Summary
Protein nivåer i celler och vävnader är ofta hårt reglerad av balansen mellan produktionen och clearance-protein. Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP), kan släppnings kinetiken av proteiner experimentellt mätas in vivo.
Abstract
Protein stabilitet påverkar många aspekter av biologi och mäta klare kinetik proteiner kan ge viktiga insikter i biologiska system. I FDAP experiment, kan clearance av proteiner inom levande organismer mätas. Ett protein av intresse är märkt med ett photoconvertible fluorescerande protein, uttryckt in vivo och photoconverted, och minskningen i den photoconverted signalen över tiden övervakas. Data sedan utrustad med en lämplig clearancemodellen att bestämma protein halveringstid. Viktigt kan clearance kinetiken av proteinpopulationer i olika fack i organismen undersökas separat genom att tillämpa kompartment-masker. Detta tillvägagångssätt har använts för att bestämma de intra- och extracellulära halveringstider utsöndrade signalproteiner under zebrafisk utveckling. Här beskriver vi ett protokoll för FDAP experiment i zebrafiskembryon. Det bör vara möjligt att använda FDAP att bestämma clearance skinetiken förvarje märkningsbara protein i någon optiskt åtkomlig organism.
Introduction
Nivåerna av proteiner i celler och organismer bestäms av deras produktionshastigheter och clearance. Proteinhalveringstider kan variera från minuter till dagar 1-4. I många biologiska system, stabilisering eller clearance av nyckelproteiner har viktiga effekter på cellulär aktivitet. Modulering av intracellulär proteinstabilitet krävs för cellcykelprogression 5,6, utvecklings signalering 7-9, apoptos 10, och normal funktion och underhåll av nervceller 11,12. Extracellulär proteinstabilitet påverkar fördelningen och tillgången av utsöndrade proteiner, såsom morfogener 13,14, i en vävnad.
Under de senaste decennierna har proteinstabilitet främst bedömts i cellkultur med hjälp radioaktiv puls-märkning eller cykloheximid chase experiment 15. I sådana puls chase experiment, celler antingen transient utsatt för en "puls" av radioaktivt aminosyraprekursorer som införlivas i nysyntetiserade proteiner, eller de är utsatta för cykloheximid, som inhiberar proteinsyntes. Odlade celler samlas sedan vid olika tidpunkter, och antingen immunoprecipitation följt av autoradiografi (i radioaktiva puls chase experiment) eller western blotting (i cykloheximid experiment) används för att kvantifiera clearance av proteinet över tid.
Konventionella proteinstabilitetsanalyser har flera brister. Först, är proteiner i dessa analyser ofta inte uttryckta i sina endogena miljöer, utan snarare i vävnadskultur och ibland i celler från olika arter. För proteiner vars stabilitet är kontextberoende, är detta synsätt problematisk. För det andra är det inte möjligt att följa proteinet clearance i enskilda celler eller organismer över tiden, och data från dessa analyser avspeglar ett genomsnitt av olika populationer av celler vid olika tidpunkter. Eftersom enskilda celler kan ha börjatmed olika mängder protein, kan ha tagit upp den radioaktiva märkningen eller cykloheximid vid olika tidpunkter, eller kan ha olika clearance kinetik, sådana aggregerade data kan vara missvisande. Slutligen när det gäller cykloheximid chase experiment, kan tillsats av proteinsynteshämmare har oavsiktliga fysiologiska effekter som på konstgjord väg kunde ändra proteinstabilitet 16-18. Dessa brister kan undvikas genom att använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP), en teknik som utnyttjar photoconvertible proteiner för att mäta protein clearance dynamiskt i levande organismer 19-25 (se diskussion om begränsningar av FDAP tekniken).
Photoconvertible proteiner är fluorescerande proteiner vars excitation och emissionsegenskaper förändras efter exponering för specifika våglängder av ljus 26. En vanligt använd variant är Dendra2, en "grön-till-röda" photoconvertible protein som initialt har excitation och emissionsegenskaper liknande gröna fluorescerande proteiner, men efter exponering för UV-ljus- "photoconversion" -dess excitation / emissionsegenskaper blir liknar dem hos röda fluorescerande proteiner 23,27. Viktigt kommer nya protein som produceras efter photoconversion inte samma excitation / emissionsegenskaper som photoconverted protein, vilket gör frikoppling av produktion och avslut på photoconversion och observation av endast en pool av photoconverted protein. Märka proteiner av intresse med photoconvertible proteiner ger därmed ett bekvämt sätt att pulsmärkes proteiner i intakta, optiskt åtkomliga levande organismer.
I FDAP analyser (Figur 1A), är ett protein av intresse taggade med photoconvertible protein och uttrycks i en levande organism (Figur 1B). Fusionsproteinet photoconverted, och minskningen i photoconverted signalen över tiden övervakas av fluorescence mikroskopi (Figur 1C). Uppgifterna är sedan försedd med en lämplig modell för att bestämma halveringstiden för fusionsproteinet (figur 1D).
Den FDAP analys som beskrivs här var utformad för att bestämma de extracellulära halveringstider på utsöndrade signalproteiner i zebrafisk embryon under tidig embryogenes 19. Däremot kan anpassas denna inställning till något transparent modellorganism som tål levande avbildning, och kan användas för att övervaka clearance av varje märkningsbara intracellulär eller extracellulär protein. Variationer av den teknik som beskrivs här har utförts i odlade celler 20,23 och Drosophila 22 och mus 21 embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generera en Photoconvertible Fusion Konstruera och injektion dechorionated Zebrafish embryon
- Generera en funktionell konstruktion innehållande proteinet av intresse smält till en grön-till-röd photoconvertible protein (se Diskussion), sedan använda in vitro-transkription för att generera capped mRNA som kodar för fusionsproteinet som i Muller et al., 2012 19.
- Använd pronas att ta bort chorions från cirka 30 zebrafisk embryon vid en cellstadiet. Alternativt manuellt dechorionate embryon använder pincett 28.
Obs: Embryon måste dechorionated för efterföljande avbildning. Om så önskas, kan embryon injiceras genom chorion och dechorionated senare, strax före avbildning.- Gör en 5 mg / ml stamlösning av pronas från Streptomyces grisens i standardzebrafisk embryo medium 19. Vagga försiktigt lösningen vid RT under 10 min för att tillåta proteaset att upplösas. Alikvot 2 ml till mikrocentrifugrör och frysa vid -20 ° C.
- Överför en cell skede embryon till en 5 cm glas diameter eller agaros belagd plast petriskål med ~ 8 ml embryo medium. Tillsätt 2 ml av den upptinade pronas stamlösning till skålen och inkubera vid RT under 5 till 10 min.
- Utsätt embryon för luft eller plast, som kontakt med antingen kommer att orsaka dechorionated embryon att brista. Fyll en 200 ml glasbägare med embryo medium. Överför embryon till bägaren genom att luta petriskålen samtidigt dränka den i mediet.
- Efter embryona har sjunkit till botten av bägaren, häll ut de flesta av embryot mediet, häll sedan färskt embryo medium i bägaren. Den milda virvlande av mediet hälla i bägaren orsakar embryon för att förlora sina försvagade chorions.
- Upprepa steg 1.2.4.
- Överför dechorionated embryon till en agaros belagd injektion skålen 29 med en glas pasteurpipett med en flammade spets. Flamingpipettspetsen förhindrar ojämna kanter från skadade embryon.
- Co-injicera mRNA och en 3 kDa Alexa488-dextrankonjugatet 29,30 (Figur 1B, se Diskussion för föreslagna mRNA och Alexa488-dextran belopp). Injicera direkt in i mitten av cellen (ej gulan) för att säkerställa jämn fördelning av mRNA och fluorescerande färgämne gång klyvning börjar.
Obs: Alexa488 signalen kommer att användas under dataanalys för att generera kompartment masker för att skilja mellan intracellulära och extracellulära fluorescens. - Överför injicerade embryon till en 1-2% -ig belagd väl av en sex-väl plastskål fylld med embryo medium. Inkubera i mörker vid 28 ° C tills embryon har nått sen sfär steget 31 (ca 5 h efter befruktning). Kolla embryon var och en till två timmar under ett stereomikroskop och ta bort eventuellt skräp som genereras av embryon som har dött.
2. Montering Zebrafish embryon för Photoconversion och Imaging på en Inverted konfokalmikroskop
- Använd en stereomikroskop för att identifiera 04:59 friska embryon, och använda en glas pasteurpipett med en flammade tips för att ta bort dem från skålen.
- Mata ut försiktigt embryona i ett mikrocentrifugrör innehållande ~ 1 ml av smält 1% lågsmältande agaros i 1x Danieau s embryo medium (se Material List) (Figur 2A).
Anm: Agarose bör ha en temperatur mellan 40 och 42 ° C; högre temperaturer kan skada embryon. - Rita embryon tillbaka in i pipetten tillsammans med några agaros. Mata försiktigt agarosen och embryon på täckglaset på en glasbotten skålen (Figur 2B). Se till att tjockleken på täckglaset är förenligt med målet på konfokalmikroskop.
- Återanvänd glaspipett om så önskas. För att rengöra rest agaros ur pipetten och förhindra igensättning, snabbt pipett embryo medium upp och ner.Placera en 15 ml rör fyllt med ~ 5 ml embryo medium intill stereomikroskop för detta ändamål.
- Använd en metallsond att placera embryon så att djuret polen (BLASTODERM) är vänd mot täckglaset. Arbeta snabbt eftersom agarosen stelnar i 20-30 sek. Använd stereomikroskopet att övervaka embryon positioner och justera vid behov tills agarosen hårdnar.
- Upprepa steg 2,1-2,4 tills önskat antal embryon har monterats.
Anm: I ett typiskt experiment, kommer fyra agaros droppar innehållande fyra eller fem embryon vardera passar lätt på täckglaset. Omkring 16 embryon kan avbildas under en enda ideal experiment (figur 2C). - När agarosen har stelnat, fyll glasbotten skålen med 1x Danieau s embryo medium.
3. Photoconverting och mäta minskningen av Photoconverted Signal
En 25X eller 40X vatten mål Is lämpligt för storleken och brytningsindex för zebrafisk embryon. Det är bäst att använda immersionsolja med samma brytningsindex som vatten snarare än faktiska vatten, eftersom vatten avdunstar under loppet av fem timmars experimentet. Säkerställ att immersionsoljan är utformad för att användas med en vatten (inte olja) mål.
- Placera en stor droppe immersionsolja på målet att se till att oljefilmen mellan målet och täckglaset inte kommer att bryta eftersom scenen flyttar till olika embryo positioner under avbildning. Säkert placera glas nedre skålen på scenen så att skålen inte kommer att flytta när scenen flyttas. Använd om möjligt en uppvärmd skede vid 28 ° C, den optimala temperaturen för zebrafisk utveckling.
- Definiera varje embryo position i konfokalmikroskop s programpaket. Justera z-djupet för varje embryo, och försöka rikta ungefär samma plan i varje embryo.
OBS: Om 30 um från djuret polen är en good djup eftersom det vid detta djup kuverte lagret av embryot kan undvikas, är bildområdet maxim och ljusspridning är minimal. En enda optisk skiva med en tjocklek på ~ 3,3 nm ger tillräcklig data; finns det ingen anledning att skaffa en z-stack (se avsnitt 5). - Samla två signaler under experimentet: den "gröna" signal från Alexa488-dextrankonjugatet-som kommer att användas under dataanalys för att isolera extracellulär och intracellulär fluorescens-och "röda" signalen från fusionsproteinet efter att det har photoconverted.
- Excite Alexa488 använder en 488 nm laser, och samla avges fluorescens mellan ~ 500 och 540 nm. Obs: Efter photoconversion många grönt till rött photoconvertible proteiner (t.ex. Dendra2) kan vara glada med en 543 nm laser och avger fluorescens mellan ~ 550 och 650 nm. Justera vid behov utifrån photoconvertible protein som används.
- Hämta "pre-photoconversion"Bilder, och konfigurera konfokalmikroskop mjukvara till bild varje av de tidigare definierade positioner (från steg 3.2) med lämpliga avbildningsförhållandena var 10 eller 20 minuter för en fem timmars tidsförlopp (se avsnitt 5 och Diskussion).
- Att photoconvert fusionsproteinet, byta till en 10X objektiv och exponera grupper av embryon för UV-ljus från en kvicksilverbåglampa med ~ 300-400 nm excitationsfilter vid 100% utgång i 2 min. Flytta fokus längs z-axeln för att främja en enhetlig photoconversion (se avsnitt 5). Se till att immersionsolja inte droppa på 10x mål under photoconversion.
Obs: förskjutning av fokus under photoconversion kunde automatiseras för att undvika variabilitet bland praktiker. - Växla tillbaka till 25X eller 40X objektiv direkt efter photoconversion. Se till att de tidigare definierade positioner från steg 3.2 är fortfarande korrekt. Om skålen skiftat under photoconversion, åter definiera lägena för de embryon.
- Starta programmet skapade i steg 3,4 och tillåta avbildning fortsätta under 5 h. Notera den tid som förflutit mellan photoconversion och början av avbildning för varje embryo.
- Ibland kolla på experimentet. Övervaka nivån på Danieau medium och tillsätt mer om det behövs. Starta om programmet om det har fastnat.
- För att bestämma bakgrundsfluorescensvärden som kommer att användas under dataanalys för att uppskatta asymptot av en exponentiellt avtagande modell, inkluderar vissa embryon som injicerats med Alexa488-dextran men inte mRNA i experimentet. För att bestämma instrumentets buller, som även kommer att användas under efterföljande dataanalys, förvärva en bild i frånvaro av ett prov.
4. Analysera data med PyFDAP
- Kontrollera visuellt tidskurs dataset från varje embryo. Kasta dataset från embryon som dött under imagning, som skiftade avsevärt, som har mycket låga nivåer av photoconverted signal, eller som innehåller regioner av celler som ser ovanligt och har slutat röra sig och dividera (typiskt av skadade eller sjuka embryon).
Notera: Ibland, Bubblor i immersionsolja eller andra artefakter kommer att visas i en eller två bilder i en annars användbar datauppsättning. Notera eventuella bilder som innehåller artefakter; de kommer att kasseras senare, och de återstående tidpunkter från en sådan datamängd kan fortfarande analyseras. - Använd Python-baserade mjukvarupaket PyFDAP att analysera FDAP uppgifter. PyFDAP beräknar halveringstider genom att bestämma den genomsnittliga intracellulära och extracellulära röd fluorescens intensitet i varje bild och anpassning av data med en exponentiellt avtagande funktion 56 (Figur 3).
- Hämta PyFDAP (se Materiallista).
- Använd PyFDAP att separera intracellulär och extracellulär photoconverted signal (figur 3A, B). Osse på Alexa488 signal, vilket är strängt intracellulär, för att skapa en intracellulär mask. Applicera denna mask till motsvarande röda kanalen bilden för att förhindra intracellulära pixlar från att beaktas vid beräkning genomsnittliga extracellulärt intensitet. För att mäta genomsnittlig intracellulär intensitet, invertera masken.
- I PyFDAP, visa de maskerade bilder som genereras i steg 4.2.2. Inspektera dessa bilder och kasta dataset där masker inte korrekt skiljer intracellulära från extracellulära rummet (detta bör vara sällsynta, notera att cellmembranen ingår i bilder där extracellulära rummet har maskerade, men de kunde tas bort genom att ändra tröskel algoritm eller genom att införa ett membranmask (t.ex., med användning av membran-GFP)). Också kasta några enstaka bilder som innehåller artefakter (t.ex. Bubblor i immersionsolja) identifierade i steg 4.1.
- Använd PyFDAP att beräkna genomsnittliga extracellulära och intracellulära fluorescensintensiteter för each image. PyFDAP beräknar dessa medelvärden genom att summera intensiteterna pixlar som faller utanför masken och dividera med det totala antalet pixlar summerade.
- Montera fluorescens data (Figur 3C) med följande exponentialfunktion:
där t är tiden efter photoconversion, c (t) är intensiteten vid ett visst värde på t, c är 0 intensiteten vid t = 0, är clearance hastighetskonstanten k och y 0 är asymptoten att funktionen närmar som fluorescens minskar (Figur 1D). y 0 kan begränsas baserat på mätningar i steg 3,8 19. - Använd PyFDAP att beräkna extracellulära och intracellulära proteinhalveringstider (τ) från clearance hastighetskonstant (k) med hjälp av följande samband:
5. Kontroll Experiment att bedöma Fotoblekning, Oavsiktlig Photoconversion och Photoconversion Enhetlighet
- Uppskatta fotoblekning
Obs: Fotoblekning kan orsaka en arte minskning i fluorescensintensitet som återspeglar blekningsegenskaperna hos fluorescerande proteinet utöver clearance av proteinet av intresse.- För att bedöma möjliga fotoblekning, utför en uppsättning FDAP experiment med 10 min intervaller mellan avbildning och en andra uppsättning med 20 min intervaller mellan avbildning (Figur 4). Analysera data från båda uppsättningarna av experiment med användning av PyFDAP enligt beskrivningen i avsnitt 4.
- Jämför de halveringstider från 10 och 20 minuters intervall experiment. Längre halveringstider från 20 min intervall experiment tyder på betydande fotoblekning. Om de halveringstider från båda försöken är identiska, Photobleaching är inte en betydande oro.
- Alternativt, bedöma fotoblekning genom att förvärva en serie ~ 30 bilder direkt efter photoconversion. En signifikant minskning av fluorescensintensitet indikerar betydande fotoblekning.
- Om fotoblekning upptäcks, använd lägre lasereffekt, minskar imaging tid, eller överväga att använda en mer foto photoconvertible protein 32.
- Uppskatta oavsiktlig fotoomvandling.
Obs: Dendra2 kan photoconverted använder 488 nm belysning 27. När spännande Alexa488 med 488 nm laser som beskrivs i steg 3.3.1, oavsiktlig photoconversion och därför en arte ökning av sken halveringstiden för proteinet av intresse är möjlig. Men har vi och andra 33 funnit att 488 nm belysning är en ineffektiv metod för photoconversion i zebrafiskembryon.- Använd kontrollexperiment som beskrivs i steg 5.1.1 att upptäcka oavsiktlig photoconversion. Jämför de halveringstider från 10 och 20 minuters intervall experiment. Kortare halveringstider från 20 min intervall experiment tyder på betydande oavsiktlig photoconversion. Om halveringstider från båda experimenten är identiska, är oavsiktlig photoconversion inte en betydande oro.
- Om oavsiktlig photoconversion upptäcks, använd en lägre 488 nm laser makt och kortare avbildningstider för att undvika misstag photoconverting Dendra2.
- Bedömning photoconversion enhetlighet.
Obs: Om photoconversion är förspänd mot djuret polen av embryot, kommer minskningen i fluorescens påverkas av protein diffusion eller cellrörelse till djupare plan (figur 5A).- För att avgöra om photoconversion är jämn, uttrycka ett utsöndrat photoconvertible protein (för experiment med extracellulära fusionsproteiner) eller en cytoplasmatisk photoconvertible protein (för experiment med intracellulära fusionsproteiner). Photoconvert som vanligt, thöna skaffa ett z-stack som omfattar större delen av BLASTODERM varje 20 min under 80 min.
- Om photoconversion är partisk mot djuret polen, kommer fluorescensintensiteten i djupare plan öka över tiden på grund av diffusion eller cellrörelse (figur 5B). Om olikformig photoconversion upptäcks, fokusera djupare in embryona under photoconversion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FDAP har använts för att bestämma de halveringstider av extracellulära signalerande proteiner i zebrafiskembryon 19. En av dessa proteiner, kisa, inducerar uttryck av mesendodermal gener under foster 34. Kisa-Dendra2 aktiverar uttryck av mesendodermal gener på nivåer som liknar otaggad Squint, vilket framgår av QRT-PCR och in situ hybridisering analyser 19. Embryon samar injicerades med Alexa488-dextran och mRNA som kodar Squint-Dendra2 och utsattes för FDAP analysen. En minskning av den extracellulära photoconverted signalintensiteten över tiden är tydlig (Figur 4A). Cellulära intensitetsprofiler från 23 embryon genererades med hjälp PyFDAP. Den resulte uppgifter försågs i PyFDAP med ett första ordningens clearance kinetik modell, och en genomsnittlig clearance hastighetskonstant k av 1,00 x 10 -4 / sek, vilket motsvarar en genomsnittlig halveringstid τ av 116 minuter, bestämdes. Liknande intensitetsprofilens och clearance hastighetskonstant erhölls när intervallen mellan avbildning var 10 eller 20 minuter, vilket tyder på att fotoblekning eller oavsiktlig photoconversion inte signifikant bidrar till förändringar intensitet (Figur 4B).
Figur 1. Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP) översikt. (A) Workflow av en FDAP experiment. (B) Injektion av mRNA och ett fluorescerande färgämne i en zebrafisk embryo vid en cellstadiet. Protein produceras från mRNA som ett embryo utvecklas över ca 5 h före avbildning. Färgämnet etiketter celler (gröna cirklar). (C) Fusionsproteinet photoconverted användning av en UV puls, och minskningen i intensiteten hos den photoconverted signalen över tiden övervakas. (D) Uppgifterna är försedda med en exponentiellt avtagande funktion för att få ett godkännande hastighetskonstant (k) och halveringstider (τ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Monteringszebrafisk embryon för FDAP experiment. (A) zebrafisk embryon (BLASTODERM = vit, äggula = svart) överförs från embryo medium (blå) i smält agaros (gul). (B) Embryon och agaros placeras på täckglas av en glasbottnad skål. Embryon sedan manuellt positionerad så att djuret polytorna täckglaset. Ett tvärsnitt av en glas nedre skålen visas. (C) Schematisk översikt av en glasbottnad skål med flera agaros droppar innehållande fyra embryon vardera (se tittar ner i skålen).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dataanalys med användning PyFDAP. (A) PyFDAP använder Otsu tröskling algoritmen 35 för att generera inträ- och extracellulära masker från den intracellulära Alexa488 signalen (grön). (B) Photoconverted signal (röd) från ett embryo som uttrycker ett utsöndrat Dendra2 fusionsprotein (Squint-Dendra2 19). Genomsnittlig extra- och intracellulära fluorescensintensiteter beräknades med maskerna som visas i (A). Utrymmet utanför embryot uteslöts från dessa beräkningar genom att kasta pixlar utanför den gula cirkeln. (C) PyFDAP skärmdump som visar extracellulära intensitetsdata från en FDAP experiment (svart cirlarna) försedd med en exponentiellt avtagande funktion (röd streckad linje). Den extracellulära halveringstiden indikeras av den röda pilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representant FDAP resultat. (A) En representant embryo som uttrycker utsöndrat Squint-Dendra2 strax före photoconversion (längst till vänster) och 27, 87 och 287 min efter photoconversion. (B) För att kontrollera för fotoblekning och oavsiktlig photoconversion (se avsnitt 5), har experiment med 10 eller 20 minuters intervall utförs (data från Müller et al., 2012 19). I PyFDAP ades extracellulära intensitetsprofiler genererade, försedd med exponentiellt minskande funktioner, och normaliseras genom subtracting den inpassade y 0 värde från varje datapunkt och dividera med inpassade c 0 värde. Data från 10 min (svart, n = 11) och 20 minuter (blå, n = 12) intervall experiment var sedan medelvärdesbildas, respektive. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Bedöma photoconversion enhetlighet. (A) Icke-uniform photoconversion av ett extracellulärt protein kan leda till en felaktigt kort skenbar halveringstid om photoconverted protein diffunderar in djupare plan över tiden. (B) För att avgöra om photoconversion är jämn, ett z-stack som täcker större delen av BLASTODERM förvärvas vid flera tidpunkter efter photoconversjon. Fluorescensintensitet ökar i djupare plan över tiden om photoconversion var oenhetlig (observera att ljusspridning orsakar djupare plan visas dimmer än högre plan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgången för en FDAP experiment bygger på alstringen av en funktionell photoconvertible fusionsprotein. Märka ett protein kan påverka dess biologiska aktivitet och / eller biofysiska egenskaper, inklusive dess lokalisering, löslighet och stabilitet 36-41. Var beredd på att testa aktiviteten av flera olika fusionskonstruktioner för att hitta en som är aktiv. Vi har funnit att ändra läget på den photoconvertible proteinet i förhållande till proteinet av intresse eller användning av längre linkers (t.ex., med användning av aminosyrasekvensen LGDPPVAT 19) kan öka aktiviteten av fusionsproteinet. I fallet med signalproteiner, kan aktiviteten av fusionsproteinet bestäms genom att testa dess förmåga att inducera uttryck av målgener 19. QRT-PCR eller in situ hybridisering ger goda avläsning av målgenuttryck 19. Notera att protokollet som beskrivs här är utformad för att bestämma stabiliteten hos proteineri början zebrafisk embryot och skulle kräva modifiering för att bedöma proteinstabilitet i andra sammanhang.
Den gröna till röda photoconvertible protein Dendra2 27 har använts med framgång i zebrafisk FDAP experiment 19 (Figur 4), men andra alternativ finns 26,42. För att undvika eventuella artefakter pga aggregering av fusionsproteinet, välj en mono photoconvertible protein. Photoactivatible proteinerna kan också användas i FDAP-analyser 20-22,26.
Innan du utför en FDAP experiment, flera aspekter av protokollet måste optimeras. Injicera olika mängder mRNA för att bestämma den lägsta mängd som ger användbar signal efter photoconversion; ~ 50 pg mRNA är en bra utgångsbelopp. För att skapa meningsfulla compartmental masker (Figur 3), måste Alexa488 signalen vara stark nog atttävla mot signalen från den icke-photoconverted fusionsprotein som ständigt framställs från det injicerade mRNA; injicera mellan 0,2 och 4 ng Alexa488-dextran att hitta den optimala mängden fluorescerande färg. Hitta den optimala post-omvandlingsavbildningsbetingelser och använder samma villkor för alla experiment med en given konstruktion. Använd god kvantitativ avbildning praktiserar 43, och välja en lämplig dynamiskt omfång för att undvika mättade pixlar i den röda kanalen. Bestäm lämplig avbildningsintervallet för varje fusionsprotein. Proteiner med mycket korta halveringstider kan kräva mer frekvent avbildning över en kortare total tidsperiod. Etablera den optimala photoconversion teknik baserad på organismen och photoconvertible protein som används. Vi beskriver en robust photoconversion metod med en kvicksilverbåglampa i steg 3.5, men Dendra2 kan också photoconverted med en 405 33 eller 488 nm laser 27.
En limitation av denna FDAP protokollet är att överuttryck av proteinet av intresse krävs. Överuttryck kan påverka proteinstabilitet, till exempel genom onormal uttryck av andra gener som modifierar proteinets klare kinetik 14,44. Om proteinet av intresse är en signalerande molekyl, överväga att utföra experiment i närvaro av ett signalerings inhibitor för att bestämma om blockering expression av målgener påverkar proteinets stabilitet. I framtiden kan det bli möjligt att generera transgena embryon uttrycker photoconvertible fusioner under kontroll av endogena uttryckselement 45-50. Om transgena embryon producera tillräckligt signal, FDAP experiment i en icke-överuttryck sammanhanget är tänkbara, kanske med hjälp ljus ark mikroskopi att observera fluorescens minskning i hela embryot 51.
Möjliga ytterligare tillämpningar av FDAP inkluderar undersöka mekanismerna that reglera proteinstabilitet genom att undersöka effekterna av olika störningar (t.ex. uttryck av förmodade proteaser) eller proteinmodifieringar (t.ex. fosforylering) på stabilitet. Till exempel, de faktorer som styr den extracellulära stabiliteten av Squint är för närvarande okända. Många utsöndrade utvecklings signaler internaliseras av celler 52-55, vilket skulle kunna bidra till clearance av skelning och andra ligander från det extracellulära utrymmet. FDAP experiment där interna är blockerad kan ge information om mekanismer som styr extracellulärt protein avslut.
I motsats till konventionella analyser för att mäta proteinstabilitet 15, erbjuder FDAP en mikroskopi baserat alternativ där clearance av proteiner kan följas över tid inom levande organismer. Liknande metoder har använts för att övervaka protein clearance i andra än zebrafiskembryon modellsystem 20-23. Denna FDAP protokoll har potential att vara anpassad för att bestämma halveringstiden för varje märkningsbara protein i biologiska system där levande avbildning är möjlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jeffrey Farrell, James Gagnon, och Jennifer Bergmann för kommentarer på manuskriptet. KWR stöddes av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under utvecklingen av FDAP analysen. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH AFS och med bidrag från den tyska Research Foundation (Emmy Noether Program), Max Planck Society, och Human Frontier Science Program (Career Development Award) till PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
- Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Parry, D. H., O'Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
- Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
- Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
- MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
- Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
- Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
- Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
- Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
- Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
- Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
- Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
- Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
- Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
- Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
- Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
- Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
- Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
- Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
- Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
- Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
- Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
- Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
- Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
- Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
- Bläßle, A., Müller, P. PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, forthcoming (2014).
