Summary
अभिकर्मकों की इंटुबैषेण की मध्यस्थता intratracheal (IMIT) टपकाना सांस की बीमारी है, साथ ही फेफड़ों में सीधे चिकित्सीय अभिकर्मकों instilling के लिए एक विधि के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट, noninvasive विधि है. यह पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए उपयुक्त है जो एक तेजी से और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है.
Abstract
सांस की बीमारी के अध्ययन आम तौर पर किराए की प्रणाली के रूप में murine मॉडल का उपयोग शामिल है. हालांकि, विशेष रूप से उनके ऊपरी श्वास इलाकों (URT) में murine और मानव श्वसन प्रणाली के बीच महत्वपूर्ण शारीरिक मतभेद रहे हैं. संभवतः इन बीमारियों का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल की उपयोगिता सीमित intranasal टपकाना तकनीकों का उपयोग करते समय कुछ मॉडल में, murine नाक गुहा में इन मतभेदों को कम श्वसन तंत्र (एलआरटी) में रोग प्रगति और प्रस्तुति पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. इन कारणों के लिए, यह URT की भागीदारी के अभाव में एलआरटी रोग का अध्ययन करने के क्रम में माउस सीधे फेफड़ों में बैक्टीरिया पैदा करने के लिए एक तकनीक विकसित करने के लिए लाभप्रद होगा. हम इस फेफड़ों विशिष्ट प्रसव तकनीक इंटुबैषेण की मध्यस्थता intratracheal (IMIT) टपकाना करार दिया है. इस noninvasive तकनीक और अधिक आक्रामक traditi के दौरान हो सकता है जो खून में टपकाना के लिए संभावित कम से कमonal शल्य intratracheal संक्रमण दृष्टिकोण, और आकस्मिक पाचन तंत्र प्रसव की संभावना को सीमित करता है. IMIT चूहों पहले फेफड़ों में बैक्टीरिया की प्रत्यक्ष वितरण मध्यस्थता कैथेटर में एक कुंद सुई की प्रविष्टि से, श्वासनली में सही कैथेटर नियुक्ति सुनिश्चित करने के लिए एक मध्यवर्ती कदम के साथ, intubated पालन कर रहे हैं, जिसमें एक दो कदम प्रक्रिया है. यह दृष्टिकोण फेफड़ों भर अभिकर्मक के उत्कृष्ट वितरण के साथ फेफड़ों में प्रसव के> 98% प्रभावकारिता की सुविधा. इस प्रकार, IMIT मानव सांस की बीमारी का अध्ययन करने के surrogates के रूप में चूहों का उपयोग करने की क्षमता में सुधार, सीधे फेफड़ों में एलआरटी रोग और चिकित्सीय वितरण का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. इसके अलावा, इस वितरण प्रणाली की सटीकता और reproducibility भी यह अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास मानकों (GLPS) के लिए उत्तरदायी है, साथ ही फेफड़ों के लिए उच्च दक्षता वितरण की आवश्यकता होती है जो अभिकर्मकों की एक विस्तृत श्रृंखला का वितरण करता है.
Introduction
चूहे सांस की बीमारियों के असंख्य सहित कई मानव रोग अभिव्यक्तियों, मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. किराए की बीमारी मॉडल अक्सर आम तौर पर होने के कारण महत्वपूर्ण शारीरिक या दो मेजबान मॉडल में प्रतिरक्षा मतभेदों को, एक मॉडलिंग रोग के सभी पहलुओं पुनरावृत्ति करने में असमर्थ हैं. इस प्रकार, मॉडल प्रणाली में सुधार की एक लक्ष्य surrogates के अधिक निकट एक रोग प्रक्रिया दर्पण या मूल मेजबान सिस्टम में मनाया के रूप में प्रतिक्रिया की मेजबानी करने की अनुमति दृष्टिकोण विकसित करना है. वे हवा को प्रेरित व्यवस्था है जिसके द्वारा में चूहों और इंसानों के बीच कई महत्वपूर्ण शारीरिक मतभेद हैं. URT और एलआरटी के बीच आकार में महत्वपूर्ण ratiometric मतभेद इन मतभेदों में शामिल हैं. यह चूहों> 100 कुल फेफड़ों की क्षमता 1,2 के खिलाफ सामान्यीकृत मनुष्य के लिए URT सतह क्षेत्र रिश्तेदार, गुना के अधिकारी है कि अनुमान लगाया गया है. इस प्रकार, माउस की नाक turbinates breathi का एक बहुत बड़ा दर को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रेरित हवा के अधिक व्यापक छानने के लिए अनुमतिनाक गुहा के संक्रमण रोग प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है अगर एनजी, निमोनिया की पढ़ाई पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है.
कई अलग अलग दृष्टिकोण मानव की तरह सांस की बीमारी का अध्ययन करने के लिए चूहों के फेफड़ों में बैक्टीरिया पैदा करने के लिए नियोजित किया गया है. इन तरीकों का सबसे आम एक तरल निलंबन एक माउस की एक या दोनों nares पर लागू किया जाता है, जिसमें intranasal टीका, है. अपेक्षाकृत सरल है, जबकि इस तरह के intranasal टीका 3-5 के माध्यम से एलआरटी में टपकाना की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं इस्तेमाल किया संज्ञाहरण की टपकाना मात्रा और प्रकार के रूप में निरंतर. विशेष रूप से, मिलर एट अल. कम से कम 50 μl एलआरटी 6 में बैक्टीरिया की टपकाना में परिणाम नहीं था खंडों में Francisella tularensis की कि intranasal टपकाना दिखाया है. संज्ञाहरण के लिए इंजेक्शन ketamine / xylazine के लिए विरोध के रूप में साँस isoflurane का उपयोग करते समय वे आगे बेहतर एलआरटी टपकाना मनाया. हालांकि, हमारे अनुभवीYersinia pestis intranasal टीका के साथ ई isoflurane (एमबीएल, अप्रकाशित डेटा) की तुलना में अधिक सुसंगत टीका ketamine / xylazine का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है इंगित करता है. इन मतभेदों का इस्तेमाल किया रोगाणु या प्रयोगशाला प्रक्रिया में बदलाव करने के लिए, लेकिन महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तकनीक में संभावित परिवर्तनशीलता उजागर जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. इसके अलावा, प्रारंभिक बैक्टीरियल inoculum की एक अपेक्षाकृत कम प्रतिशत फेफड़ों तक पहुँचता है कि intranasal टपकाना शो के बाद शीघ्र ही काटा फेफड़ों बैक्टीरिया की एक बड़ी संख्या, सुझाव है कि (वाई pestis के मामले में, केवल 10% टपकाना 7 के बाद 1 घंटा बरामद किए गए) URT में बनाए रखा (या सैनिक पथ में निगल) किया जा सकता है. जीव मानव रोग के साथ असंगत तरीके में murine नाक गुहा बस्तियां करने में सक्षम है अगर कुछ रोग मॉडल में, URT म्यूकोसा पर बैक्टीरिया की इस महत्वपूर्ण बयान रोग प्रगति के बारे में हमारी समझ को उलझाना सकता है. उदाहरण के लिए, विवो में उपयोग कर </ उन्हें> इमेजिंग, यह intranasal टपकाना विधि 8 ने दिया जब मानव URT उपनिवेश नहीं करता जो Burkholderia pseudomallei, murine नाक गुहा की एक भारी अवसरवादी संक्रमण का कारण बनता है कि देखा गया है.
चूहों के फेफड़ों में बैक्टीरिया instilling के लिए अन्य तरीकों में भी संक्रामक रोग अनुसंधान में नियोजित किया गया है. Transoral [पाचन तंत्र और एलआरटी]; हालांकि, intranasal टपकाना की तुलना में इन विधियों कई साइटों (जैसे, एयरोसोल [URT और एलआरटी] में संक्रमण दीक्षा के लिए संभावित को नष्ट करने के बिना अधिक तकनीकी विशेषज्ञता और / या महंगे उपकरण की आवश्यकता होती हैं और शल्य intratracheal [एलआरटी और रक्त प्रवाह]). संक्रमण के माध्यमिक साइटों के साथ जुड़ा हो सकता है कि संभावित जटिलताओं को देखते हुए, हम URT नजरअंदाज और सीधे anesthetized चूहों के फेफड़ों में रोगाणु बचाता है, जो एक intratracheal दृष्टिकोण को विकसित करने की मांग की, लेकिन यह भी अनजाने inoculat की सीमारक्त प्रवाह या सैनिक पथ में आयन. इस दिशा में इंटुबैषेण की मध्यस्थता intratracheal (IMIT) टपकाना पूर्व टपकाना करने के लिए उचित कैथेटर नियुक्ति को सत्यापित करने के लिए एक मध्यवर्ती कदम शामिल करके inoculum के एलआरटी टपकाना की गारंटी देता है जो एक nonsurgical प्रक्रिया के रूप में विकसित किया गया था. नेत्रहीन फेफड़ों भर inoculum के व्यापक वितरण का प्रदर्शन, और पी के लिए इस विधि डाई टपकाना का उपयोग वर्णित है aeruginosa टपकाना फेफड़ों के लिए इस विधि का अत्यधिक प्रभावशाली वितरण (> inoculum के 98%) प्रदर्शित करने के लिए. महत्वपूर्ण बात यह मूल रूप से बैक्टीरियल वितरण के लिए विकसित की है, जबकि, IMIT भी के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करता है: अन्य सांस की बीमारी मॉडल, द्वितीय) फेफड़ों विशेष चिकित्सकीय प्रसव के अध्ययन के लिए विभिन्न अणुओं का मैं) टपकाना, और तृतीय) बुनियादी फेफड़ों समारोह पढ़ाई, लक्षित सहित फेफड़ों को siRNA वितरण.
Protocol
नोट: यहां वर्णित प्रक्रियाओं के सभी की समीक्षा की और Louisville संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (प्रोटोकॉल # 13-056) और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल # 13-064) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.
डाई 1. तैयारी
- 0.1% पतला (w / v) पीबीएस में Coomassie खूब ब्लू और एक 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग फिल्टर बाँझ.
Pseudomonas aeruginosa संस्कृति की 2. तैयारी
- टपकाना पहले 15 बजे, एक भी जीवाणु कॉलोनी साथ शोरबा संस्कृति के 3 मिलीलीटर टीका लगाना.
- एक प्रकार के बरतन (200 आरपीएम) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति 15 घंटा आगे बढ़ें.
- अपकेंद्रित्र 30 सेकंड के लिए एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब 12,000 XG में संस्कृति के 1 मिलीलीटर.
- मध्यम निकालें और पीबीएस के 1ml में गोली resuspend.
- पीबीएस में बैक्टीरियल शेयर निलंबन 1:10 के एक विभाज्य पतला और निर्धारित करने के लिए पतला जीवाणु निलंबन के 600 आयुध डिपो उपायबैक्टीरियल एकाग्रता.
- IMIT टीका के लिए 50 μl के वितरण मात्रा का उपयोग, जीवाणु inoculum के वांछित एकाग्रता के लिए पीबीएस में बैक्टीरियल शेयर निलंबन पतला.
3. IMIT टपकाना
- Isoflurane संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में चूहों के एक समूह प्लेस और एक 2 का उपयोग कर anesthetize - 3 isoflurane% / ऑक्सीजन मिश्रण.
- बेहोश करने की क्रिया के प्रारंभिक शुरुआत में, ईमानदार माउस पकड़े, माउस कूड़ा, और गले के पीछे करने के लिए gavage सुई से एक 2% lidocaine के समाधान के 10 μl प्रशासन और समाधान नीचे उपकंठ को पलायन करने की अनुमति देते हैं. संज्ञाहरण चैम्बर के लिए माउस लौटें.
- एक स्थानीय संवेदनाहारी के रूप में पूर्ण प्रभाव में लाने के लिए lidocaine अनुमति देने के लिए 5 मिनट की एक न्यूनतम अनुमति दें.
- चूहों बेहोश करने की क्रिया के वांछित स्तर हासिल किया है जब (60 बीपीएम ~ की दर साँस लेने), बेहोश करने की क्रिया को बनाए रखने के लिए 2% isoflurane कम.
- एक 250 μl गैस तंग में प्रीलोड डाई या बैक्टीरियल inoculumएक 22 जी लंबे कुंद सुई के साथ सटीक सिरिंज फिट.
- पहले सिरिंज का Teflon सवार द्वारा मापा हवा की 150 μl, खींचना. अगला, सिरिंज शरीर पर 200 μl चिह्नित करने के लिए 150 μl निशान से Teflon सवार से आगे बढ़ कर inoculum के 50 μl खींचना.
नोट: नमूना एक intubated माउस में अलग हो जाता है, तो 50 μl निलंबन फेफड़ों भर inoculum वितरित करेंगे जो एक 150 μl हवा कुशन से, पहले वितरित किया जाएगा.
- पहले सिरिंज का Teflon सवार द्वारा मापा हवा की 150 μl, खींचना. अगला, सिरिंज शरीर पर 200 μl चिह्नित करने के लिए 150 μl निशान से Teflon सवार से आगे बढ़ कर inoculum के 50 μl खींचना.
- प्रेरण कक्ष से एक माउस निकालें और एक इंटुबैषेण मंच पर लापरवाह रखना. वेल्क्रो पट्टी से जुड़ी एक हे अंगूठी के साथ अपने कृन्तक hooking, और मंच के लिए वेल्क्रो प्राप्त करके मंच करने के लिए माउस को सुरक्षित करो. एक 45 डिग्री झुकाना करने के लिए माउस उठाएँ.
- एक माइक्रो कपास applicator का उपयोग कर, प्रमुख हाथ का उपयोग कर, एक रोलिंग गति के साथ जीभ वापस लेना.
- Nondominant हाथ से, दोनों एमए करने के लिए एक इंटुबैषेण specula के साथ एक ऑपरेटिंग ओटोस्काप फिट का उपयोगजीभ त्याग intain और उपजिह्वा कल्पना.
- प्रमुख हाथ से, (कैथेटर उजागर कैथेटर के 10 मिमी के साथ एक सिलिकॉन आस्तीन के साथ फिट है) माउस श्वासनली में एक 10 मिमी गहराई तक कैथेटर बैठने, माउस intubate करने के लिए एक 20 जी कैथेटर के माध्यम से पिरोया एक गाइड तार का उपयोग करें. ओटोस्काप / specula निकालें.
- माउस को सही ढंग से संक्षेप में एक रंगीन डाई युक्त 1/16 "स्पष्ट ट्यूबिंग का एक Luer जुड़े लंबाई संलग्न करते हुए nondominant हाथ से कैथेटर प्राप्त करके intubated किया गया है कि पुष्टि करें.
नोट: डाई तेजी से सांस लेने के जवाब में आगे और पीछे की ओर पलायन होगा. - इंटुबैषेण की पुष्टि इस बात पर स्थापित नहीं किया गया तो बाद के चरणों के साथ आगे बढ़ना नहीं है. इंटुबैषेण विफल रहा प्रयास किया, तो, इंटुबैषेण पर एक अतिरिक्त प्रयास के लिए कैथेटर और गाइड तार रीसेट.
नोट: यह माउस के लिए आघात के कारण बिना एक सत्र में एक चूहे के दो से अधिक intubations प्रयास करने unadvisable है. - पर जारीतरल निलंबन / एयर कुशन युक्त परिशुद्धता सिरिंज / कुंद सुई डालने जबकि nondominant हाथ से कैथेटर सुरक्षित.
- सीधे एक भी द्रव गति में फेफड़ों में तरल / हवा बांटना और तुरंत माउस से सुई / कैथेटर को हटा दें.
- एक पिंजरे में माउस लौटें और संज्ञाहरण से वसूली की अनुमति.
आईएमटी डिलिवरी 4. विशेषता
- IMIT टपकाना के बाद, एक उचित समय के बाद टीका में सीओ 2 श्वासावरोध द्वारा माउस euthanize.
- एक विच्छेदन बोर्ड पर euthanized माउस को सुरक्षित और 70% EtOH के एक धार बोतल का उपयोग के साथ सीने और पेट लेना.
- फेफड़ों के दौरान एक इमेजिंग एजेंट के वितरण का मूल्यांकन करते हैं, तो बाँझ तकनीक का उपयोग कर पशु से फेफड़ों को हटाने और इमेजिंग के लिए उपयुक्त के रूप में फेफड़ों प्रदर्शित करते हैं.
नोट:. फेफड़े उचित निर्धारण या cryopreservation के माध्यम से अतिरिक्त ऊतकीय धुंधला तकनीक के लिए तैयार किया जा सकता है </ ली> - संक्रमित फेफड़े के ऊतकों की बैक्टीरियल बोझ का मूल्यांकन करते हैं, तो बाँझ तकनीक का उपयोग कर पशु से फेफड़ों को हटा दें. प्लेस फेफड़ों एक बाँझ में, 1 औंस नमूना बैग preweighed. वजन और नमूना बैग + फेफड़ों का वजन रिकॉर्ड.
- प्रत्येक नमूना बैग + ऊतकों को बाँझ 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें. नमूना बैग reseal.
- नमूना बैग + ऊतक पर एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट रोलिंग सज्जन द्वारा ऊतकों homogenize.
- (अध्ययन किया जा रहा पौंड, या बैक्टीरियल प्रजातियों के रूप में उपयुक्त) अगर प्लेट पर फेफड़ों बाँझ पीबीएस में homogenate और थाली के धारावाहिक dilutions तैयार करें:
- तो अगर प्लेट पर मल्टीचैनल द्वारा तीन प्रतियों नमूने थाली मल्टीचैनल pipettor द्वारा यू-नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में एक छह गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने का संचालन.
- रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर अगर प्लेटें सेते हैं और अगले दिन कॉलोनी बनाने इकाइयों की गणना करें.
Representative Results
IMIT विधि के माध्यम से डाले सामग्री का वितरण कल्पना करने के लिए, 0.1% Coomassie खूब ब्लू डाई के 50 μl एक anesthetized माउस के फेफड़ों में डाले था. माउस तुरंत euthanized किया गया था और फेफड़ों बाँझ शव-परीक्षा से हटा दिया गया. डाई फेफड़ों के सभी खण्डों के लिए दिया गया था कि 1 से पता चलता है.
IMIT विधि के माध्यम से फेफड़ों के लिए दिया बैक्टीरिया की मात्रा, चूहों के तीन समूहों (एन = 3) पी के तीन अलग अलग सांद्रता के साथ डाले थे निर्धारित करने के लिए aeruginosa (1.21 एक्स 10 8, 1.21x10 7, और 1.21 एक्स 10 6 कॉलोनी बनाने इकाइयों [CFU] 50 μl प्रति). इसके तत्काल बाद IMIT टपकाना के बाद, चूहों के फेफड़ों हटाया, euthanized थे, और बैक्टीरियल संख्या inoculums (चित्रा 2) को प्रगणित और तुलना की गई. डाले के inoculum की डिलिवरी फेफड़ों से बरामद inoculum के> 98% के साथ, इस पद्धति के माध्यम से अत्यधिक कुशल हैजानवरों. इसके अलावा, IMIT टपकाना परवाह किए बिना inoculum (= 0.9951 आर 2) की एकाग्रता की अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य था.
चित्रा 1: IMIT टपकाना फेफड़ों भर inoculum वितरित सभी पालियों में वितरित 0.1% Coomassie खूब ब्लू शो नीले रंग के 50 μl के साथ डाले चूहों से फेफड़ों..
चित्रा 2:. फेफड़ों चूहों में बैक्टीरिया की IMIT टपकाना पी के साथ डाले गए थे aeruginosa और फेफड़ों में डाले बैक्टीरिया की संख्या (10 CFU लॉग इन करें - बरामद) का अनुमान inoculum की तुलना में थे (10 CFU लॉग इन करें - वितरित). प्रत्येक वृत्त एक व्यक्ति माउस (के CFU / फेफड़ों के प्रत्येक के लिए N = 3 का प्रतिनिधित्व करता हैबैक्टीरियल खुराक).
Discussion
IMIT टपकाना reproducibly फेफड़ों में सीधे अभिकर्मकों पैदा करने की क्षमता में मौजूदा सांस की बीमारी मॉडल के लिए महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है. यह IMIT तकनीक से करता है जो आदर्श संज्ञाहरण और caging की रसद प्रबंधन करता है, जिनमें से एक दो शोधकर्ताओं की एक टीम के लिए स्थित है जो एक तेजी से दृष्टिकोण, और अन्य है. माउस प्रति 3 मिनट - बड़े अध्ययनों 2 के एक औसत समय प्रतिबद्धता के साथ IMIT का उपयोग किया जा सकता है. दृष्टिकोण एक संवेदनाहारी के रूप में isoflurane के उपयोग में आता है, क्योंकि चूहों वसूली के माध्यम से जानवरों की निगरानी के पशुपालन समय को कम करने, संज्ञाहरण से तेजी से ठीक हो.
IMIT विधि का सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पहलू चूहों intubating की प्रारंभिक कदम है. IMIT प्रदर्शन करने के लिए सीखने के व्यक्तियों को इस पहली कैथेटर नियुक्ति के कदम और कि इंटुबैषेण सुनिश्चित करने डाई आंदोलन के दृश्य पुष्टि के माध्यम से हासिल किया गया है पर ध्यान केंद्रित करने में सक्षम हैं. दृष्टिकोण का लाभ यह है कि फेफड़ों कल्पना हैific टपकाना नई शोधकर्ता दोनों के आत्मविश्वास के साथ-साथ एक मुश्किल जानवर intubate के प्रयास में विशेषज्ञ बढ़ जाती है जो इंटुबैषेण की पुष्टि के उपयोग के माध्यम से सुनिश्चित किया जाता है. एक सफल इंटुबैषेण की संभावना के अनुकूलन के महत्वपूर्ण तत्व हैं: एक गहरी बेहोश करने की क्रिया को प्राप्त करने मैं), द्वितीय) मुंह में specula का सही स्थान के तृतीय) अच्छा गहराई नियुक्ति, उपकंठ का अच्छा दृश्य की अनुमति के लिए पर्याप्त काम कर समय की अनुमति specula जीभ प्रक्रिया के दौरान मुकर रहता है, और प्रक्रिया को आराम और एक स्थिर दृष्टिकोण के साथ आयोजित किया जाता है, ताकि झुकाव मंच का चतुर्थ) उपयोग के शोधकर्ता के हाथों समर्थन करने के लिए इतना है कि.
IMIT प्रक्रिया की सीमाओं में से एक IMIT टपकाना घटनाओं की आवृत्ति से संबंधित है. एक चूक इंटुबैषेण के साथ जुड़े संभावित आघात के कारण, यह दो से अधिक इंटुबैषेण प्रयास (दो याद करते हैं) एक ही सत्र में आयोजित किया जा सिफारिश की है कि नहीं है. IMITइसकी क्षमता में एक उत्कृष्ट क्षमता murine फेफड़ों में चिकित्सा देने के लिए इस्तेमाल किया जाना है, फेफड़ों में अभिकर्मक की बहुत अक्सर वितरण का उपयोग कर जो हालांकि चिकित्सकीय परहेज IMIT के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता. यह IMIT महत्वपूर्ण आघात के कारण बिना एक murine फेफड़ों में अभिकर्मकों देने के लिए दैनिक इस्तेमाल किया जा सकता है कि संभव हो सकता है, लेकिन इंटुबैषेण के साथ जुड़े आघात के बहुमत के रूप में, एक अत्यंत कुशल शोधकर्ता द्वारा आयोजित केवल जब एक चूक इंटुबैषेण घटना के साथ जुड़ा हुआ माना जाता है . इस तरह के उच्च आवृत्ति IMIT स्थानीय पशु चिकित्सकों और IACUC के साथ चर्चा की जानी चाहिए.
IMIT का एक और संभावित सीमा intubated किया जा रहा है जो माउस के आकार है. एक 20 जी कैथेटर इस आकार रेंज में चूहों की श्वासनली के लिए एक उपयुक्त आकार हो पाया था, जहां 22 जी, - ऊपर वर्णित IMIT प्रक्रिया लगभग 17 से चूहों का उपयोग कर विकसित किया गया था. बड़ी कैथेटर सफलतापूर्वक बड़े चूहों में इस्तेमाल किया गया है; IMIT एम के प्रारंभिक विकास> 20 ग्राम हैं जो BALB / ग चूहों में एक 18 जी कैथेटर की एडीई उपयोग. वैकल्पिक कैथेटर आकार इस्तेमाल कर रहे हैं अगर महत्वपूर्ण बात, कुंद सुइयों कैथेटर की लुमेन फिट और बस कैथेटर टिप परे 1mm फैली लंबाई के लिए छंटनी कर रहे हैं जो sourced किया जाना चाहिए. 17 जी की तुलना में छोटे चूहों की इंटुबैषेण संभव हो सकता है, लेकिन आवश्यक विशेषज्ञता की वजह से सिफारिश नहीं है, और छोटे कैथेटर और ऊपर वर्णित हैं से specula के उपयोग की आवश्यकता होगी.
हम पी के अलावा कई श्वसन रोग जनकों की डिलीवरी के लिए IMIT का इस्तेमाल किया है बी सहित aeruginosa, pseudomallei 9 और क्लेबसिएला निमोनिया 10. IMIT मॉडल बी के हमारे अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण प्रगति की है pseudomallei सांस की बीमारी, intranasal टीका बल्कि मानव रोग 9 में मनाया प्रणालीगत रोग समापन बिंदु से चूहों की एक प्रारंभिक, URT संबंधी रुग्णता का कारण बनता है कि पहचान करने के बाद. बी pseudomallei एक टीयर 1 selec हैbiodefense प्रभाव की टी एजेंट, और इस तरह, सांस की बीमारी मॉडल एयरोसोल लोगों तक पहुंचाने के लिए विकसित किया जा रहा है के रूप में जो मॉडल weaponized रोगजनकों के लिए प्रविष्टि की एक संभावित biodefense संबंधित मार्ग. वर्तमान एयरोसोल मॉडल URT और एलआरटी दोनों के संक्रमण में परिणाम है, क्योंकि एक ही संभावित जल्दी रुग्णता phenotypes हम बी की intranasal मॉडल के लिए पहचान की है pseudomallei सांस की बीमारी एयरोसोल मॉडल के लिए आवेदन कर सकते हैं. IMIT मॉडल का भविष्य अनुकूलन चूहों केवल फेफड़ों में लक्ष्य एयरोसोल वितरण के लिए intubated रहे हैं जिसमें एक इंटुबैषेण की मध्यस्थता एयरोसोल वितरण (इमाद), हो सकता है. मैकेनिकल वेंटिलेटर एक aerosolized, तरल आधारित बजाय, रोगाणु चुनौती देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो isoflurane संज्ञाहरण, बनाए रखने के लिए वर्तमान में उपलब्ध हैं.
IMIT फेफड़ों को बैक्टीरिया के वितरण का अनुकूलन के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में शुरू में विकसित की है, लेकिन यह भी माउस फेफड़ों में अन्य अभिकर्मकों के वितरण के लिए आवेदन किया गया था. जिले के रूप मेंऊपर चर्चा हुई, एक कम क्षमता में चूहों परिणाम में यौगिकों के intranasal वितरण, फेफड़ों का लक्ष्य अंग में अभिकर्मकों की अत्यधिक चर वितरण. हम IMIT अपनी> 98% वितरण प्रभावकारिता और multilobar वितरण के साथ दृष्टिकोण अन्य फेफड़ों के वितरण के लिए एक शानदार विकल्प प्रदान करता है कि प्रदर्शन किया है जबकि murine फेफड़ों को पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग अभिकर्मकों की intranasal वितरण, एक 40% वितरण दक्षता 11 झुकेंगे. फेफड़ों के लिए लक्षित वितरण में सुधार के फेफड़े के रोग के उपचार के लिए चिकित्सकीय प्रसव के reproducibility बढ़ाने की क्षमता है. मैं) पर्यावरण फेफड़े परेशानी का प्रभाव, द्वितीय) फेफड़ों के कैंसर प्ररूपी पढ़ाई, III) फेफड़ों विशिष्ट siRNA तोड़े नीचे: IMIT इसी प्रकार के अध्ययन के लिए लाभ की पेशकश कर सकता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
| Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
| Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
| Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
| I.V. Catheter, 20 G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface |
| Gas tight syringe, 250 ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
| Blunt Needle, 22 G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter |
| Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
| Tuberculin syringe, 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Male Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Female Luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
| Sample bag, 1 oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |
References
- Reznik, G. K. Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract. Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).
- Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., et al. Chapter 2. The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine). Fox, J. G. 2, Academic Press. 23-90 (2007).
- Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. O., Thanavala, Y. Tracking the tissue distribution of marker dye following intranasal delivery in mice and chinchillas: a multifactorial analysis of parameters affecting nasal retention. Vaccine. 20, 3209-3220 (2002).
- Eyles, J. E., Spiers, I. D., Williamson, E. D., Alpar, H. O. Tissue distribution of radioactivity following intranasal administration of radioactive microspheres. J Pharm Pharmacol. 53, 601-607 (2001).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 282, 833-839 (2002).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS ONE. 7, (2012).
- Lathem, W. W., Crosby, S. D., Miller, V. L., Goldman, W. E. Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17786-17791 (2005).
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Bioluminescent diagnostic imaging to characterize altered respiratory tract colonization by the Burkholderia pseudomallei capsule mutant. Front Microbiol. 2, 133 (2011).
- Gutierrez, M., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 Secretion System cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. Submitted. , (2014).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS ONE. In revision, (2014).
- Soto-Montenegro, M. L., et al. Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging. Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).
