Summary
Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l'équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo.
Abstract
la stabilité des protéines influence de nombreux aspects de la biologie, et de mesurer la cinétique de libération de protéines peut fournir des informations importantes sur les systèmes biologiques. Dans les expériences FDAP, la clairance de protéines dans les organismes vivants peut être mesurée. Une protéine d'intérêt est marquée avec une protéine fluorescente photoconvertible, exprimée in vivo et photoconverted, et la diminution du signal dans le temps photoconverted est surveillée. Les données sont ensuite muni d'un modèle d'autorisation approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine. Fait important, la cinétique de libération des populations de protéines dans les différents compartiments de l'organisme peuvent être examinées séparément en appliquant des masques à compartiments. Cette approche a été utilisée pour déterminer les demi-vies intra- et extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées pendant le développement du poisson zèbre. Ici, nous décrivons un protocole pour des expériences FDAP dans embryons de poisson zèbre. Il devrait être possible d'utiliser FDAP pour déterminer la cinétique de libération detoute protéine tagable dans tout organisme optiquement accessible.
Introduction
Les niveaux de protéines dans des cellules et des organismes sont déterminés par leurs taux de production et de dégagement. Protéines demi-vie peut varier de quelques minutes à 1-4 jours. Dans de nombreux systèmes biologiques, la stabilisation ou la clairance de protéines clés a des effets importants sur l'activité cellulaire. La modulation de stabilité de la protéine intracellulaire est nécessaire pour la progression du cycle cellulaire de 5,6, la signalisation du développement 7-9, 10 l'apoptose, et la fonction normale et le maintien des neurones 11,12. La stabilité des protéines extracellulaires affecte la distribution et la disponibilité des protéines sécrétées, telles que 13,14 morphogènes, dans un tissu.
Au cours des dernières décennies, la stabilité des protéines a été évaluée principalement dans la culture de cellule à l'aide d'impulsions marquage radioactif ou d'expériences de chasse cycloheximide 15. Dans ces expériences pulse-chase, les cellules sont soit transitoirement exposées à un «pouls» de aminés radioactifsprécurseurs acides qui sont incorporés dans des protéines nouvellement synthétisées, ou ils sont exposés à la cycloheximide, qui inhibe la synthèse des protéines. Les cellules cultivées sont ensuite recueillies à différents points dans le temps, ainsi que d'une immunoprécipitation suivie d'une autoradiographie (en radioactives expériences pulse-chase) ou western blot (dans des expériences de cycloheximide) est utilisé pour quantifier la clairance de la protéine au fil du temps.
Classiques tests de stabilité des protéines présentent plusieurs inconvénients. Tout d'abord, les protéines dans ces dosages sont souvent pas exprimées dans leurs environnements endogènes, mais plutôt dans une culture tissulaire et parfois dans des cellules provenant d'espèces différentes. Pour les protéines dont la stabilité dépend du contexte, cette approche est problématique. Deuxièmement, il ne est pas possible de suivre la clairance de la protéine dans des cellules ou des organismes individuels au cours du temps, et les données provenant de ces essais reflète une moyenne de différentes populations de cellules à différents points dans le temps. Depuis cellules individuelles peuvent avoir commencéavec différentes quantités de protéines, peut avoir pris l'étiquette ou cycloheximide radioactifs à des moments différents, ou peuvent avoir différents cinétique d'élimination, ces données agrégées peuvent être trompeuses. Enfin, dans le cas d'expériences de chasse cycloheximide, l'addition de l'inhibiteur de la synthèse des protéines peut avoir des effets physiologiques non désirées qui pourraient modifier artificiellement la stabilité des protéines de 16 à 18. Ces lacunes peuvent être évités en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), une technique qui utilise des protéines photoconvertible pour mesurer la clairance de la protéine dynamiquement dans les organismes vivant 19-25 (voir Discussion des limitations de la technique FDAP).
Photoconvertible protéines sont des protéines fluorescentes dont excitation et d'émission propriétés changer après une exposition à des longueurs d'onde spécifiques de la lumière 26. Une variante couramment utilisé est Dendra2, une protéine "vert au rouge» photoconvertible qui a initialement excitations et d'émission des propriétés similaires aux protéines fluorescentes vertes, mais après une exposition à "la photoconversion" de -son excitation UV / propriétés d'émission deviennent semblables à celles des protéines fluorescentes rouges 23,27. Surtout, nouvelle protéine produite après photoconversion ne aura pas les mêmes propriétés d'excitation / émission que la protéine photoconverted, permettant découplage de la production et de la clairance à la photoconversion et l'observation de seulement une piscine de protéines photoconverted. Marquage des protéines d'intérêt avec des protéines photoconvertible fournit ainsi un moyen pratique d'impulsion-étiquette protéines dans les organismes vivants intacts, optiquement accessibles.
Dans les dosages de FDAP (Figure 1A), une protéine d'intérêt est marquée avec une protéine photoconvertible et exprimé dans un organisme vivant (figure 1B). La protéine de fusion est photoconverted, et la diminution du signal photoconverted cours du temps est suivie par fluorescenMicroscopie CE (figure 1C). Les données sont ensuite équipé d'un modèle approprié pour déterminer la demi-vie de la protéine de fusion (Figure 1D).
Le dosage FDAP décrit ici a été conçu pour déterminer les demi-vies extracellulaires de protéines de signalisation sécrétées dans embryons de poisson zèbre au début de l'embryogenèse 19. Cependant, cette approche peut être adapté à tout organisme modèle transparent qui tolère l'imagerie en direct, et pourrait être utilisé pour surveiller le jeu de toute protéine intracellulaire ou extracellulaire tagable. Variations de la technique décrite ici ont été réalisées dans des cellules cultivées 20,23 et 22 drosophile et la souris 21 embryons.
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Protocol
1. Création d'un Fusion photoconvertible construire et d'embryons de poissons zèbres Injecter dechorionated
- Générer une construction fonctionnelle contenant la protéine d'intérêt fusionnée à une protéine du vert au rouge photoconvertible (voir Discussion), puis utilisez la transcription in vitro pour générer plafonné ARNm codant pour la protéine de fusion comme dans Müller et al., 2012 19.
- Utilisez pronase pour enlever les chorions d'environ 30 embryons de poisson zèbre au stade unicellulaire. Alternativement, dechorionate manuellement embryons en utilisant une pince 28.
Remarque: Les embryons doivent être dechorionated pour l'imagerie ultérieure. Si on le souhaite, les embryons peuvent être injectés à travers le chorion et dechorionated plus tard, juste avant l'imagerie.- Faire un ml de solution 5 mg / stock de pronase de Streptomyces griseus dans le milieu de embryon de poisson zèbre standard de 19. Roche doucement la solution à température ambiante pendant 10 min pour permettre à la protéase de se dissoudre. Aliquote 2 mL dans des microtubes et le gel à -20 ° C.
- Transfert des embryons au stade de cellule unique à un verre d'un diamètre de 5 cm ou boîte de Petri en matière plastique revêtue d'agarose contenant ~ 8 ml de milieu d'embryon. Ajouter 2 ml de solution décongelé pronase boursier à l'antenne et incuber à température ambiante pendant 5 à 10 min.
- Évitez d'exposer les embryons à l'air ou en plastique, que le contact avec soit provoquera embryons dechorionated la rupture. Remplissez un récipient en verre de 200 ml avec le milieu de l'embryon. Transférer les embryons dans le bécher en inclinant la boîte de Pétri en plongeant dans le milieu.
- Après les embryons se sont installés au fond du gobelet, versez plus de la moyenne de l'embryon, puis versez moyen d'embryons frais dans le bécher. Le tourbillonnant légère du milieu verser dans le bécher provoque embryons perdent leurs chorions affaibli.
- Répétez l'étape 1.2.4.
- Transférer les embryons dechorionated dans un plat d'injection agarose revêtu 29 en utilisant une pipette Pasteur en verre avec une pointe flammé. Flamboyantla pointe de la pipette empêche les contours crénelés des embryons blessant.
- Co-injecter l'ARNm et 3 kDa Alexa488-dextran conjugué 29,30 (figure 1B; voir discussion pour suggéré ARNm et les montants Alexa488-dextran). Injecter directement dans le centre de la cellule (et non le jaune) afin d'assurer une distribution uniforme de l'ARNm et une fois colorant fluorescent clivage commence.
Remarque: Le signal Alexa488 sera utilisé lors de l'analyse des données afin de générer des masques compartimentés afin de distinguer entre la fluorescence intracellulaire et extracellulaire. - Transfert embryons injectés à un puits d'agarose revêtues 1-2% d'un plat à six puits en plastique rempli avec le milieu de l'embryon. Incuber dans l'obscurité à 28 ° C jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade de la sphère fin 31 (environ après la fécondation de 5 h). Vérifiez embryons chacun de deux heures sous un stéréomicroscope et enlever tous les débris générés par les embryons sont morts.
2. Montage embryons de poissons zèbres Photoconversion et imagerie sur un microscope confocal inversé
- Utilisez un stéréomicroscope pour identifier une à cinq embryons sains, et d'utiliser une pipette Pasteur en verre avec une pointe flammé pour les retirer de l'antenne.
- Éjecter délicatement les embryons dans un tube à centrifuger contenant ~ 1 ml de fondu 1% agarose bas point de fusion dans un milieu d'embryon de 1x Danieau (voir list des matériaux) (figure 2A).
Remarque: Agarose doit avoir une température comprise entre 40 et 42 ° C; des températures plus élevées pourraient endommager les embryons. - Dessiner les embryons de retour dans la pipette avec quelques agarose. Éjecter délicatement l'agarose et les embryons sur la vitre du couvercle d'un plat à fond de verre (figure 2B). Se assurer que l'épaisseur de la vitre de protection est compatible avec l'objectif de microscope confocal.
- Re-utiliser la pipette de verre, si désiré. Pour nettoyer l'agarose résiduel hors de la pipette et éviter le colmatage, rapidement milieu pipette d'embryons de haut en bas.Placer un tube de 15 ml remplie de ~ 5 ml de milieu d'embryon à côté du stéréomicroscope à cet effet.
- Utilisation d'une sonde en métal pour positionner les embryons de sorte que le pôle animal (de blastoderme) fait face à la vitre de protection. Travaillez rapidement depuis l'agarose se solidifie en 20-30 sec. Utilisez le stéréomicroscope pour surveiller les positions des embryons et réajuster si nécessaire jusqu'à ce que l'agarose durcit.
- Répétez les étapes 2.1 à 2.4 jusqu'à ce que le nombre souhaité d'embryons a été monté.
Remarque: Dans une expérience typique, quatre gouttes agarose contenant quatre ou cinq embryons chacun se adaptera facilement sur le couvercle en verre. Environ 16 embryons peuvent être visualisés au cours d'une seule expérience idéale (figure 2C). - Lorsque la gélose a solidifié, remplir la cuve à fond de verre avec du milieu de l'embryon de 1x Danieau.
3. Photoconverting et mesure de la diminution de la Signal Photoconverted
Un objectif 25X ou 40X eau is approprié à la taille et l'indice de réfraction d'embryons de poisson zèbre. Il est préférable d'utiliser de l'huile d'immersion avec le même indice de réfraction que l'eau plutôt que de l'eau réelle, car l'eau va se évaporer au cours de l'expérience de cinq heures. Se assurer que l'huile à immersion est conçu pour être utilisé avec une eau (pas d'huile) objectif.
- Placez une grande goutte d'huile d'immersion sur l'objectif de se assurer que le film d'huile entre l'objectif et le verre de couverture ne se cassera pas que la scène se déplace vers différentes positions de l'embryon au cours de l'imagerie. Fixer solidement le plat à fond de verre sur la scène de telle sorte que le plat ne passeront pas si les coups de théâtre. Si possible, utilisez un stade chauffé à 28 ° C, la température optimale pour le développement du poisson zèbre.
- Définir la position de chaque embryon dans le logiciel du microscope confocal. Réglez la profondeur z pour chaque embryon, et tenter de cibler à peu près le même plan dans chaque embryon.
Remarque: Environ 30 pm du pôle animal est un allerod profondeur depuis à cette profondeur de la couche enveloppante de l'embryon peut être évitée, zone d'imagerie est maximisée, et diffusion de la lumière est minime. Une tranche optique unique avec une épaisseur de 3,3 um ~ fournit suffisamment de données; il ne est pas nécessaire d'acquérir un z-pile (voir la section 5). - Recueillir deux signaux au cours de l'expérience: le signal "vert" de l'Alexa488-dextrane conjugué, qui sera utilisé lors de l'analyse des données d'isoler extracellulaire et intracellulaire par fluorescence et le signal "rouge" de la protéine de fusion après son photoconverted.
- Excite Alexa488 utilisant un laser de 488 nm, et de recueillir fluorescence émise entre ~ 500 et 540 nm. Remarque: Après photoconversion, beaucoup vert au rouge protéines photoconvertible (par exemple, Dendra2) peut être excité avec un laser 543 nm et émettent fluorescence entre ~ 550 et 650 nm. Réglez si nécessaire en fonction de la protéine photoconvertible utilisé.
- Acquérir "pré-photoconversion"Images, et de configurer le logiciel du microscope confocal à l'image de chacune des positions précédemment définies (de l'étape 3.2) avec les conditions d'imagerie appropriés tous les 10 ou 20 minutes pour un cours de temps de cinq heures (voir la section 5 et Discussion).
- Pour photoconvert la protéine de fusion, passer à un objectif 10X et d'exposer des groupes d'embryons à la lumière UV provenant d'une lampe à vapeur de mercure avec un filtre ~ 300-400 nm d'excitation à la sortie de 100% pendant 2 min. Détourner l'attention long de l'axe z pour promouvoir photoconversion uniforme (voir la section 5). Assurez-vous que l'huile d'immersion ne coule pas sur l'objectif 10x lors de photoconversion.
Remarque: Le déplacement de mise au point pendant photoconversion pourrait être automatisé afin d'éviter la variabilité des expérimentateurs. - Revenez à l'objectif 25X ou 40X immédiatement après photoconversion. Veiller à ce que les positions définies précédemment de l'étape 3.2 sont toujours exactes. Si le plat déplacé pendant photoconversion, re-définir les positions des embryons.
- Démarrez le programme créé à l'étape 3.4 et permet l'imagerie de continuer pendant 5 heures. Noter le temps écoulé entre le début et photoconversion de formation d'image pour chaque embryon.
- Vérifiez de temps sur l'expérience. Surveiller le niveau de milieu de Danieau et ajouter plus si nécessaire. Redémarrez le logiciel se il est en panne.
- Afin de déterminer les valeurs de fluorescence de fond qui seront utilisés au cours de l'analyse des données pour estimer l'asymptote un modèle de décroissance exponentielle, inclure des embryons qui ont été injectés avec Alexa488-dextrane mais non l'ARNm dans l'expérience. Afin de déterminer le bruit de l'instrument, qui sera également utilisé au cours de l'analyse des données ultérieur, acquérir une image en l'absence d'un échantillon.
4. Analyser les données en utilisant PyFDAP
- Inspecter visuellement le temps des ensembles de données de cours de chaque embryon. Jeter ensembles de données à partir d'embryons morts durant imagING, qui a déplacé de manière significative, qui ont de très faibles niveaux de signaux photoconverted, ou qui contiennent des régions de cellules qui ressemblent inhabituel et ont cessé de bouger et en divisant (typique d'embryons blessés ou malades).
Remarque: Parfois, des bulles dans l'huile d'immersion ou d'autres artefacts apparaissent dans une ou deux images dans un ensemble de données autrement utilisable. Notez toutes les images qui contiennent des artefacts; ils seront rejetées plus tard, et les points de temps restants de cet ensemble de données peuvent être analysées. - Utilisez le logiciel PyFDAP en Python pour analyser les données FDAP. PyFDAP calcule la demi-vie en déterminant l'intensité de fluorescence intracellulaire et extracellulaire rouge moyen dans chaque image et d'ajustement des données avec une fonction décroissante de façon exponentielle 56 (figure 3).
- Télécharger PyFDAP (voir Liste des matériaux).
- Utilisation PyFDAP pour séparer le signal intracellulaire et extracellulaire photoconverted (figure 3A, B). Nouse le signal Alexa488, qui est strictement intracellulaire, pour créer un masque intracellulaire. Appliquez ce masque à l'image du canal de rouge correspondant à éviter pixels intracellulaires d'être considérés lors du calcul de l'intensité moyenne extracellulaire. Pour mesurer l'intensité intracellulaire moyenne, inverser le masque.
- Dans PyFDAP, afficher les images masqués générés à l'étape 4.2.2. Inspecter visuellement ces images et jeter des ensembles de données dans laquelle masques ne distinguent pas exactement intracellulaire de l'espace extracellulaire (ce devrait être rare; noter que les membranes cellulaires sont inclus dans des images où l'espace extracellulaire a été masqués, mais ils pourraient être supprimés en modifiant le seuil algorithme ou en introduisant un masque de membrane (par exemple, en utilisant une membrane-PCP)). Écartent également toute simples images contenant des objets (par exemple, des bulles dans l'huile d'immersion) identifiés dans l'étape 4.1.
- Utilisez PyFDAP pour calculer les intensités de fluorescence extracellulaires et intracellulaires moyennes pour each image. PyFDAP ces moyennes calcule en additionnant les intensités des pixels qui tombent à l'extérieur du masque et en divisant par le nombre total de pixels additionnés.
- Monter les données de fluorescence (figure 3C) avec la fonction exponentielle suivante:
où t est le temps post-photoconversion, c (t) est l'intensité à une valeur donnée de t, c 0 est l'intensité à l'instant t = 0, k est le taux de clairance constante, et y 0 est l'asymptote que la fonction se approche en tant que fluorescence diminue (figure 1D). y 0 peut être limitée en fonction des mesures de l'étape 19 3,8. - Utilisation PyFDAP pour calculer les protéines extracellulaires et intracellulaires des demi-vies (τ) à partir des constantes de vitesse de dégagement (k) à l'aide de la relation suivante:
5. Les expériences de contrôle pour évaluer Photoblanchiment, par inadvertance Photoconversion et Photoconversion Uniformité
- Photoblanchiment évaluer
Remarque: Le photoblanchiment peut provoquer une diminution artéfactuelle l'intensité de fluorescence qui reflète les propriétés de blanchiment de la protéine fluorescente, en plus de la clairance de la protéine d'intérêt.- Pour évaluer d'éventuelles photoblanchiment, effectuer une série d'expériences FDAP avec des intervalles de 10 min entre l'imagerie et un deuxième ensemble avec des intervalles de 20 min entre imagerie (figure 4). Analyser les données des deux séries d'expériences utilisant PyFDAP comme décrit à la section 4.
- Comparer les demi-vies des expériences 10 et 20 de l'intervalle min. Plus longue demi-vie de 20 min d'intervalle expériences indiquent photoblanchiment significative. Si les demi-vies des deux expériences sont identiques, photobleaching ne est pas une préoccupation importante.
- Alternativement, d'évaluer photoblanchiment en acquérant une série de ~ 30 images immédiatement après photoconversion. Une diminution significative de l'intensité de fluorescence indique photoblanchiment significative.
- Si photoblanchiment est détectée, utiliser la puissance du laser inférieure, diminuer le temps d'imagerie, ou envisager d'utiliser une protéine photoconvertible plus photostable 32.
- Évaluation photoconversion par inadvertance.
Remarque: Dendra2 peut être photoconverted utilisant 488 nm éclairage 27. Lorsque excitant Alexa488 avec le laser 488 nm comme décrit dans l'étape 3.3.1, photoconversion par inadvertance et donc une augmentation artéfactuelle dans la demi-vie apparente de la protéine d'intérêt est possible. Cependant, nous et d'autres avons constaté que 33 488 nm éclairage est une méthode inefficace de photoconversion dans embryons de poisson zèbre.- Utilisez l'expérience de contrôle décrit à l'étape 5.1.1 pour détecter photoconversion par inadvertance. Comparer les demi-vies des expériences 10 et 20 de l'intervalle min. Courtes demi-vies de 20 min d'intervalle expériences indiquent photoconversion inadvertance significative. Si les demi-vies des deux expériences sont identiques, photoconversion par inadvertance ne est pas une préoccupation importante.
- Si par inadvertance photoconversion est détectée, utiliser une puissance laser de 488 nm inférieure et la réduction des temps d'imagerie pour éviter par inadvertance photoconverting Dendra2.
- Évaluation photoconversion uniformité.
Remarque: Si photoconversion est sollicité vers le pôle animal de l'embryon, la diminution de la fluorescence sera influencée par la diffusion de la protéine ou le mouvement des cellules dans des plans plus profondes (Figure 5A).- Pour déterminer si photoconversion est uniforme, exprimer une protéine sécrétée photoconvertible (pour des expériences avec des protéines de fusion extracellulaires) ou une protéine cytoplasmique photoconvertible (pour des expériences avec des protéines de fusion intracellulaires). Photoconvert comme d'habitude, tpoule acquièrent un z-stack englobant la plupart des blastoderme toutes les 20 minutes pendant 80 min.
- Si photoconversion est sollicité vers le pôle animal, l'intensité de fluorescence dans des plans profonds va augmenter au cours du temps due à la diffusion ou le mouvement des cellules (figure 5B). Si non uniforme photoconversion est détecté, se concentrer plus profondément dans les embryons au cours photoconversion.
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Representative Results
FDAP a été utilisé pour déterminer la demi-vie de protéines de signalisation extracellulaires dans 19 embryons de poisson zèbre. Une de ces protéines, strabisme, induit l'expression de gènes de 34 mesendodermal cours de l'embryogenèse. Squint-Dendra2 active l'expression des gènes de mesendodermal à des niveaux similaires à untagged Squint, comme démontré par qRT-PCR et l'hybridation in situ 19 essais. Les embryons sont co-injectés avec Alexa488-dextrane et de l'ARNm codant pour Squint-Dendra2 et soumis à l'essai FDAP. Une diminution de l'intensité du signal photoconverted extracellulaire au fil du temps est évident (figure 4A). Profils d'intensité extracellulaires de 23 embryons ont été générés en utilisant PyFDAP. Les données résultant a été monté dans PyFDAP avec un premier ordre modèle cinétique d'élimination, et un taux de dégagement constante k moyenne de 1,00 x 10 -4 / s, ce qui correspond à une moyenne de 116 τ min demi-vie, a été déterminée. Similaires profil d'intensités et des taux de clairance constantes ont été obtenus lorsque les intervalles entre les images étaient 10 ou 20 min, ce qui suggère que photoblanchiment ou par inadvertance photoconversion ne pas contribuer de manière significative à des changements d'intensité (figure 4B).
Figure 1. Fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP) aperçu. (A) d'une expérience de workflow FDAP. (B) injection de l'ARNm et un colorant fluorescent dans un embryon de poisson zèbre au stade une cellule. La protéine est produite à partir de l'ARNm en tant que l'embryon se développe sur environ 5 heures avant l'imagerie. Le colorant marque les cellules (cercles verts). (C) La protéine de fusion est photoconverted en utilisant une impulsion de rayons UV, et la diminution de l'intensité du signal dans le temps photoconverted est surveillée. (D) Les données sont équipées d'une décroissance exponentielle fonction pour obtenir les constantes de vitesse de jeu (k) et la demi-vie (τ). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Montage embryons de poisson zèbre pour des expériences de FDAP. (A) embryons de poisson zèbre (blastoderme = blanc, jaune = noir) sont transférés à partir du milieu de l'embryon (bleu) dans fondue agarose (jaune). (B) des embryons et agarose sont placés sur la vitre du couvercle d'un plat à fond de verre. Les embryons sont ensuite placés manuellement de sorte que le pôle animal face à la vitre de protection. Une coupe transversale d'une boîte à fond de verre est représentée. (C) Présentation schématique d'un plat à fond de verre avec plusieurs gouttes agarose contenant quatre embryons chaque (vue regardant vers le bas dans le plat).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. L'analyse des données en utilisant PyFDAP. (A) PyFDAP utilise l'algorithme de seuillage Otsu 35 pour générer des masques intra- et extracellulaires à partir du signal intracellulaire Alexa488 (vert). (B) de signal Photoconverted (rouge) à partir d'un embryon Dendra2 exprimant une protéine de fusion sécrétée (Squint-Dendra2 19). Moyenne des intensités de fluorescence extra- et intracellulaires ont été calculés en utilisant les masques indiquées en (A). L'espace à l'extérieur de l'embryon a été exclue de ces calculs en supprimant des pixels à l'extérieur du cercle jaune. (C) PyFDAP capture d'écran affichant les données d'intensité extracellulaires d'une expérience FDAP (CIR noircles) équipé d'une fonction décroissante de façon exponentielle (ligne rouge en pointillés). La demi-vie extracellulaire est indiquée par la flèche rouge. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Les résultats représentatifs FDAP. (A) Un embryon représentant exprimant sécrétée Squint-Dendra2 juste avant photoconversion (extrême gauche) et 27, 87 et 287 min post-photoconversion. (B) pour contrôler les photoblanchiment et photoconversion par inadvertance (voir la section 5), des expériences avec 10 ou 20 minutes d'intervalle ont été réalisées (données de Müller et al., 2012 19). Dans PyFDAP, profils d'intensité extracellulaires ont été générés, équipés de fonctions à décroissance exponentielle, et normalisées par subtracTing l'équipée y 0 valeur de chaque point et la division des données par la valeur 0 c équipée. Les données de la 10 min (noir, n = 11) et 20 min (bleu, n = 12) des expériences d'intervalle étaient alors en moyenne, respectivement. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Évaluation photoconversion uniformité. (A) de photoconversion non uniforme d'une protéine extracellulaire peut conduire à une demi-vie apparente à tort courte si la protéine photoconverted diffuse dans des avions plus profondes au fil du temps. (B) Pour déterminer si photoconversion est uniforme, un z-stack couvrant la plupart du blastoderme est acquis à plusieurs fois fait post-photoconversion. L'intensité de fluorescence augmentera dans des plans plus profondes avec le temps si photoconversion était non uniforme (à noter que la diffusion de lumière provoque avions plus profondes à apparaître plus faible que les plans supérieurs). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le succès d'une expérience FDAP repose sur la génération d'une protéine de fusion photoconvertible fonctionnel. Une protéine de marquage peut affecter son activité biologique et / ou les propriétés biophysiques, y compris sa localisation, la solubilité, la stabilité et 36 à 41. Soyez prêt à tester l'activité de plusieurs différentes constructions de fusion afin de trouver celui qui est actif. Nous avons trouvé que la modification de la position de la protéine photoconvertible par rapport à la protéine d'intérêt ou plus longs en utilisant des segments de liaison (par exemple, en utilisant la séquence d'acides aminés LGDPPVAT 19) peut améliorer l'activité de la protéine de fusion. Dans le cas des protéines de signalisation, l'activité de la protéine de fusion peut être déterminée en testant sa capacité à induire l'expression de 19 gènes cibles. qRT-PCR ou hybridation in situ donnent de bons afficheurs d'expression du gène cible 19. Notez que le protocole décrit ici est conçu pour déterminer la stabilité des protéinesdans l'embryon de poisson zèbre précoce et nécessiterait la modification d'évaluer la stabilité des protéines dans d'autres contextes.
La protéine du vert au rouge photoconvertible Dendra2 27 a été utilisé avec succès dans des expériences FDAP poisson zèbre 19 (figure 4), mais d'autres options sont disponibles 26,42. Pour éviter les artefacts potentiels dus à l'agrégation de la protéine de fusion, choisissez une protéine photoconvertible monomère. Photoactivatible protéines peuvent également être utilisés dans des dosages FDAP 20-22,26.
Avant d'effectuer une expérience FDAP, plusieurs aspects du protocole doivent être optimisés. Injecter des quantités différentes d'ARNm pour déterminer le montant le plus bas qui fournit le signal utilisable après photoconversion; ~ 50 pg ARNm est une bonne quantité de départ. Afin de générer des masques de compartimentaux significatives (Figure 3), le signal Alexa488 doit être assez brillant pourrivaliser avec le signal de la protéine de fusion non photoconverted qui est constamment produite à partir de l'ARNm injecté; injecter entre 0,2 et 4 ng de Alexa488-dextran pour trouver la quantité optimale de colorant fluorescent. Trouver les conditions d'imagerie post-conversion optimale et d'utiliser les mêmes conditions pour toutes les expériences avec une construction donnée. Utilisez une bonne imagerie quantitative pratique le 43, et choisissez une gamme dynamique appropriée pour éviter pixels saturés dans le canal rouge. Déterminer l'intervalle de formation d'image appropriée pour chaque protéine de fusion. Les protéines à très courte demi-vie peuvent exiger une imagerie plus fréquents sur une période de temps totale plus courte. Établir la technique de photoconversion optimale basée sur l'organisme et la protéine photoconvertible utilisé. Nous décrivons une méthode de photoconversion robuste utilisant une lampe à arc de mercure dans l'étape 3.5, mais Dendra2 pouvons également être photoconverted avec un laser 405 33 ou 488 nm 27.
Un limitation de ce protocole de FDAP est que la surexpression de la protéine d'intérêt est requise. La surexpression peut affecter la stabilité de la protéine, par exemple, par une expression anormale d'autres gènes qui modifient la cinétique de clairance de la protéine 14,44. Si la protéine d'intérêt est une molécule de signalisation, envisager d'effectuer des expériences en présence d'un inhibiteur de signalisation afin de déterminer si le blocage de l'expression des gènes cibles affecte la stabilité de la protéine. Dans l'avenir, il peut être possible de générer des embryons transgéniques exprimant fusions photoconvertible sous le contrôle d'éléments d'expression endogènes 45-50. Si les embryons transgéniques produisent un signal suffisamment, expériences FDAP dans un contexte non-surexpression sont envisageables, peut-être en utilisant la lumière feuilles microscopie à observer diminution de fluorescence dans tout l'embryon 51.
D'éventuelles nouvelles applications de FDAP comprennent étudie les mécanismes that réglementer la stabilité des protéines en examinant les effets de différentes perturbations (par exemple, l'expression de protéases putatifs) ou des modifications de protéines (par exemple, phosphorylation) sur la stabilité. Par exemple, les facteurs de contrôle de la stabilité extracellulaire de strabisme sont actuellement inconnus. De nombreux signaux de développement sécrétées sont internalisés par les cellules de 52 à 55, ce qui pourrait contribuer à l'apurement des Squint et d'autres ligands de l'espace extracellulaire. Expériences FDAP dans lequel internalisation est bloquée pourraient fournir des informations sur les mécanismes contrôlant la clairance de la protéine extracellulaire.
Contrairement aux analyses classiques de mesure de la stabilité des protéines 15, FDAP offre une alternative à base de microscopie dans lequel la clairance des protéines peut être surveillé au fil du temps dans les organismes vivants. Des méthodes similaires ont été utilisées pour surveiller la clairance de la protéine dans des systèmes modèles autres que les embryons de poisson zèbre 20-23. Ce protocole FDAP a le potentiel pour être adapté pour déterminer la demi-vie de toute protéine tagable dans les systèmes biologiques où l'imagerie en direct est possible.
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Disclosures
Les auteurs ne ont aucun conflit de divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Jeffrey Farrell, James Gagnon, et Jennifer Bergmann des commentaires sur le manuscrit. KWR a été soutenu par le Programme National Science Foundation Graduate Research Fellowship lors de l'élaboration de l'essai FDAP. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH à AFS et par des subventions de la Fondation allemande pour la recherche (programme Emmy Noether), la Société Max Planck, et le Programme Human Frontier Science (Career Development Award) à PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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