрерывную нуклеотидную последовательность, в конструкции собранном на этапе 1,1 на фрагменты ДНК, пригодных для ПЦР. Confirм, что фрагменты соответствуют доступных плазмид и sDNA фрагменты. Избегайте фрагментов ДНК меньше, чем 200 NT.
- Доступ к функции праймера поколения (табл оборудования). Выберите меню "Настроить предпочтения". Выберите соответствующие настройки, нажав на вкладке «изменение привилегированные акции" в "Изменить настройки Гибсон Ассамблеи" во всплывающем окне.
Примечание: Праймер конструкции также могут быть выполнены без использования инструмента праймера поколения. Тем не менее, использование инструмента праймера поколения упрощает процесс. - Начало строительства конструкцию, выбрав в меню "Build Construct". Вставьте сплит фрагментов ДНК в инструмент для генерации последовательно грунтовки от 5 'к 3' концу.
ПРИМЕЧАНИЕ: фрагмент ДНК используется в качестве плазмиды позвоночника может быть удобно разделить на две части. В конечном продукте ПЦР-конец этого первого фрагмента и 3'5 конце последнего фрагмента связаны друг с другом в одном непрерывном DNФрагмент, представляющий вектор позвоночник. - Вставить первый фрагмент ДНК, представляющий 5'-конец вектора ДНК в формате FASTA (текстовый представления нуклеотидной последовательности) в поле "Введите вектора или вставки фрагмента" во всплывающем окне. Имя фрагмента ДНК. Выберите подходящий способ, чтобы получить фрагмент ДНК, как и ПЦР, RE Digest или синтеза. Перейдите на вкладку "Продолжить".
- Если есть необходимость добавить дополнительные нуклеотиды / сайты рестрикции на стыке конечной конструкции использовать "Вперед и Ред праймер спейсер" помещениях, в окне "добавить фрагмент вставки в сборку". Добавить дополнительные нуклеотиды / сайты рестрикции, чтобы только один из фрагментов ДНК, а не обоих фрагментов. Нажмите на "Готово" на вкладке.
- Повторите для всех фрагментов, пока конструкция не будет завершена. Выберите меню "Вид Грунтовки" и пересмотреть последовательности праймера.
- Повторите эти действия для всех конструкций (вектор Backbones и вставки) или фрагментов ДНК, которые отличаются.
2. Усиление фрагментов ДНК с помощью ПЦР с использованием Hot Start Корректирование ДНК-полимеразы (2x Master Mix)
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага для получения достаточной ДНК для реакции сборки с помощью ПЦР.
- Покупка праймеров для ПЦР, предназначенные на предыдущей стадии, в качестве обессоленной продуктов и в наименьшей возможной масштабе. Развести их до 10 мкм в воде или TE (10 мМ трис-HCl, рН 7,9, 1 мМ ЭДТА).
- Покупка фрагменты ДНК, которые не являются легкодоступными, как sDNA фрагментов.
- Развести все фрагменты ДНК, в том числе фрагментов sDNA, которые будут использоваться в качестве шаблонов для ПЦР до 1 нг / мкл в воде.
- Сборка ПЦР-реакций при комнатной температуре. Если коротко, то используют 2,5 мкл (от 10 мкМ исходного раствора) в каждой соответствующей грунтовки на пары праймеров, 1 мкл (от 1 нг / мкл основного раствора) фрагмента ДНК-матрицы, 25 μл горячего старта корректура ДНК-полимеразы (Pol ДНК; 2x Master Mix, см таблицу материалов) и 19 мкл воды. Смешайте трубки, осторожно стряхивая и собирать капельки жидкости быстрым центрифугированием.
- Усиливаются одновременно в отдельные пробирки ДНК фрагментов одинакового размера в соответствии с рекомендациями для Pol ДНК. Выполнение 25 - 28 циклов ПЦР или определения количества циклов, которые производят достаточный выход ДНК.
- Запуск 10% от объема реакционной ПЦР (5 мкл) на стандартной электрофореза в агарозном геле, окрашенном бромидом этидия (0,2 мкг / мл конечной концентрации). Убедитесь, что одна полоса ДНК, представляющая ПЦР-продукт видна. Определение размера и относительного количества фрагментов ДНК с использованием ДНК-стандарты молекулярной массы. При необходимости повторить ПЦР, чтобы получить достаточное количество фрагментов ДНК.
3. DpnI переваривания продуктов ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель данного этапа заключается в ПГЛПул остаточная плазмиды ДНК-матрицы с ПЦР в разделе 2. DpnI будет переварить ДНК плазмиды, только если он метилирован, как это происходит в ДНК плазмиды, выращенные в плотине + бактериальных штаммов. Таким образом, не лечат с DpnI плазмидной ДНК, если будет использоваться в качестве фрагмента ДНК в реакции GA.
- Добавить 2 мкл ограничительного фермента DpnI к 45 мкл ПЦР-продуктов, полученных в разделе 2. инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Перейдите к разделу 4 или заморозить при температуре -20 ° C до необходимости.
4. Очистка и Концентрирование ДНК-фрагменты более очистки ДНК магнитных шариков
Примечание: Целью данного этапа является, чтобы очистить и концентрировать ПЦР-продукты, полученные в разделах 2 и 3. Другие способы очистки ПЦР могут быть использованы также.
- Равновесие очистных ДНК магнитных шариков до комнатной температуры. Повторное приостановить бисером краткого интенсивного перемешивания.
- Трансфер ГКДЗ предварительно переваривается Wiго DpnI до 1,5 мл пробирки и добавить 81 мкл очистки ДНК магнитных шариков в каждую пробирку. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Место труб на магнитной коллектора около 2 мин. Откажитесь от прозрачной жидкости с помощью пипетки. Дважды промывали 200 мкл 80% -ного этанола в течение 30 сек.
- Разрешить гранулы для просушки. Удерживают крышку трубок открыт, с трубками, расположенными на магнитной коллектора.
- Повторное приостановить Высушенные гранулы в 10 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Кратко спина для сбора жидкости на дне пробирок.
- Поместите трубки на магнитной коллектора в течение 2 мин. Удалить 8,5 - 10 мкл прозрачного раствора и поместите его в новом предварительно помечены трубки. Определить концентрацию фрагментов ДНК с помощью УФ-спектроскопии (табл оборудования).
5. Ассамблея Клонирование Реакция и трансформация продукты в E. палочки
<P CLASS = "jove_content"> Примечание: Цель этого шага заключается в расчете 3: 1 соотношение вставки: векторные и проводить реакцию сборки.- Использование по меньшей мере, 100 нг фрагмента ДНК, представляющей вектор основу или фрагмент ДНК, несущий селективный маркер. Вычислить 3-кратного молярного избытка на ДНК-фрагментов, которые будут использоваться в качестве вставок.
- Преобразование молярной-Excess в нг нужно каждого конкретного вставки.
ПРИМЕЧАНИЕ: удобный способ сделать расчеты, чтобы использовать веб-приложения (табл оборудования). - Смешайте рассчитанного количества фрагментов ДНК в ПЦР-пробирку, отрегулируйте громкость до 10 мкл. Добавить 10 мкл мастер смеси ГА (2x, табл материалов). Инкубируйте реакции при 50 ° С в течение 1 часа для сборки 4 - 6 фрагментов или 15 мин для монтажа 2-3 фрагментов в ПЦР термоциклере.
- Продолжайте трансформации сборки изделия в компетентный E. палочка или заморозить продукты при -20° C, пока это необходимо.
- Выполните процедуру преобразования, которая сопровождает химические или электро компетентных клеток. Как правило, используют 2 мкл реакции сборки на реакцию превращения.
- После завершения преобразования, распространение трансформированных клеток на чашках с агаром с добавлением соответствующего селективного антибиотика.
6. плазмиды изоляции, рестриктазой и секвенирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага заключается в изоляции плазмиды ДНК из E. палочка, то проверить конструкцию рестрикцией и последовательности.
- Размножаются несколько отдельных колоний для мини Preps и выделения плазмид. Используйте 2-5 мл на ночь LB жидкая культура с добавлением соответствующего антибиотика. Изолировать соответствующие плазмиды в соответствии с методикой, описанной в мини-набора препаративной, который используется.
- Определить количество и концентрацию плазмиды, полученной с помощью Spectroфотометр.
- Выполнение рестрикционным расщеплением с одним или несколькими рестрикционными эндонуклеазами до ~ 0,5 мкг очищенных плазмид. Используйте ферментов рестрикции, которые обеспечивают четкую структуру пищеварения, характерные для ДНК-конструкций.
- Подтвердите ДНК для клонирования успеха путем секвенирования ДНК с использованием специфических или стандартные праймеры. Анализ данных секвенирования для точности.
Representative Results
Рабочий процесс протокола, который затем будет показано на рисунке 2А. Мы хотели, чтобы клонировать CstF-64 и мутантных CstF-64 белков, слитые с 3xFLAG тега под экспрессивного регулирования hEF1α промотор (рис 2B и рис 3). Плазмиды, содержащей hEF1α затем 3xFLAG-тега не был доступен для нас. Тем не менее, следующие плазмиды были доступны: pcDNA 3,1 Мус-His (; щедрый подарок от Микаэла Янсен), hEF1α содержащей плазмиды (щедрый подарок от Младен Йовчев) и мышь CstF-64 плазмиды 12 (Рисунок 3). Вся последовательность конструкции (ов) был собран с помощью приложений нуклеотидов и редактирование текста (рисунок 3, см таблицу оборудования). Впоследствии, последовательность (и) была разделена на четыре удобных штук (рис 2B, красных блоков и рис 3), соответствующих имеющимся плазмидных ДНК. Усиление рrimers были разработаны с использованием инструмента праймера поколения (табл оборудования) с ограничениями 4 - 6 фрагментов с минимальным перекрытием 25 нт, созданная в "Изменить параметры Гибсон Ассамблеи" во всплывающем окне. NheI и NotI сайты рестрикции были включены в подбор праймеров с целью выявления должным образом собранные плазмиды. Сайт NheI расположен в праймера последовательности между pcDNA 3,1 и 5 'конце промотора hEF1α. Сайт NotI находится после стоп-кодона (УЗА) из CstF-64 и pcDNA 3,1 векторного скелета. При одновременном пищеварения с обоих ферментов ДНК фрагмент, состоящий из hEF1α промотор, 3xFLAG и CstF-64 или мутантного CstF-64 будет выпущен (см ниже и 2В). Грунтовки были заказаны в наименьшей возможной масштабе и обессоливают. Вторая часть промотора, содержащего hEF1α 3xFLAG-тега фрагмента ДНК (490 п.н., 2В, рисунок 3) был приобретен в виде одного фрагмента (ов sDNAEE Таблица материалов). Фрагменты ДНК, используемые в реакции сборки амплифицировали с использованием ДНК-Pol (табл материалов). ДНК-фрагменты hEF1α промоутер части 1, hEF1α промоутер часть 2, полная длина и мутант CstF-64 были усилены одновременно в отдельные пробирки в течение 28 циклов (рис 4а), в соответствии с рекомендациями поставщика ГСМ ДНК (см таблицу материалов , для каждого цикла денатурации 7 сек при 98 ° С, отжиг 45 секунд при 55 ° С, удлинение 90 сек при 72 ° С). Первоначально pcDNA 3,1 основой амплифицировали в течение 22 циклов (с использованием тех же условий, что и выше, за исключением того времени элонгации, который был установлен в 3 мин при 72 ° С). Тем не менее, в результате чего выход ДНК не было достаточно, чтобы использовать в качестве монтажного реакции (фиг.4а). Таким образом, дополнительное усиление проводили, чтобы получить достаточную ДНК.
ПЦР-продукты получитьред из шаблона плазмиды должны быть расщепляли рестриктазой DpnI удалить плазмидной ДНК, которые в противном случае будут загрязнять полученную реакционную сборки изделий и производить ложного лекарственной устойчивостью бактериальных колоний. Таким образом, ПЦР-продукты расщепляли рестриктазой DpnI, который расщепляет метилированную и геми-метилированный плазмидной ДНК, выделенной из плотины + E. штаммы кишечной палочки. ПЦР-продукты получали с использованием синтетических фрагментов ДНК, как шаблоны не должны быть переваривали DpnI так химически синтезированной ДНК не содержит метилированные или геми-метилированных оснований.
Фрагменты ДНК очищают и концентрируют в течение очистки ДНК магнитных шариков (табл материалов), как описано в стадии протокола 4. ПЦР для pcDNA 3,1 векторного скелета были объединены вместе и количество очистки ДНК использовали магнитные шарики были соответствующим образом скорректированы. Выход ДНК определялис использованием спектрофотометра (Таблицы 1 и оборудования). Реакции по монтажу CstF-64 и мутантных CstF-64 конструкции были собраны на льду (Таблица 1). 3-кратный молярный избыток ДНК-фрагментов, рассматриваемых как "вставками" был использован (таблица 1, рисунок 3). Конечный объем смешанных фрагментов ДНК доводили до 10 мкл водой и 10 мкл добавляли мастер сборки смеси (2x). Реакции смешивали и инкубировали при 50 ° С в течение 1 часа. Положительная реакция управления также собраны в соответствии с рекомендацией комплект руководстве GA и инкубировали одновременно с CstF-64 реакций CstF-64 и мутантных. В соответствии с рекомендацией в протоколе, 2 мкл каждой из реакций сборки были преобразованы в химически компетентную E. палочка поставляется с монтажными набора для клонирования (таблица материалов). Превращение проводили, как описано в комплектеРуководство. Положительные клоны отбирали на чашках с ампициллином / LB пластинах. 6 колоний на каждой реакции сборки были выбраны случайным образом, чтобы размножить. Плазмида ДНК выделяли с использованием мини-набора выделения плазмид (табл материалов). В кремний переваривание конструкций рестриктазами NheI и NotI в результате двух фрагментов с размерами 4590 п.н., 3032 п.н. для CstF-64 и 4590 п.о., 2711 б.п. мутанта CstF-64 (рис 2B и рис 4б). Пищеварение рестриктазами HindIII и NotI в результате трех фрагментов со следующими размерами: 5872 б.п., 1005 б.п., а 745 б.п. (CstF-64) и 5872 б.п., 1005 б.п., а 424 б.п. (мутант CstF-64, 2В и фиг.4С). Действительно, пищеварение, изолированных плазмид отобразится ожидаемый характерные модели (рис 4, б). Следует отметить, что 424 п.о. фрагмент ДНК получают путем гидролиза с помощью HindIII и NotI в CstF-64 мутантаплазмиды на фигуре 4C слабо окрашенных из-за его небольшого размера. 2 из 6 изолированных плазмид были направлены для секвенирования. Мы упорядочили промотор hEF1α и CstF-64 или мутант CstF-64 части конструкций, чтобы убедиться, что нет делеции, вставки или замены. Мы рекомендуем секвенирование ДНК-конструкций в результате этого или любого ПЦР-протокола. Секвенирование показало, что один из каждой секвенировали плазмиды содержал ожидаемую последовательность в области hEF1α, 3xFLAG-тега и CstF-64 или мутантного CstF-64. Каждый из других плазмид имел точечную мутацию, введенные во время амплификации соответствующего фрагмента ДНК. Экспрессия плазмиды, содержащей CstF-64 в мышиных эмбриональных стволовых клетках, получают обильную количество экзогенного белка, сравнимую с дикого типа экспрессии 17.
Рисунок 1. Схематическое изображение механизма Gibson собрания. Фрагментов ДНК с перекрытием концов были изотермически собраны в одной непрерывной последовательности. Перекрытие концов первый жуют назад 5 "экзонуклеазы, который постепенно термоинактивированной. Следовательно, различные фрагменты ДНК с перекрытием концов будет отжигать изотермически. ДНК-полимераза будет заполнить пробелы и термостабильной ДНК-лигазы ligates ников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. (А) Блок-схема протокола описано для сборки клонирования. (B) Представление плазмиды, PGA-CstF-64 создан с помощью GA комплект красный - фрагменты ДНК, используемые в реакции сборки:. PcDNA3,1; hEF1α промоутер часть 1 (hEF1a - 1); hEF1α промоутер часть 2 (hEF1a - 2) заказать в качестве синтетической ДНК; мышь CstF-64 (mCstF-64). Blue - открытые рамки считывания. Фиолетовый - вирусные и не вирусные промоторы. Зеленый -. Расщепления и полиаденилирования регионы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Дизайн Гибсон сборки CstF-64 плазмиды. Черные ящики представляют собой фрагменты ДНК, которые были доступны для разработки единого узла Gibson CstF-64 в последовательности силикомарганца. Затем последовательность была разделена на четыре части ДНК, которые были амплифицированы с помощью ПЦР. Обратите внимание, что из-за небольшого размера 3xFLAG тегом последовательность была разработана в качестве sDNA вместе с ПР hEF1α omoter часть 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. ПЦР фрагментов ДНК, используемых в клонировании реакций и представительного ферментами рестрикции плазмид, полученных (А) Характерные ПЦР с использованием горячей начать высококачественный 2x основной смеси для фрагментов ДНК, используемых в реакции по сборке:. (Б) представитель плазмиды hEF1α, полная длина CstF-64, pcDNA 3,1 конструкт (PGA-CstF-64) и hEF1α, мутант CstF-64, pcDNA 3,1 конструкт (PGA-mutCstF-64) расщепляли NheI и NotI. (В) то же, что и в плазмиды B переваривали HindIII и NotI ферментов."_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
| Имя фрагментов ДНК | Ожидаемый размер (BP) | Concn. (Нг / мкл) | Разбавленный до (нг / мкл) | мкл используется в GA CstF-64 из разбавленных | мкл используется в GA mutCstF-64, из разбавленных | Молярное отношение (INS: VEC) |
| pcDNA 3.1 (вектор) | 4618 | 158 | неразбавленный | 1 | 1 | |
| hEF1_ промоутер часть 1 | 825 | 213 | 75 | 1 | 1 | 3: 1 |
| hEF1_ промоутер часть 2 для CstF-64 | 516 | 229 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| Cstf-64 | 1796 | 161 | неразбавленный | 1 | 3: 1 | |
| hEF1_ промоутер часть 2 для мутанта CstF-64 | 516 | 199 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| мутант CstF-64 | 1448 | 201 | 171 | 1 | 3: 1 |
Таблица 1. Выход из фрагментов ДНК после концентрации на магнитные шарики, разведения и настроить реакций сборки.
Discussion
Успешное использование Г.А. клонирования следует всегда предшествует тщательное проектирование полного конструкции (рис 2 и рис 3).
Тщательной проверки последовательности праймеров, разработанных с помощью инструмента грунтовки поколения также настоятельно рекомендуется. Праймеры для GA может быть сформирован без использования инструмента праймера поколения. Тем не менее, использование инструмента рекомендуем, потому что это упрощает процесс. Как правило, праймер для клонирования А. должны быть две функционально различные последовательности. Первая последовательность представляет собой ДНК-фрагмент конкретно, и позволяет амплификацию фрагмента с помощью ПЦР. Вторая последовательность перекрывается с соседним фрагментом, который является необходимым для GA сборки. Типичная последовательность ДНК-фрагмента конкретных бы 18-22 нуклеотидов в длину. Специфические последовательности ДНК-фрагмент, используемые для амплификации ДНК тот же должны иметь одинаковые температуры плавления и содержание GC. Перекрытие последовательность должна быть по крайней мере 15NT в длину с температурой плавления не менее 48 ° С. Сборка более 4 фрагментов ДНК потребует перекрытия последовательность, по крайней мере 20 нуклеотидов. Более длинные перекрытия позволит повышенную специфичность отжига, в результате чего более правильно собранных фрагментов ДНК. Рекомендуется, чтобы избежать последовательности, которые менялись в их GC или при содержании в разработке перекрывающихся последовательностей, так как перекос последовательности может поставить под угрозу качественную сборку ДНК.
Мы также предлагаем использовать в качестве отрицательного контроля, который не должен производить какие-либо лекарственной устойчивостью бактериальных колоний, только фрагмент ДНК, соответствующий векторной позвоночника в реакции GA. Кроме того, один из фрагментов ДНК, содержащих "вставки" может быть опущено из реакции А., который также должен привести к отсутствию устойчивых к лекарствам колоний бактерий. Причина не колонии не будет расти будет отсутствие перекрывающихся концах соседних фрагментов ДНК, которые будут оказывать сборку комплете плазмиды.
В протокол, описанный, перекрывая последовательности 25 нт для создания были использованы наборы праймеров, из-за количества фрагментов ДНК, используемых (рисунок 3). Рекомендация веб-сайте инструмента грунт поколения (табл оборудования) является использование по крайней мере, 20 нт перекрывающихся последовательностей, чтобы собрать 4 - 6 фрагментов ДНК. Кроме того, более длинной последовательности перекрытия будет обеспечивать надлежащее комплементацию из цепей ДНК (рис 1) увеличение числа точно собранных продуктов.
В настоящее время, несколько систем для бесшовных клонирования доступны. Тем не менее, некоторые из этих систем все еще используют ферменты рестрикции (т.е. Golden Gate клонирования 18). Другие используют собственные смеси ферментов на основе вируса коровьей оспы ДНК-полимеразы и одноцепочечной ДНК-связывающего белка из той же биологического источника 19. Обе системы ограничены по сравнению с ГА по ШоруДлина тер перекрывающихся последовательностей. Поскольку короткие перекрывающиеся последовательности не может обеспечить достаточную специфичность отжига стадии смежных фрагментов ДНК, что делает правильную сборку более 23 фрагментов ДНК проблематичным. Эти недостатки отсутствуют в системе GA.
Размер фрагментов ДНК, подлежащей амплификации, должны быть также рассмотрены, чтобы не превышать размер надежно укрупнения с помощью ПЦР (т.е. менее 8 кб в длину). Даже с улучшением функции ДНК-полимераз в течение последних 10 лет, большие ДНК-фрагменты будут усилены с меньшей эффективностью и точностью. При необходимости, более крупные фрагменты ДНК могут быть получены из других источников альтернативных ПЦР, например, путем выделения плазмид и соответствующего пищеварения ДНК ферментами рестрикции. В частности, для протокола, описанного в текущем рукописи, наш рационально использовать ПЦР в зависимости от размера имеющихся фрагментов ДНК, которые были все менее5 кб. Если есть более чем один продукт ПЦР идентифицированы с помощью электрофореза в агарозном геле, очистка гель желаемого размера фрагмента рекомендуется использовать любой из доступных методов молекулярной биологии или соответствующих наборов. В текущем протокола используется термостабильной ДНК-полимеразы (см таблицу материалов). Однако ни ДНК-полимераза обеспечивает высокую точность и выход будет пригоден для использования с этим протоколом. Если высококачественные ДНК-полимеразы отличается от описанного в протоколе имеются, использовать создать условия, как описано в соответствующих руководствах. В текущем протоколе, химически компетентную E. палочки клетки используются, что поставляются с комплектом GA. Кроме того, химически или электро компетентный E. штаммы кишечной палочки, такие как DH5 & alpha или DH10B могут быть использованы.
Сборка клонирования 2x основной смеси проста в использовании с минимальными руки-на время. Однако, точной пипетки требуется из-за малых объемов пеEDED быть смешаны вместе. Хорошо метода молекулярной биологии должно быть исполнен в любое время, а также.
GA клонирование предлагает неограниченные возможности для построения фрагментов ДНК, плазмид и векторов, которые больше, чем 3 кб по размеру. Кроме того, он имеет более широкое значение в области синтетической биологии, так как он позволяет синтез и сборку, например, вся бактериальная (Mycoplasma тусоШез) генома или дрожжи (Saccharomyces CEREVISIAE) хромосом 20,21. Способ также применим к обычным клонирование необходимо для генерации бесшовных конструкции.
В заключение, GA клонирование предлагает быстрый, надежный и гибкую альтернативу обычным способом клонирования ДНК.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Михаэла Янсен в Texas Tech University Health Sciences Center, Лаббок, Техас и Младен Йовчев в университете Питтсбурга медицинский центр, Питсбург, штат Пенсильвания для щедро обеспечивая pcDNA 3,1 Мус-His (А) и hEF1α промоутер, содержащие плазмиды , В исследовании, опубликованном в данной публикации, была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития Национальных Институтов Здоровья при премии числа R01HD037109 (в СКК). Дополнительная поддержка была от Laura Буша-младшего Института женского здоровья (в СКК и PNG). Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
| DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP - PCR Purification system |
| Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
| DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix |
| DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
| NheI | New England BioLabs | R3131S | |
| NotI | New England BioLabs | R3189S | |
| HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
| EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
| NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
| NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |
References
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
- Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
- Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
- Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
- Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
- Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
- Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
- Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
- Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
- MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
- Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
- Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
- Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
- Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
- Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
- Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
- Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).
