Summary
시약의 기관 내 삽관 매개 (IMIT) 점안 호흡기 질환뿐만 아니라 폐에 직접 치료 시약을 주액하는 방법을 연구 우수한, 비 침습적 방법이다. 이 임상 시험에 적합한 신속하고 재현성이 높은 방법이다.
Abstract
호흡기 질환 연구는 통상적 대리 시스템 같은 뮤린 모델의 사용을 포함한다. 그러나, 특히 자신의 상부 호흡기 (URT)의 쥐와 인간의 호흡 시스템 사이의 중요한 생리 학적 차이가있다. 잠재적으로 이러한 질병을 연구하기 위해 마우스 모델의 유용성을 제한 비내 점적 기법을 사용할 때 일부 모델에서, 뮤린 비강에서 이러한 차이는 하부 호흡기 (LRT)에서의 질환 진행과 표현에 상당한 영향을 미칠 수있다. 이러한 이유로, 그것은 URT의 개입없는 LRT 질환을 연구하기 위해, 마우스 폐로 직접 박테리아를 주입하는 기술을 개발하는 것이 유리하다. 우리는이 폐 특정 배달 기술 삽관 매개 기관 내 (IMIT) 점안로 명명했다. 이러한 기술은 비 침습적 침습적 traditi 중에 발생할 수있는 혈류 내로 점적에 대한 가능성을 최소화도 그러 외과 기관 내 감염 방법, 및 불가피한 소화관 전달의 가능성을 제한한다. IMIT 생쥐 먼저 폐 내로 박테리아의 직접 전달을 중재하는 카테터에 무딘 바늘의 삽입으로, 기관에 올바른 카테터 배치를 보장하기 위해 중간 단계로, 삽관 하였다되는 두 단계 프로세스이다. 이 방법은 폐 걸쳐 시약의 우수한 분배와 폐로 전달> 98 %의 효능을 용이하게한다. 따라서 IMIT 인간 호흡기 질환을 연구하는 대리로 쥐를 사용하는 능력 향상에 직접적으로 LRT 폐 질환 및 치료 전달을 연구하는 새로운 접근법을 나타낸다. 또한, 본 전달 시스템의 정확도 및 재현성이 또한 우수 실험실 실무 표준 (GLPS) 의무뿐만 아니라 폐에 고효율 전송을 필요 시약의 다양한 전달한다.
Introduction
마우스는 호흡기 질환의 무수히 포함하는 수많은 인간의 질병 증상을 모델링하는데 사용되어왔다. 대리 질병 모델들은 전형적으로 중요한 생리적 또는 두 개의 호스트 모델에서 면역 차이로 모델링 된 질병의 모든 측면 요점을 되풀이 할 수 없다. 따라서, 모델 시스템을 개선 목표 대용 더 자세히 질병 과정을 미러링 또는 원래 호스트 시스템에서 관찰되는 바와 같이 반응을 호스팅 할 수있는 방법을 개발하는 것이다. 그들이 공기를 격려하는 메커니즘에 쥐와 인간 사이에 몇 가지 중요한 생리 학적 차이가 있습니다. URT와 LRT 사이의 크기에서 상당한 비율 적 차이는 이러한 차이에 포함되어 있습니다. 이것은 생쥐> 100 전체 폐 용량 1,2- 대해 정규화 인간 URT 표면적 상대적 접어 가지고있는 것으로 추정되었다. 따라서, 마우스의 비강 비갑개는 breathi의 훨씬 더 큰 레이트를 촉진하기 위해 영감 공기의보다 광범위한 필터링을 허용비강 감염 질병의 진행에 중요한 역할을하는 경우에는 NG, 폐렴의 연구에 중요한 영향을 미칠 수있다.
여러 다른 접근법은 인간과 같은 호흡기 질환을 연구하기 위해 쥐의 폐에 박테리아를 주입하기 위해 사용되어왔다. 이러한 방식의 가장 일반적인 액체 현탁액 마우스 중 하나 또는 모두 콧 구멍에인가되는 비내 접종이다. 비교적 단순한 반면, 이러한 비내 접종 3-5 통해 LRT로 점안의 효율에 영향을 미칠 수있는 사용 마취 점적 양과 유형으로주의. 즉, 밀러 등. 이하 50 μL가 LRT (6)에 박테리아의 점안을 초래하지 않은 볼륨에서 Francisella의 tularensis의 비강 내 점적 주입을 보여 주었다. 마취 주사 케타민 / 자일 라진 (xylazine)에 반대 흡입 이소 플루 란을 사용하는 경우 그들은 더 나은 LRT의 점안을 관찰했다. 그러나, 우리의 experienc에페스트 균의 비강 내 접종와 E는 이소 플루 란 (MBL, 게시되지 않은 데이터)에 비해 더 일관성 접종 케타민 / 자일 라진 (xylazine)을 사용하여 달성 할 수있는 것을 나타냅니다. 이러한 차이는 사용 병원균 또는 실험실 절차에 변화에 있지만, 중요한 것은이 기술의 잠재적 인 변동성을 강조 기인 할 수있다. 또한, 초기 박테리아 접종원 비교적 낮은 비율이 폐에 도달 한 것을 비강 점적 쇼 직후 수확 폐 박테리아의 수많은 것이 제안 (Y. 페스티의 경우는 10 %만이 점안 칠 후 1 시간을 회수 하였다) URT 유지 (또는 위장관으로 섭취) 할 수있다. 유기체는 인간의 질병과 일치하는 방식으로 뮤린 비강 식민지화 수 있는지 특정 질병 모델에서 URT 점막에 세균이 상당한 침착 질환 진행에 대한 우리의 이해를 혼란시킬 수있다. 예를 들어, 생체 내에서 사용하기 </ EM>는 이미징, 그것은 비강 점적 방법 (8)에 의해 전달되는 경우에 인간 URT 정착하지 부르크 홀데 pseudomallei는, 뮤린 비강 압도적 기회 감염을 일으키는 것으로 관찰되었다.
쥐의 폐에 세균을 주액하는 다른 방법은 또한 감염성 질환 연구에 이용되어왔다. transoral [소화 기관 및 LRT] 그러나, 비강 내 점적 주입에 비해이 방법은 여러 사이트 (예를 들어, 에어로졸 [URT와 LRT]에 감염 개시의 가능성을 제거하지 않고 더 전문 기술 및 / 또는 고가의 장비를 필요로하는 경향이 수술 기관 내 [LRT 및 혈류]). 감염의 보조 사이트와 연관 될 수있는 잠재적 인 합병증을 감안할 때, 우리는 URT를 무시하고 직접 마취 된 쥐의 폐에 병원체를 전달하는 기관 내 접근 방식을 개발하기 위해 노력뿐만 아니라, 실수로 inoculat 제한혈류 또는 GI 관에 이온을. 이를 위해, 삽관 매개 기관 내 (IMIT) 점안 전에 점안을 통해 카테터의 위치를 확인하기 위해 중간 단계를 포함하여 접종의 LRT의 점안을 보장하는 비수술 적 절차로 개발되었다. 시각적으로 폐에 걸쳐 접종의 광범위한 분포를 보여, 및 P.에이 방법은 염료 점안을 사용하여 설명 녹농균의 점안은 폐에이 방법의 매우 효과적인 전달 (> 접종의 98 %)을 설명합니다. 중요한 것은 원래 세균 전달을 위해 개발하면서, IMIT도위한 효과적인 도구 제공 다른 호흡기 질환 모델, ⅱ) 폐 특정 치료 전달 연구를위한 다양한 분자 ⅰ) 점안, 그리고 ⅲ) 염기성 폐 기능 시험은, 타겟을 포함 폐에 siRNA를 전달.
Protocol
참고 : 여기에 설명 된 모든 절차를 검토하고 루이빌 기관 바이오 안전성위원회 (프로토콜 # 13-056)과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 # 13-064)의 대학에 의해 승인되었습니다.
염료 1. 준비
- 0.1 % 희석 (/ w를 v)를 PBS에 쿠마시 브릴리언트 블루 및 0.45 μM 주사기 필터를 이용하여 필터 소독.
녹농균 문화 2. 준비
- 점안 전에 15 시간은, 하나의 세균 식민지와 국물 문화의 3 ㎖를 접종.
- 셰이커 (200 RPM)에 37 ° C에서 배양 15 시간 성장.
- 원심 분리기 30 초 동안 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브 12,000 XG에 문화 1 ㎖.
- 배지를 제거하고 PBS 1ml의에서 펠렛을 재현 탁.
- PBS의 세균 재고 서스펜션 1:10 나누어지는을 희석을 결정하기 위해 희석 세균 현탁액의 OD 600을 측정세균 농도.
- IMIT 접종 50 μL의 전달 부피를 사용하여, 박테리아 접종원의 원하는 농도로 PBS에 세균 스톡 현탁액을 희석.
3. IMIT 떨어 뜨림
- 이소 플루 란 마취 유도 챔버에 마우스의 군을 배치하고 2하여 마취 - 3 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물.
- 진정 작용의 초기 개시에서, 직립 마우스를 잡고, 마우스 목덜미 및 목의 뒤쪽 위관 니들에 의해 2 % 리도카인 용액 10 μl를 관리하고 용액 다운 후두개로 배출되도록. 마취 챔버에 마우스를 돌려줍니다.
- 국소 마취로 전체 적용하기 위해 리도카인을 허용하기 위해 최소 5 분을 허용합니다.
- 마우스가 진정의 원하는 수준을 달성 한 경우 (60 BPM ~의 속도를 호흡), 진정 작용을 유지하기 위해 2 % 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다.
- 250 μL의 기밀에 미리로드 염료 또는 세균 접종22 G 긴 무딘 바늘 정밀 주사기 맞습니다.
- 먼저 주사기의 테프론 플런저에 의해 측정 된 공기의 150 μL를 작성한다. 다음, 주사기 본체에 200 μL 마크에 150 μL 마크에서 테프론 플런저를 전진하여 접종 50 μL를 그립니다.
NOTE : 시료 삽관 마우스로 토출 될 때, 50 μl의 현탁액은 폐 걸쳐 균액을 분배하는 150 ㎕의 공기 쿠션에 의해, 제 뒤에 전달 될 것이다.
- 먼저 주사기의 테프론 플런저에 의해 측정 된 공기의 150 μL를 작성한다. 다음, 주사기 본체에 200 μL 마크에 150 μL 마크에서 테프론 플런저를 전진하여 접종 50 μL를 그립니다.
- 유도 챔버에서 하나의 마우스를 제거하고 삽관 플랫폼에서 부정사 누워. 벨크로 스트립에 부착 된 O 링과의 앞니를 후킹하고, 플랫폼에 벨크로를 확보하여 플랫폼에 마우스를 고정합니다. 45 ° 경사에 마우스를 올립니다.
- 마이크로 솜 어플리케이터를 사용하여, 지배적 인 손을 사용하여, 회전 운동과 혀를 후퇴.
- 비 우세 손으로, 모두 엄마에 삽관 specula와 함께 운영 검 이경 맞는 사용혀 후퇴를 intain과 성문을 시각화.
- 지배적 인 손으로, (카테터 노출 카테터의 10mm와 실리콘 슬리브 적합) 마우스 기관에 10mm 깊이에 카테터를 좌석, 마우스를 삽관에 20 G 카테터를 통해 스레드 가이드 와이어를 사용합니다. 검 이경 / specula를 제거합니다.
- 마우스가 제대로 간단히 색깔의 염료를 포함 1/16 "투명 튜브의 루어 연결된 길이를 부착하는 동안 비 우세 손으로 카테터를 확보하여 관을 삽입되었는지 확인합니다.
참고 : 염료 빠르게 호흡에 대한 응답으로 앞뒤로 이동한다. - 삽관의 확인이이 시점에서 설정되어 있지 않은 경우 다음 단계로 진행하지 마십시오. 삽관이 실패한 시도 된 경우, 삽관에 하나의 추가 시도가 카테터와 가이드 와이어를 다시 설정합니다.
참고 : 마우스에 외상을 유발하지 않고 하나의 세션에서 마우스 두 개 이상의 intubations을 시도하는 바람직하지 않다입니다. - 계속액체 서스펜션 / 에어 쿠션을 포함하는 정밀 주사기 / 무딘 바늘을 삽입하는 동안 비 우세 손으로 카테터를 고정합니다.
- 직접 하나의 유체 운동의 폐에 액체 / 공기를 분배하고 즉시 마우스에서 바늘 / 카테터를 제거합니다.
- 케이지에 마우스를 반환하고 마취에서 회복 할 수 있습니다.
IMT 납품 4. 특성
- IMIT의 점안 한 후, 적절한 시간 후 접종에서 CO 2 질식하여 마우스를 안락사.
- 해부 보드의 안락사 마우스를 안전하고 70 % EtOH로는 물총 병을 사용하여 가슴과 복부를 흡수.
- 폐 걸쳐 조영제의 분포를 평가하는 경우, 무균 기술을 사용하여 동물로부터 폐를 제거하고 영상에 적절한 폐 표시.
참고 :. 폐는 적절한 고정 또는 냉동 보관을 통해 추가 조직 학적 염색 기술에 대한 제조 할 수있다 </ 리> - 감염된 폐 조직의 세균 부담을 평가하는 경우, 무균 기술을 사용하여 동물로부터 폐를 제거. 장소 폐는 멸균에, 1 온스 샘플 가방을 preweighed. 달아 샘플 백 + 폐의 중량을 기록한다.
- 각각의 샘플 가방 + 조직으로 멸균 1X PBS 1 ML을 추가합니다. 샘플 가방을 봉인.
- 샘플 가방 + 조직을 통해 25 ml의 혈청 학적 피펫을 롤링하여 부드러운 조직을 균질화.
- (연구되고 LB, 또는 세균 종에 적절한) 한천 접시에 폐 멸균 PBS에서 균질 및 판의 연속 희석을 생성합니다 :
- 다음 한천 접시에 멀티 채널로 세중의 샘플을 판 멀티 채널 피펫으로 U-바닥 96 웰 플레이트에서 여섯 배 용액을 희석을 실시한다.
- 하룻밤 37 ℃에서 한천 플레이트를 품어 다음날 콜로니 형성 단위를 열거합니다.
Representative Results
IMIT 방법을 통해 얻은 물질의 분포를 시각화하기 위해, 0.1 % 쿠마시 브릴리언트 블루 염료의 50 μL은 마취 된 쥐의 폐에 주입되었다. 마우스가 바로 안락사 된 폐 멸균 부검에 의해 제거되었다. 염료는 폐의 모든 엽 (叶)에 전달 된 것을 1은 그림.
IMIT 방법을 통해 폐로 전달 박테리아의 양, 쥐의 세 개의 그룹 (N = 3) P. 세 가지 농도로 주입 하였다 결정하려면 녹농균 (1.21 × 10 (8), 1.21x10 7, 1.21 × 10 6 콜로니 형성 단위 [CFU] 50 μL 당). 즉시 IMIT의 점안 한 후, 마우스는 폐를 제거, 안락사, 세균 숫자는 접종 (그림 2)에 열거하고 비교 하였다. 주입의 접종 배달은 폐에서 발견 접종의> 98 %로,이 방법을 통해 매우 효율적이다동물. 또한, IMIT 점적 주입에 관계없이 접종 (= 0.9951 R 2)의 농도 재현성이었다.
그림 1 : IMIT의 점안이 폐에 걸쳐 접종을 배포 모든 로브 배포 0.1 % 코마시 브릴리언트 블루 쇼 파란색 염료의 50 μL로 주입 쥐에서 폐..
그림 2 :. 폐 마우스에 세균 IMIT의 점안은 P.에 주입했다 녹농균 및 폐 내로 주입 균수가 (10 CFU 로그 - 회수) 추정 균액 비교 하였다 (10 CFU 로그 - 전달). 각각의 서클은 개별적 마우스 (의 CFU / 폐 n = 각 3를 나타내고세균 투여).
Discussion
IMIT의 점안 재현성 폐에 직접 시약을 주입 할 수있는 능력에서 기존의 호흡기 질환 모델의 핵심 개선 사항을 제공합니다. 그것은 IMIT 기술을 수행 이상적으로 마취 caging의 물류를 관리하는 하나의 두 연구자의 팀에 위치해 빠른 접근, 다른입니다. 마우스 당 3 분 - 대형 연구 (2)의 평균 시간 헌신 IMIT를 사용하여 수행 될 수있다. 접근법은 이소 플루 란 마취제로서 사용하게되므로, 마우스는 복구를 통해 동물을 모니터링의 축산 시간을 줄이고, 마취로부터 신속히 회복.
IMIT 방법의 가장 기술적 도전 양상은 마우스 삽관의 초기 단계이다. IMIT을 수행하기 위해 학습 개인은이 첫 번째 카테터 배치 단계 및 그 삽관을 보장하는 것은 염료 운동의 시각적 확인을 통해 달성되었습니다에 초점을 맞출 수 있습니다. 접근법의 이점은 폐 - 스펙 인IFIC의 점안은 새로운 연구원 모두의 신뢰뿐만 아니라 어려운 동물을 삽관을 시도하는 전문가를 증가 삽관의 확인,의 사용을 통해 보장된다. 성공적인 삽관의 가능성을 최적화의 핵심 요소는 다음과 같습니다 깊은 진정을 달성 ⅰ), ⅱ) 입에 specula의 정확한 위치가의 III) 좋은 깊이 배치, 후두개의 좋은 시각화 할 수 있도록 충분한 작업 시간을 허용하도록 specula 혀 절차 내내 후퇴 남아 있고, 절차가 편안하고 안정된 방식으로 수행되도록 틸팅 플랫폼 ⅳ) 사용이 연구자의 손을 지원되도록.
IMIT 절차의 한계 중 하나는 IMIT의 점안 이벤트 빈도에 관련된다. 놓친 삽관과 관련된 잠재적 인 외상으로 인해, 그것은 두 개 이상의 삽관 시도 (최대 2 미스에) 하나의 세션에서 실시하지 않는 것이 좋습니다. IMIT그 능력이 우수한 전위 뮤린 폐에 치료제를 전달하기 위해 사용될 수 있으며, 폐 내로 시약 매우 빈번한 전달을 활용하지만 치료법은 IMIT 적합하지 않을 수도있다. 그것은 IMIT 상당한 외상을 일으키지 않고 뮤린 폐에 시약을 제공하기 위해 매일 사용될 수 있음 수도 있지만 삽관과 관련된 외상의 대부분으로, 고도로 숙련 된 연구자가 실시한 경우에만 놓친 삽관 이벤트와 관련이있는 것으로 생각된다 . 이러한 고주파 IMIT 지역 수의사와 IACUC와 논의해야합니다.
IMIT의 추가적인 전위 제한 삽관되는 마우스의 크기이다. 20 G 카테터이 크기 범위의 생쥐의 기관에 적합한 크기였다 22 g을, - 상기 IMIT 절차는 약 17의 생쥐를 사용하여 개발되었다. 큰 카테터 성공적 이전 마우스에서 사용되었다; IMIT의 m의 초기 개발> 20g이다 BALB / c 마우스에 18 G 카테터의 에이드 사용. 대체 카테터 크기는 사용되는 경우 중요한, 무딘 바늘은 카테터의 루멘에 맞게 단지 카테터 팁 넘어서 1mm 연장 길이로 손질되어있는 공급한다. 17g보다 작은 마우스 삽관이 가능할 수도 있지만, 필요한 전문성 때문에 바람직하지 않고, 작은 카테터 상술 된 것보다 specula의 사용을 요구한다.
우리는 P. 이외에 여러 가지 호흡기 병원체의 전달을 위해 IMIT를 사용했다 B. 포함 녹농균, pseudomallei 9, 폐렴 간균 (10). IMIT 모델은 B의 우리의 연구에 중요한 발전을했다 pseudomallei 호흡기 질환은 비강 내 접종이 오히려 인간의 질병 (9)에서 관찰 된 전신 질환 엔드 포인트에 비해 쥐의 초기, URT 관련 사망률의 원인 발견 한. B. pseudomallei는 1 단계 SELEC입니다바이오 디펜스에 미치는 영향의 t 에이전트, 및, 호흡기 질환 모델은 에어로졸에 노출 개발되고있다으로하는 모델 무기화 병원균에 대한 항목의 잠재적 인 바이오 디펜스 관련 경로. 현재 에어로졸 모델은 URT와 LRT 모두의 감염 발생하기 때문에, 같은 잠재적 인 초기 사망률 표현형은 우리가 B의 비강 모델 확인했다 pseudomallei 호흡기 질환은 에어로졸 모델에 적용 할 수있다. IMIT 모델의 미래 적응은 마우스 만 폐에 대상 에어로졸 전달을 위해 삽관하는 삽관 매개 에어로졸 전달 (이마 드)이 될 수 있습니다. 기계 환기는 에어로졸, 액체 기반보다는 병원균 도전을 제공하도록 구성 될 수있는 이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 현재 사용할 수 있습니다.
IMIT는 폐에 박테리아의 전달을 최적화하는 방식으로 초기 개발뿐만 아니라, 마우스 폐에 다른 시약의 전달을위한 애플리케이션을 보유 하였다. DIS로위의 험담을 늘어 놓았다, 낮은 효율 마우스 결과에 화합물의 비강 전달, 폐의 표적 장기에 시약의 높은 변수 전달. 우리가 IMIT가> 98 %의 전달 효과와 multilobar 배포 접근 다른 폐 배달를 대체 할 수있는 뛰어난 성능을 제공하는 증명 반면 쥐의 폐에 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상 시약의 비강 배달, 40 %의 전달 효율 (11)을 얻었다. 폐에 표적 전달에 이러한 개선은 폐 질환의 치료를위한 치료 적 전달의 재현성을 증가시킬 가능성을 갖는다. I) 환경 폐 자극의 영향, II) 폐암 표현형 연구, III) 폐 특정 siRNA를 노크 다운 : IMIT 유사 연구에 혜택을 제공 할 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20 G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250 ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22 G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1 oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
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