Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
Gibson sammenstilling (GA) kloning gir en hurtig, pålitelig og fleksibelt alternativ til konvensjonelle DNA-kloningsfremgangsmåter. Vi brukte GA til å lage tilpassede plasmider for uttrykk av eksogene gener i mus embryonale stamceller (mESCs). Ekspresjon av eksogene gener under kontroll av SV40 eller human cytomegalovirus promotorer avtar raskt etter transfeksjon inn mESCs. En løsning på dette redusert ekspresjon er å bruke den humane elongeringsfaktor-1 alfa (hEF1α) promotor for å drive genekspresjon. Plasmidvektorer inneholder hEF1α er ikke så lett tilgjengelig som SV40- eller CMV-holdige plasmider, spesielt de også inneholder N-terminale 3xFLAG-tags. Protokollen er beskrevet her er en rask metode for å skape plasmider uttrykker FLAG-merket CstF-64 og CstF-64 mutant under expressional regulering av hEF1α promoter. GA bruker en blanding av DNA-eksonuklease, DNA-polymerase og DNA-ligase for å gjøre kloningen av overlappende ender av DNA-fragmenter som mulig.Basert på malen DNA vi hadde tilgjengelig, designet vi våre konstruksjoner for å settes sammen til en enkelt sekvens. Vår konstruksjon benyttes fire DNA-fragmenter: pcDNA 3.1 vektorryggraden, hEF1α promoter del 1, hEF1α promoter del 2 (som inneholdt 3xFLAG-tag kjøpes som et dobbeltkjedet syntetisk DNA-fragment), og enten CstF-64 eller spesifikk CstF-64-mutant. Sekvensene til disse fragmentene ble lastet opp til en primer generasjon verktøy for å utforme egnede PCR-primere for å generere DNA-fragmenter. Etter PCR, ble DNA-fragmentene blandes med vektoren som inneholder den selektive markør og GA kloning reaksjonen ble satt sammen. Plasmider fra enkelt forvandlet bakteriekolonier ble isolert. Første skjermen av plasmidene ble utført ved restriksjonsspaltning, etterfulgt av sekvensering. I konklusjonen, GA tillatt oss å lage tilpassede plasmider for genuttrykk i fem dager, inkludert konstruere skjermer og verifikasjon.
Konvensjonelle DNA-kloningsfremgangsmåter baserer seg på bruk av restriksjonsenzymer for å spalte DNA og DNA-ligase for å slutte seg til DNA-fragmentene sammen. Generering av tilpassede ekspresjonskonstruksjoner som inneholder forskjellige DNA-fragmenter er en sekvensiell prosedyre som innbefatter spalting av DNA med en og / eller flere restriksjonsendonukleaser, og etterfølgende innsetting av DNA-fragmenter ved ligering. Den store ulempen med denne fremgangsmåten er at egnede restriksjonsenzymer for en av de DNA-fragmenter som kan være vanskelig å identifisere (dvs. kan ha flere spaltningsseter) rende vellykket DNA kloning av full-lengde proteinet av interesse umulig. Derfor generasjon av tilpassede uttrykk konstruerer under transkripsjonen regulering av effektiv celletypespesifikke arrangører med tilpassede protein-tags krever svært forsiktig design. Det er også en tids- og arbeidskrevende teknikk. Nylig, flere rapporter beskrevet metoder for å montere multiple forskjellige syntetiske DNA-fragmenter i en kontinuerlig sekvens på samme tid i enten ett- eller to-trinns reaksjoner uten bruk av restriksjonsenzymene 1-3. Den ett-trinns kloning reaksjon (unntatt alle forberedende trinn), avhenger av bruken av en blanding av DNA-eksonuklease, DNA-polymerase, DNA-ligase, 2,3 og de overlappende ender av DNA-fragmenter (figur 1). Siden det er ingen bruk av restriksjonsenzymer, kan DNA-fragmenter av hvilken som helst størrelse og sekvenssammensetning (med unntak av sterkt repeterende sekvenser) smeltes sammen i en sømløs konstruksjon. Nylig, et kommersielt kit (Gibson forsamlingen; GA) for ett-trinns kloning reaksjoner ble tilgjengelig. Dette settet gir rask og kostnadseffektiv montering av eventuelle DNA-fragmenter i en enkelt vektor med tilpassede arrangører og protein tags.
De allment tilgjengelige plasmid ekspresjonsvektorene brukes til å uttrykke eksogene proteiner i pattedyrcellekultur modeller er ofte under transkripsjonen regbefolkningen av viral cytomegalovirus (CMV) eller Simian virus 40 (SV40) arrangører. Disse viruspromotere gir robust forbigående uttrykk for eksogene proteiner i de fleste pattedyrcellekulturbaserte modeller. Imidlertid er generering av cellelinjer som stabilt uttrykker eksogene proteiner ofte mislykket på grunn av transkripsjonen stanse av CMV-SV40-promotere eller under etableringsprosessen 4,5. I tillegg vil SV40 og CMV virale promotorer ikke i tilstrekkelig grad å fremme ekspresjon av eksogene proteiner i celler fra lymfoidlinjen eller embryonale stamceller 6,7. Løsningen på den iboende begrensning av virale promotorer er å anvende sterke konstitutive ikke-virale promotere 8-10. En godt karakterisert sterk konstitutiv ikke-virale promoter av human opprinnelse er elongeringsfaktor 1α (hEF1α) promoter (hEF1α er involvert i katalyse av GTP-avhengig assosiasjon av aminoacyl-tRNA til ribosomer 11). Imidlertidekspresjonsvektorer inneholdende den hEF1α promoteren er ikke så lett tilgjengelig som det virale promoter-inneholdende plasmider, særlig de som også inneholdt 3 x FLAG ved den aminoterminale enden av proteinet av interesse.
Den 64.000 MW spalting stimuleringsfaktor protein (CstF-64) er involvert i den 3 'ende behandling av de fleste mRNA 12,13, inkludert replikasjonsavhengig histonmRNAer 14,15. CstF-64 er uttrykt i alle somatiske vev 12. Sin RNA anerkjennelse motiv binder seg til GU-rike RNA sekvenser på begynnende transkripsjoner nedstrøms cleavage og polyadenyleringssete 16. Denne bindingen av CstF-64 til den pre-mRNA fremmer effektiv endonucleolytic spalting av den gryende karakterutskriften.
Her er en protokoll som er beskrevet som benytter PCR-amplifisering av DNA-fragmenter, i en Gibson montering kloningssett (som inkluderer kjemisk kompetente bakterieceller) produserer tilpassede vektorer av 3xFLAG-merket mOuse CstF-64 eller mutant CstF-64 til deres aminoterminal ende under uttrykk for hEF1α promoter en.
Vellykket bruk av GA kloning bør alltid innledes med en omhyggelig konstruksjon av den komplette konstruksjonen (figur 2 og figur 3).
Forsiktig verifisering av primersekvensene designet av primer generasjons verktøy er også sterkt anbefalt. Primere for GA kan genereres uten anvendelse av primeren generasjon. Imidlertid er bruk av verktøyet anbefaler, fordi det forenkler prosessen. Generelt må primeren for GA kloning har to funksjonelt forskjellige sekvenser. Den første sekvensen er DNA-fragment-spesifikke, og tillater amplifikasjon av fragmentet ved hjelp av PCR. Den andre sekvensen overlapper den tilstøtende fragment, noe som er nødvendig for montering GA. En typisk DNA-fragment-spesifikk sekvens ville være 18 til 22 nt lange. DNA-fragmentet spesifikke sekvenser som benyttes for å amplifisere den samme DNA må ha tilsvarende smeltetemperaturer og GC-innhold. Overlappende sekvens bør være minst 15nt i lengde, med en smeltetemperatur på minst 48 ° C. Monteringen av mer enn fire DNA-fragmenter vil kreve den overlappende sekvens for å være minst 20 nt. Lengre overlapp vil tillate økt spesifisitet av annealing resulterer i mer riktig sammensatte DNA-fragmenter. Det anbefales å unngå sekvenser som er skjeve i sin GC eller AT innhold i utviklingen av overlappende sekvenser, fordi skjeve sekvenser kan kompromittere skikkelig DNA montering.
Vi foreslår også anvendelse som en negativ kontroll som ikke skal gi noen medikament-resistente bakteriekolonier, bare DNA-fragment som tilsvarer vektoren ryggraden i en GA reaksjon. Alternativt kan en av de DNA-fragmenter som omfatter de "inserts" kan utelates fra GA reaksjon, som også bør resultere i ingen medikamentresistente bakteriekolonier. Grunnen ingen kolonier vokser vil være mangel på overlappende ender av de tilstøtende DNA-fragmenter, som vil gjøre monteringen av en komplete plasmid.
I den protokoll som er beskrevet, overlappende sekvenser av 25 nt for å generere primersett ble anvendt, på grunn av antallet av DNA-fragmenter som brukes (figur 3). Anbefaling av primer generasjons verktøy hjemmeside (se tabell av utstyr) er å bruke minst 20 nt overlappende sekvenser for å montere 4 – 6 DNA-fragmenter. I tillegg lengre overlappende sekvens vil sikre riktig komplementering av DNA-trådene (se figur 1) å øke antall nøyaktig sammensatte produkter.
For tiden er en rekke systemer for sømløs kloning er tilgjengelig. Men noen av disse systemene fortsatt bruke restriksjonsenzymer (dvs. Golden Gate kloning 18). Andre bruker proprietære blandinger av enzymer basert på vaccinia virus-DNA-polymerase, og enkeltkjedet DNA-bindende protein fra den samme biologiske kilden 19. Begge systemene er begrenset i forhold til Ga ved shorter lengde av overlappende sekvenser. Fordi kortere overlappende sekvenser som ikke kan tilveiebringe tilstrekkelig spesifisitet til glødetrinn av tilstøtende DNA-fragmenter, hvilket gjør den riktige montering av mer enn 23 DNA-fragmenter problematiske. Disse manglene ikke er til stede i GA-systemet.
Størrelsen på DNA-fragmenter som skal forsterkes bør også vurderes, slik at den ikke overskrider størrelsen på en pålitelig forøkbare ved PCR (dvs. mindre enn 8 kbp i lengde). Selv med forbedringene i funksjon av DNA polymeraser i de siste 10 årene, vil store DNA-fragmenter bli forsterket med mindre effektivitet og nøyaktighet. Om nødvendig kan større DNA-fragmenter oppnås fra andre kilder alternativ til PCR, for eksempel, ved å plasmid isolert og passende DNA-spaltning med restriksjonsenzymer. Nærmere bestemt, for protokollen som er beskrevet i den aktuelle manuskript, vår rasjonelt å bruke PCR ble basert på størrelsen av de tilgjengelige DNA-fragmenter, som alle var mindre enn5 kbp. Hvis det er mer enn én PCR-produkt identifisert ved agarosegel-elektroforese, er gelrensing av det ønskelige fragmentstørrelse anbefales å bruke en hvilken som helst av de tilgjengelige molekylære biologiske teknikker eller egnede kits. I den nåværende protokoll en termostabil DNA polymerase er (se tabell of Materials) anvendt. Men noen DNA polymerase gir høy nøyaktighet og utbyttet vil være egnet til å brukes med denne protokollen. Hvis high-fidelity DNA polymeraser annerledes enn beskrevet i protokollen er tilgjengelig, bruker de satt opp forhold som er beskrevet i de respektive håndbøkene. I den aktuelle protokoll, kjemisk kompetent E. coli-celler er brukt som følger med GA kit. Alternativt, kjemisk eller elektro kompetente E. coli-stammer så som DH5a eller DH10B kan benyttes.
Forsamlingen kloning 2x mester mix er enkel å bruke med minimal hands-on tid. Imidlertid er nøyaktig pipettering nødvendig på grunn av de små volumene neerD cEDED som skal blandes sammen. God molekylærbiologi teknikk må utøves til enhver tid også.
GA kloning gir ubegrensede muligheter for konstruksjon av DNA-fragmenter, plasmider og vektorer, som er lengre enn 3 kbp i størrelse. I tillegg har det en bredere innvirkning på området syntetisk biologi, fordi det tillater syntese og montering av for eksempel en hel bakterie (Mycoplasma mycoides) genom, eller en gjær (Saccharomyces cerevisiae) kromosom 20,21. Teknikken kan også anvendes på konvensjonell kloning behov for å generere sømløse konstruksjoner.
Som konklusjon, GA kloning tilbyr rask, pålitelig og fleksibelt alternativ til den konvensjonelle DNA-kloningsprosedyren.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Michaela Jansen ved Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX og Mladen Yovchev ved University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA for sjenerøst gi pcDNA 3.1 myc-His (A) og hEF1α promoter inneholder plasmider . Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development av National Institutes of Health i henhold til pris nummer R01HD037109 (til CCM). Ytterligere støtte var fra Laura W. Bush Institute for kvinners helse (til CCM og PNG). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
NheI | New England BioLabs | R3131S | |
NotI | New England BioLabs | R3189S | |
HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |