Adaptação Humanos videofluoroscópicos Andorinha Métodos de Estudo de detectar e caracterizar Disfagia em modelos de doenças Murino

Summary

Este estudo adaptado com sucesso deglutição estudo (VFSS) métodos humanos para uso com modelos de doenças murino com a finalidade de facilitar a investigação translacional disfagia.

Abstract

Este estudo adaptado videofluoroscópica humano deglutição (VFSS) métodos para uso com modelos de doenças murino com a finalidade de facilitar a investigação translacional disfagia. Resultados bem sucedidos dependem três componentes críticos: câmaras de ensaio que permitam a auto-alimentação ao estar desenfreado em um espaço confinado, receitas que mascaram o sabor aversivo / odor de agentes de contraste orais comercialmente disponíveis, e um protocolo de passo-a-passo de teste que permite a quantificação da fisiologia andorinha. A eliminação de um ou mais desses componentes vai ter um impacto negativo nos resultados do estudo. Além disso, o nível de energia de capacidade de o sistema irá determinar que a fluoroscopia engolir parâmetros podem ser investigados. A maioria dos centros de pesquisa têm fluoroscopia de alta energia projetados para uso com pessoas e animais de maior porte, o que resulta em má qualidade de imagem excepcional ao testar ratos e outros pequenos roedores. Apesar dessa limitação, identificamos sete VFSS parâmetros que são consistentemente quantificáveis ​​em ratinhos quando usando um fluoroscópio alta energia em combinação com o novo protocolo VFSS murino. Nós obtivemos recentemente um sistema de baixa fluoroscopia energia com capacidades excepcionalmente de alta resolução de imagem e ampliação que foi projetado para uso com ratos e outros pequenos roedores. Trabalhos preliminares de usar este novo sistema, em combinação com o novo protocolo VFSS murino, identificou 13 parâmetros andorinha que são consistentemente quantificáveis ​​em camundongos, o que é quase o dobro do número obtido usando convencional (ou seja, de alta energia) fluoroscopia. Identificação de parâmetros adicionais andorinha é esperado como otimizar as capacidades deste novo sistema. Os resultados até agora demonstrar a utilidade do uso de um sistema de fluoroscopia de energia de baixo para detectar e quantificar mudanças sutis na fisiologia andorinha que podem passar despercebidas quando se usa fluoroscopia de alta energia para investigar modelos de doenças murino.

Introduction

Disfagia (distúrbio de deglutição) é um sintoma comum de várias condições médicas que afetam as pessoas de todas as idades. Exemplos incluem acidente vascular cerebral, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, paralisia cerebral, distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Batten, câncer de cabeça e pescoço, o nascimento prematuro, e idade avançada. A disfagia é altamente correlacionado com a mortalidade, geralmente como consequência de desnutrição ou pneumonia grave que se desenvolve quando bacteriana-laden comida / líquido / saliva é aspirado para os pulmões ^1-4. Esta condição médica debilitante e com risco de vida afeta mais de 15 milhões de pessoas a cada ano nos Estados Unidos sozinho ^3. Apesar da alta prevalência e os resultados negativos associados, as opções atuais de tratamento para a disfagia são limitados a paliativos (e não curativa) se aproxima, como a modificação da dieta (por exemplo, evitando as consistências de alimentos / líquidos específicos), alterações posturais (por exemplo, Tucking o queixo quando engolir), abordagens a motor (por exemplo, exerce o direccionamento músculos na cavidade oral, faringe, laringe e), abordagens sensoriais (por exemplo, aroma de execução, a temperatura, e / ou de estimulação mecânica), e tubo de alimentação (por exemplo, a nutrição e hidratação administrados via nasogástrica (NG) tubo de gastrostomia endoscópica percutânea ou (PEG) tubo). Estes tratamentos servem apenas como terapia sintomática em vez de mirar as causas subjacentes do problema. Na verdade, uma grande barreira para a descoberta de novos tratamentos eficazes, para a disfagia é o conhecimento científico limitado de mecanismos patológicos responsáveis, que provavelmente diferente para cada doença.

Diagnóstico Disfagia é predominantemente feita através de um procedimento radiográfico chamado de deglutição estudo (VFSS), também conhecido como um estudo de bário modificado. Ao longo dos últimos 30 anos ou mais, este teste de diagnóstico tem sido considerada o padrão-ouro para evaluating função andorinha ^5-7. Este teste implica ter o paciente se sentar ou ficar no caminho do feixe de raios-X de uma máquina de fluoroscopia enquanto voluntariamente a ingestão de alimentos e consistências líquida misturada com um agente de contraste oral, tipicamente sulfato de bário ^8,9 ou iohexol ^10. À medida que o paciente engole, alimentos e líquido contendo agente de contraste pode ser observada em tempo real através de um monitor de computador, enquanto viaja a partir da boca para o estômago. Estruturas de tecido mole também são visíveis e podem ser avaliados em relação à estrutura e função. Os doentes são chamados a realizar vários goles de cada alimento e consistência líquida, todos os quais são vídeos gravados para posterior visualização e análise de frame-by-frame para quantificar a presença eo grau de disfagia. Numerosos componentes fisiológicos de engolir normalmente são analisados, como o ponto de disparo anatômica da andorinha da faringe, o tempo de trânsito bolus através da faringe e esôfago, extensão e duração do laryngeal elevação, localização e quantidade de resíduo pós-andorinha, e ocorrência de e razão fisiológica para aspiração ^7,11.

Aspectos do protocolo VFSS humano foram recentemente adaptado para o estudo ratos livremente comportando; no entanto, os resultados foram limitados porque os ratos não permanecer no campo videofluoroscópica de vista durante o teste ^12. VFSS não tenha sido previamente tentada com ratinhos. A adaptação bem sucedida do protocolo VFSS humano para utilização com ratos e ratazanas iria proporcionar um método novo de pesquisa para investigar as centenas de modelos de doenças que são conhecidos por causar disfagia em humanos actualmente existente murino (ratinho e rato). Este novo método (doravante referida como VFSS murina), portanto, acelerar a identificação e validação de modelos murinos de disfagia que são adequados para investigar os mecanismos neurofisiológicos subjacentes no tecido músculos, nervos e cérebro que são patológico e contribuindo para a disfagia in humanos. Além disso, murino VFSS iria permitir a identificação de medidas objetivas (biomarcadores) de capacidade de deglutição / disfunção que poderia ser comparado diretamente com os seres humanos. Estas espécies cruzadas biomarcadores videofluoroscópicos poderia então servir medidas de resultados, como novos para quantificar a eficácia do tratamento em ensaios pré-clínicos com camundongos e ratos, o que melhor traduzem em ensaios clínicos com pessoas.

Para esse efeito, o protocolo VFSS murino foi estabelecida utilizando ~ 100 ratinhos de ambos os sexos. Todos os ratos eram ou C57 ou híbridos estirpes C57 / SJL. Os ratinhos C57 não foram geneticamente alterados, enquanto C57 / SJL foi a estirpe de fundo para uma colónia de murganhos transgénicos G93A-SOD1 (ou SOD1), o modelo animal mais largamente utilizado dos ALS. A colônia SOD1 foi um aproximada de 50-50 mix de transgênicos (ou seja, ALS-afetados) ratos e não transgênicas (ou seja, não afetados) ninhada.

O protocolo VFSS murino consiste em três componentes:

1. Receitas que mascaram o sabor aversivo / odor de agentes de contraste oral e produzem radiodensity suficiente para permitir a visualização adequada da deglutição,
2. Um protocolo passo-a-passo de teste que maximiza o cumprimento animal, minimiza o tempo total do teste e a exposição à radiação, e permite a quantificação de vários parâmetros de andorinha para cada fase da deglutição (ou seja, oral, faringe, esófago e).

O efeito combinado produz um baixo stress, ambiente confortável, auto-alimentando exame que permite a avaliação da alimentação típica e deglutição comportamentos de ratos.

Protocol

O protocolo VFSS murino segue um protocolo aprovado Comitê Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) e Diretrizes do NIH.

1. Chambers Construct Observação de Tubulação do policarbonato e chapas (Figura 1)

1. Corte de 5 cm de largura, quadrado policarbonato tubulação (-2 mm de espessura de parede) em 16 cm de comprimento, utilizando uma máquina de trituração manual. A maioria dos mouses ajustam adequadamente dentro destas dimensões, o que resulta numa câmara de ensaio estreito que permite a pé e se virar como desejado. A espessura de parede de aproximadamente 2 mm, oferece rigidez adequada sem atenuar significativamente o feixe de raios-X.
   1. Dois tipos de câmaras são essenciais para este protocolo: "tubos de bico", concebidos para a entrega de líquidos através de bico, e "tubos de ventilação", concebidos para a entrega de líquidos via peg-tigela.
      1. Para os "tubos" bica, fazer um pequeno orifício oblongo (12 x 8 mm) na parte superior de cada tubo perto de uma extremidade utilizando uma moagem manual do machine. Este buraco é usado para fornecer soluções de consumo através de um bico de tubo sipper durante o condicionamento comportamental e teste VFSS.
      2. Para os "tubos de ventilação", broca 9 pequenos furos de ventilação na parte superior de cada tubo perto de um fim. Este tubo é usado durante os testes VFSS com uma tigela de peg em vez de tubo sipper.
      3. É possível a utilização de tubos de bico quando a fornecer líquido via peg-bacia; no entanto, a abertura no teto da câmara devem ser bloqueadas para evitar comportamentos exploratórios distraem por ratos (veja o passo 6.2.2).
2. Cortar policarbonato folhas (3/4 "de espessura) em tampas finais (50 x 50 mm, 2 por tubo) utilizando uma máquina de moagem informatizado, também chamado de controlo numérico (CNC) computadorizado máquina.
   1. Moinho de uma ranhura oblonga (19 x 6 mm) perto de uma borda da face interior de cada tampa final. Utilize esta ranhura para garantir a-bowl peg para os ratos para beber durante o teste VFSS.
   2. Moinho de 5 furos de ventilação redondas (6 mm de diâmetro) Através de cada tampa de extremidade.
   3. Moinho de um buraco menor rodada (5 mm de diâmetro) através da tampa final, diretamente acima do sulco oblongo. Utilize este orifício para entregar líquido no-bowl peg durante os testes VFSS.
   4. Na face exterior da tampa final, moinho a 9/16 "de diâmetro rebaixo que é 1/4" profundo em torno deste buraco menor.
   5. Moinho afastado 2 mm ao longo do perímetro da face interior da tampa final para uma profundidade de 7 mm, para dar um passo que facilmente se insere a extremidade do tubo.
   6. Moinho de um furo de 1 mm no passo da tampa final para acomodar um O-ring, que é necessária para impedir a tampa final de cair para fora da extremidade do tubo.
   7. Arredondar bordas expostas e bisel todos os cantos das tampas finais para evitar a mastigação por ratos.
3. Faça peg-taças de policarbonato folhas, utilizando uma máquina CNC. Dimensões totais deve ser de 24 x 19 x 6 ^mm3, com uma bacia em forma de 10 x 3 mm ² a depressão em uma extremidade. Um peg-bacia é needed para cada tubo. PEG-potes devem inserir confortavelmente na ranhura oblonga nas tampas finais (Figura 2).

Figura 1:. Observação Chambers câmaras de observação foram projetados para manter animais se comportando livremente no campo de fluoroscopia de vista. Estas imagens mostram componentes essenciais para a realização de VFSS câmara. Top: "tubo de vazamento", projetado para a entrega de líquidos através de bico. Inferior: "tubo de ventilação", projetado para a entrega de líquidos via peg-tigela. Os dois tampas são intercambiáveis ​​entre tubos de bico e de ventilação.

Figura 2:. PEG-bacias Cada bowl-peg se encaixará em uma ranhura na face interior de cada tampa final. Esquerda:componentes desmontados. Componentes montados: Média. À direita:. Face exterior do fim-cap Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Construa Garrafas Sipper Tubo de Tubos da centrífuga, Stoppers de silicone e metal Bicos (Figura 3)

1. Use um perfurador da rolha (5/16 ") para fazer um furo central através de cada rolha de silicone.
2. Aplique algumas gotas de óleo mineral no furo e inserir manualmente um bico de metal na extremidade larga da rolha. Bicos de ponto bola em linha reta são preferidos porque retas bicos abertos resultar em vazamento excessivo e projecção do agente de contraste no interior da câmara de observação, o que pode interferir com a visualização durante o teste.
3. Ajustar o comprimento bico de modo que se estende por todo o comprimento da rolha de silicone e estende-se cerca de 3 cm para além da extremidade larga da rolha.
4. Inserir a parte mais estreita de cada rolha (contendo um tubo Sipper) para um tubo de centrífuga de 30 ml.
5. Verificar se o comprimento bico é adequado inserindo-o através do furo oblongo na parte superior da câmara de observação. A ponta bico deve descansar cerca de 1 cm do teto da câmara, que é suficientemente longo para ratos adultos saudáveis ​​de alcançar.
   NOTA: Longer comprimentos resultar em ratos que bebem enquanto liga / inclinando a cabeça, o que obscurece a visualização de engolir durante VFSS.
6. Estender o comprimento bico para acomodar ratos mais jovens, linhagens de camundongos de tamanho menor, e modelos de doença do rato que não conseguem atingir o bico devido à incapacidade motora dos membros.
7. Lave os bicos recém-feitos antes de usar para remover o óleo mineral, os restos de silicone, e outros contaminantes durante o manuseio.

Figura 3: Sipper. Tubo Garrafas Esquerda: componentes desmontados. Componentes montados: Média. À direita:. Rato que bebe de tubo sipper na câmara de observação por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Construção de um sistema de entrega de seringa para uso com PEG-bacias (Figura 4)

1. Use um torno para fazer adaptadores para ligação de polietileno (PE) tubulação para as tampas finais câmara de observação, descrito como se segue.
   1. Corte 1/2 "de diâmetro resina acetal material da haste em 1 1/4" seções de comprimento, aqui referidos como adaptadores de tubos (ou adaptadores).
   2. Numa das extremidades de cada adaptador, reduzir uma "secção de comprimento na ponta de 3/16" de diâmetro 1/2, aqui referida como a extremidade mais estreita.
   3. Para o "comprimento de cada secção de placa (isto é, 1/2" restantes 3/4 diâmetro final), ranhuras de máquinas para o aperto manual durante nóse. Esta secção é aqui referida como a extremidade larga.
   4. Na grande final de cada adaptador, faça um furo central que é 0,098 "de diâmetro e uma" profunda.
   5. Broca resma e a porção restante do orifício central, em cada placa de 0,096 "para proporcionar um ajuste confortável no tubo de PE.  
2. Cortar tubagem PE (PE 240, diâmetro interno 1,67 milímetros) para o comprimento desejado, utilizando uma tesoura. Um comprimento de 3-4 pés suficientemente aumenta a distância entre o investigador e fluoroscope durante os testes VFSS para melhorar a segurança de radiação.
   NOTA: Longer comprimentos irá utilizar um volume maior de solução de agente de contraste durante o teste VFSS, talvez maior do que o padrão de 30 ml de receita.
3. Insira a 15 G agulha de ponta romba plenamente em uma das extremidades do tubo de PE. A montagem deve ser confortável.
4. Insira a outra (gratuito) extremidade do tubo PE através do orifício central do tubo adaptador, a partir de tele grande final.
5. Puxar o tubo de PE para fora da extremidade mais estreita da placa de modo que se prolonga ~ 2 mm.
6. Inserir a parte mais estreita do adaptador (com ~ 2 milímetros tubo de PE que se estende a partir dela) para dentro da tampa de extremidade de um tubo de observação; ele deve caber confortavelmente no furo rebaixado localizado directamente acima da bacia peg.
7. Ajuste o comprimento da tubulação de PE no final estreita do adaptador para que ele mal se estende acima da depressão bowl na taça peg.
8. Encha uma seringa de 10 ml (sem agulha) com água de um copo e remover as bolhas de ar.
9. Introduzir a seringa cheia para a extremidade da agulha do tubo de PE.
10. Empurre lentamente o êmbolo da seringa para fornecer água para a bacia-peg na câmara de observação. Pare quando a-bowl peg está quase cheio. Evite excesso de enchimento, o que irá causar respingos durante potável.
11. Se a cavilha de tigela não enche adequadamente, ajustar o comprimento da tubagem de PE que se prolonga acima da cavilha de taça.
12. Over-extensão do PEtubulação vai atrair ratos para mastigá-lo durante os testes, em vez de beber a partir da bacia peg.
13. Se o tubo de PE não for prorrogado longe o suficiente, o líquido será executado no chão da câmara de observação ao invés de encher a tigela de peg.
14. Após a utilização, separar a seringa e lavar o sistema de entrega de seringa inteiro com sabão e água. Usando uma seringa de 10 ml para empurrar o ar através do tubo de PE para remover a água. Esterilizar por autoclavagem, conforme necessário.

Figura 4:. Seringa Sistema de entrega de Esquerda: componentes desmontados. Componentes montados: Média. À direita:. Rato que bebe de peg-tigela na câmara de observação por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Construa uma Motorizado SCISSou Tire Mesa para posicionamento remoto da câmara de observação (Figura 5)

1. Construir um elevador de tesoura com uma plataforma cm 12 x 12 que pode aumentar e diminuir em 5 cm para acomodar entrando em camundongos em diferentes posições dentro do campo de fluoroscopia de vista. Material de elevador deve ser de metal ou plástico para facilitar a limpeza, com desinfectantes.
2. Motores de passo de montagem para ajustar a altura e posição longitudinal do elevador.
3. Couple o primeiro motor de passo para o mecanismo de tesoura elevador para controlar a altura, traduzindo uma barra. Este acoplamento pode ser um parafuso ou de cremalheira e pinhão engrenagem chumbo.
4. Casal do segundo motor de passo para o quadro de tesoura elevador para controlar a posição longitudinal, traduzindo todo o quadro de elevação em relação à mesa. Este acoplamento pode ser um parafuso ou de cremalheira e pinhão engrenagem chumbo.
5. Ligue um sistema de controle remoto para os motores de passo para permitir o ajuste da posição de câmara de observação durante o exame, minimizando investigator exposição à radiação.
6. Interface de portáteis botões de controle remoto com um chip microcontrolador para controlar a ativação e direção de cada motor de passo.

Figura 5:. Tabela Scissor o elevador com controle remoto esquerda: vista lateral da tabela tesoura elevador. Direita: tabela de elevador com câmara de observação posicionada em fluoroscope. A tabela de elevador para ajustar a posição da câmara de observação para manter ratos do campo de visão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Execute Behavioral Condicionado Antes Testing VFSS para assegurar a participação Maximal

1. 1-2 semanas antes da VFSS testes, os ratos sujeitos a um dia para o outro (12-16 horas) período de regulação de água para induzirsede, durante o qual a água tempo é retido a partir da gaiola. O objetivo da regulação da água é para os animais para ser sede, não desidratado. Os animais devem permanecer alerta e responsivo. Este quadro de duração e tempo é essencial para evitar a desidratação, o que pode ocorrer como resultado de episódios de regulação 2 água dentro de 1 semana (isto é, um para o condicionamento comportamental e outro para o ensaio VFSS).
2. Coloque um único "tubo de vazamento" (com uma extremidade fechada por uma tampa final) no chão de uma gaiola contendo material de cama fresca. A extremidade fechada deve ser mais próxima a abertura de descarga no teto da câmara. Essa etapa assegura a ventilação adequada enquanto o sono camundongos múltipla amontoados dentro da profundidade da câmara durante a noite. A extremidade aberta permite que os ratos para entrar / sair da câmara livremente.
3. Remover outro material enriquecimento (por exemplo, nestlet e cabana) para incentivar os ratos para explorar e sono na câmara durante a noite (Figura 6). Essa etapa assegura que os ratossão acostumar a estar na câmara por longos períodos antes do teste VFSS.
4. Fornecer uma única pastilha de alimento padrão per mouse sobre o chão da gaiola para comer durante a noite; não fornecem água ou outras fontes de hidratação.
5. Usar um filtro de topo padrão para conter os ratinhos na gaiola durante a noite, como as dimensões da câmara de observação evitar uma tampa de arame padrão de encaixe na gaiola. Armazenar a tampa removida do fio (contendo comida e água garrafa) em cima da parte superior do filtro para pesar a tampa para baixo e impedir que os ratinhos escapassem.
6. Realizar palatabilidade testar a manhã seguinte, descrito como se segue.
   1. Faça uma solução de teste com sabor de chocolate em um frasco de 30 ml tubo sipper, sem a adição de agente de contraste (ou seja, a água substituto para iohexol). Esta receita é descrito na Tabela 1. Adicione uma garrafa por gaiola para ser testado.
   2. Retire a câmara de observação e recoloque a tampa do fio padrão. Ofereça o chocolate com saborsolução (temperatura ambiente, ~ 22 ° C) durante 2 min por gaiola, inserida através da tampa de arame.
   3. Avaliar palatabilidade observando comportamentos de consumo durante o período de teste de 2 min.
   4. Pontuação palatabilidade de acordo com os seguintes critérios:
      1. Latência até o primeiro mouse bebidas no bico para, pelo menos, 5 segundos, sem interrupção.
      2. Percentual de ratos por gaiola que beber a solução.
      3. Número de ratos que bebem simultaneamente no bico.
   5. A solução é considerado aceitável se a maioria dos ratinhos em cada gaiola tem múltiplos longa (> 5 seg) episódios de beber e se vários murganhos beber simultaneamente a partir do bico (Figura 7).
   6. Se a solução com sabor de chocolate não é palatável, repetir o ensaio palatabilidade com outros intensificadores de sabor em várias concentrações para identificar uma única solução preferida.
   7. Oferecer até quatro soluções diferentes (a várias concentrações) um de cada vezem ordem aleatória para múltiplas gaiolas de ratos num único dia do teste, sem um período de lavagem ou solução de lavagem. Sabores potenciadores adequados a considerar para ratos incluem açúcar, queijo, manteiga de amendoim, vários sabores de frutas e nozes e leite.
      NOTA: Não execute palatabilidade testar mais de uma vez por semana para evitar a desidratação de episódios repetidos de regulação de água.
   8. Pode levar várias semanas para identificar com sucesso a solução preferida para cada linhagem de camundongos. O objectivo é o de identificar candidatos sabores que resultam em múltiplos longa (> 5 seg) episódios de beber por ratinhos imediatamente (<30 segundos) depois da exposição, uma vez que estes títulos são consideradas essenciais para a obtenção de resultados bem sucedidos VFSS.
7. Depois de uma solução sabor preferido é identificado, o retorno da câmara de observação para cada gaiola para casa para continuar condicionamento comportamental, descrito como se segue.
   1. Prenda uma extremidade-tampão para a câmara de observação na extremidade mais próxima dooval (bico) buraco.
   2. Oferecer ratinhos a solução com sabor a chocolate para 2-3 h, inserindo o frasco Sipper tubo através do orifício oval no topo da câmara. Essa etapa assegura que todos os ratos foram condicionados a beber profundamente dentro da câmara de observação.
   3. Remover a tampa de arame para acomodar a câmara de observação.
   4. Coloque uma pastilha de alimento por rato no chão da gaiola para o consumo ad libitum durante o período de teste.
   5. Cobrir a gaiola com uma tampa de filtro padrão para evitar a fuga dos ratos durante o resto do período de condicionamento comportamental. Armazenar a tampa removida do fio (contendo comida e água garrafa) em cima da parte superior do filtro para pesar a tampa para baixo.
8. Fornecer água e comida ad libitum na gaiola quando condicionamento comportamental está concluída.
9. Lavar as câmaras de observação (tubos e end-caps) e garrafas de tubo sipper (bicos e tubos de centrífuga) com água e sabão; esterilizar em autoclave, se necessário. Evitarusando acetona para limpar os tubos uma vez que provoca um efeito de turvação permanente que faz com que o tubo opaco, em vez de translúcido.

Figura 6:. Mice Explorando Observação Chambers Ratos são naturalmente inclinados a buscar abrigo em espaços pequenos. Como resultado, eles entrar livremente e explorar o tubo de observação quando ele é colocado na gaiola. A maioria dos ratos são encontrados dormindo na câmara na parte da manhã. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<td> Chocolate Syrup

INGREDIENTES	Solução Chocolate (para teste de palatabilidade)	Chocolate-Flavored Iohexol (para testes VFSS)
3 ml	3 ml
Iohexol (350 mg de iodo / ml)	0 ml	15 ml
Água (DI ou filtrada)	Ajustar para 30 ml de volume final (27 ml)	Ajustar para 30 ml de volume final (12 ml)
Volume final	30 ml	30 ml

Tabela 1: Solução de teste Preferido por C57 e C57 / SJL mouse Cepas com sabor de chocolate.

Figura 7:. Um teste de palatabilidade indicador de preferência de sabor durante o teste de palatabilidade é o número de ratos que bebem simultaneamente a partir de um único bico na gaiola. Esta imagem mostra quatro ratos que bebem simultaneamente uma solução com sabor a chocolate, o qual foi identificado como opreferido realçador de sabor por estirpes C57 e C57 / SJL.

6. VFSS Testing Preparação

1. Ratos sujeitos a um período de regulação de água durante a noite (ou seja, reter água durante 12-16 horas), conforme descrito no Passo 5 acima.
   1. Coloque um único "tubo de ventilação" (com uma extremidade fechada por uma tampa final) no chão de uma gaiola contendo material de cama fresca. A extremidade fechada deve ser mais próximo os orifícios de ventilação no teto da câmara. Essa etapa assegura a ventilação adequada enquanto o sono camundongos múltipla amontoados dentro da profundidade da câmara durante a noite. A extremidade aberta permite que os ratos para entrar / sair da câmara livremente.
2. Na manhã seguinte, retire câmaras de observação sujas de gaiolas e enxaguar rapidamente com água corrente e secar completamente em preparação para testes VFSS.
   1. Retire e limpo apenas uma câmara de cada vez para evitar a mistura de secções entre gaiolas, o que pode causar comportamentos exploratórios excessivas queinterferir de forma significativa com o teste VFSS.
   2. Se os "tubos" bico são utilizados em vez de "tubos de ventilação" para testes VFSS, insere uma ficha de silicone para a abertura de descarga da câmara de observação tecto para evitar comportamentos de exploração (Figura 8).
   3. Escreva em cada câmara (por exemplo, com o número de gaiola) para evitar mix up.
      NOTA: Use um marcador seca apagar a rotular cada tubo limpo antes de colocá-lo de volta na gaiola. Marcador permanente deve ser evitado porque ele é absorvido pelo material do tubo e não se lavar, mesmo com álcool ou acetona.
3. Preparar a solução ioexol achocolatado (ou outra solução palatável).
   1. Adicione uma única receita (30 ml) da solução de teste (Tabela 1) para várias gaiolas.
   2. PRECAUÇÕES PARA Iohexol: Loja Iohexol fechado garrafas à temperatura ambiente, protegido da luz. Uso frascos abertos dentro de 24 iohexolhr, como a viscosidade e o sabor podem ser alteradas dentro de um ou dois dias após a exposição ao ar. Alternativamente, congelar-se alíquotas de doses individuais (15 mL) em tubos de centrífuga de armazenamento a longo prazo. Soluções de teste Iohexol preparada deve ser usado dentro de algumas horas para garantir o frescor e evitar a evasão por ratos. Administrar soluções Iohexol em temperatura ambiente, para evitar confundir o estudo devido a efeitos da temperatura em função de andorinha. Não congelar qualquer solução de teste preparado restante, como o sabor do chocolate torna-se amarga com congelamento e resulta em evasão por ratos.
4. Preparar o ambiente fluoroscopia.
   1. Use um sobressalente câmara de observação (vazia) e peg-bacia (ou bico de tubo sipper) para determinar a altura ideal e posição dentro do feixe fluoroscope que permite a visualização de beber no plano (horizontal) lateral.
   2. Defina a taxa de quadros fluoroscopia para 30 quadros por segundo; mais elevadas taxas de quadros (mas não inferior) pode ser usado se estiver disponível.
   3. ENSure que um marcador radiopaco calibração é adequadamente colocada sobre a câmara fluoroscópio / detector de modo a que seja visível no monitor durante o teste inteiro. Esta etapa é necessária para permitir a calibração de medidas de comprimento utilizadas para quantificar parâmetros engolir.

Figura 8:. Silicone ficha quando Usando PEG-Bowls Esquerda: ficha de silicone. Direita: Um tampão de silicone é puxada através da abertura do tubo Sipper na parte superior da câmara de observação. Este plug evita que os ratos de tornar-se distraído com a abertura de descarga quando se utiliza a-bowl peg em vez de tubo sipper durante os testes VFSS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Ensaios de Ratos VFSS

1. Levante a câmara de fora da gaiola e gentilmente anexar o fim-cap 2 ^nd (com peg-bacia conectado, se um tubo sipper não será usado), tomando cuidado para não apertar o mouse (especialmente a cauda).
   NOTA: Esta abordagem minimiza resposta ao estresse do rato devido ao manuseio, o que é especialmente importante para os ratos que estão sendo testados pela primeira vez.
2. Com testes repetidos, os ratos podem ser facilmente induzidas a entrar na câmara quando ele é colocado em frente deles no interior da gaiola, ou quando suspenso pela cauda através da abertura da câmara.

Posicionar a câmara de observação (contendo o rato) no interior da máquina de fluoroscopia para começar a testar VFSS no plano lateral (isto é, do feixe de raios-X horizontal).

Fornecer a solução ioexol achocolatados (Tabela 1) via peg-bacia ou garrafa tubo sipper.

1. Se estiver usando uma tigela-peg, Fornecer a solução através do sistema de entrega de seringa descrito no Passo 3 acima. Este sistema permite reenchimento rápido e fácil da cavilha de taça, conforme necessário.
2. Se utilizar uma garrafa tubo Sipper, inserir o tubo Sipper através da abertura oval no topo da câmara de observação. Inclinar a garrafa de modo que o bico é dirigido para o centro da câmara.

Inicie a gravação videofluoroscopia quando o mouse começa a beber.

1. Ajustar a posição da câmara de observação (utilizando a tabela de elevador em tesoura com controlo remoto descrito no Passo 4), de modo que o mecanismo de deglutição é visível no campo de visão.
2. Pausar a gravação de cada vez que o mouse se afasta do-bowl peg ou bico para minimizar a duração da exposição à radiação.
3. Retomar a gravação quando o mouse retorna ao bico ou peg-tigela.
4. Encher o peg-bacia, conforme necessário.
5. Pare de testar se o mouse não bebe dentro de 5 min. O objetivo é registrar vários long (> 5 seg) crises de beber contínua, o que é típico para a maioria dos ratos dentro dos primeiros 2 min de teste.
6. Retorno camundongos noncompliant à gaiola (sem água) para re-teste em um momento posterior no mesmo dia; não exceder um período de regulação de água 24 horas. Os ratos que permanecem não aderente, para três experiências são retirados do estudo.

Se necessário, reposicionar o fluoroscópio para testar ratinhos no plano dorso-ventral (isto é, do feixe de raios-X vertical). Este plano é usado para identificar os desvios no fluxo de bolus, através da faringe e esófago durante a deglutição.

Ao testar vários mouses da mesma gaiola casa:

1. Limpe a-bowl peg (e na ponta do tubo PE) ou bico de tubo sipper com uma toalha de papel seca entre camundongos.
2. Limpar a câmara de observação conforme o necessário, para remover qualquer ratinhos iohexol salpicado nas paredes da câmara. Lavar a câmara com água corrente e seque com uma toalha de papel.

Ao testar os ratos froma diferente gaiola:

1. Use um novo peg-bacia (ou mudar o tubo de vazamento sipper). Caso contrário, os ratos podem se distrair com o odor de outros ratos que beberam da mesma peg-tigela ou tubo sipper. Os peg-bacias e tubos sipper devem ser rotulados para evitar confusão.

Quando o teste de todos os ratos num único gaiola está concluída, fornecer água e alimento na gaiola.

Lavar as câmaras de observação (tubos e end-caps), PEG-bacias, sistema de entrega de seringa e garrafas tubo sipper (bicos e tubos de centrífuga, se usados) com água e sabão; esterilizar em autoclave, se necessário.

Elimine qualquer solução ioexol permanecendo como dirigido por diretrizes de segurança; eliminação de drenagem pode ser aceitável na maioria das instalações.

8. Análise de vídeo

1. Use um programa de software de edição de vídeo que permite a análise de frame-by-frame das gravações videofluoroscopia para quantificar os parâmetros gole de juros (Tabela 2). Identifique pelo menos dois avaliadores treinados para analisar cada vídeo de forma cega: Um colaborador principal e um ou dois revisores secundárias.
   1. Revisor primário: Ver cada vídeo para identificar e analisar 3-5 longos (aproximadamente 5 seg) bebedeiras. Este critério é baseado em estudos publicados andorinha não radiográficos com ratos ^13,14 e VFSS com ratos que mostram que ¹² 3-5 medidas por parâmetro andorinha são suficientes para análises estatísticas.
   2. Revisores secundários: Independentemente analisar as medidas 3-5 por parâmetro andorinha para cada rato que foram inicialmente identificados e analisados ​​pelo revisor primário.
2. Identificar discrepâncias avaliador para cada mouse. Re-analisar todas as discrepâncias como um grupo revisor chegar a 100% de consenso.
3. Calcular a média dos valores de consenso (isto é, 3-5, indiscutíveis) para cada parâmetro de engolir para obter o valor médio para cada rato para utilização em análises estatísticas. Quando menos de 3 MEASURes são obtidos para um único parâmetro andorinha para um determinado rato, digite um valor em falta (ou seja, não zero) na base de dados estatísticos para o parâmetro andorinha correspondente.

PARÂMETROS ANDORINHA	DESCRIÇÃO
Inter-Swallow Interval (ISI)	O número de quadros de vídeo entre duas sucessivas, andorinhas ininterruptas. O quadro inicial para o cálculo ISI é o "frame resto" que precede imediatamente a transferência visível do bolo alimentar da valéculas para o esôfago. O quadro final é o "frame resto" do próximo gole. O número de quadros entre os dois goles sucessivas é então dividido por 30 quadros por segundo (fps) para converter para o tempo (seg).
Jaw Excursion Rate (Lamba taxa equivalente)	A língua não é claramentevisível durante VFSS para permitir a quantificação da taxa de lamber; no entanto, a taxa de excursão mandíbula é facilmente quantificável. Durante lamber, a mandíbula deve abrir para permitir a língua para se projetam a partir da boca. Portanto, o número de mandíbula abrir / fechar (excursão) ciclos por segundo (30 quadros), enquanto beber é equivalente a lamber taxa. Cada ciclo começa com excursão mandíbula a mandíbula maximamente aberta (que coincide com protrusão da língua) e termina quando a maxila retorna para a posição aberta máxima. Os ciclos subsequentes do fechamento da mandíbula e re-abertura são contados como episódios de excursão da mandíbula individual.
Jaw Excursion Distância	A distância da mandíbula abre durante os ciclos de excursão da mandíbula, medir em mm entre o incisivos superiores e inferiores.
Rácio de lambe-Swallow	O número de ciclos de excursão de maxilas que ocorrem durante cada ISI (isto é, entre dois sucessivos, ininterruptos engole).
Swallow Taxa	O número de andorinha que ocorrem durante cada 2 segundos episódio de beber ininterrupto no bico.
Pharyngeal Transit Time (PTT)	O tempo que leva o bolo a ser engolido através da faringe. O quadro inicial é idêntico ao quadro inicial ISI (ou seja, o "frame resto" que precede imediatamente a transferência visível do bolo alimentar da valéculas). A estrutura final é quando a cauda do bolo passou completamente a 2ª vértebra cervical (C2), que é o ponto de referência anatómica mais óbvia na coluna cervical do rato. O número de quadros entre os quadros de início e de fim é então dividido por 30 fps e convertido em milisegundos (ms).
Bolus velocidade pela faringe	Faríngea velocidade de bolus é medido em relação ao PTT (descrito acima). Utilizando o software ImageJ, a distância (mm) de valéculas à vértebra C2 é medida, dimensionados usando um marcador de calibração. Este distanciamentoe (mm) é, então, dividido pela PTT (ms) para determinar a velocidade de bolus (mm / ms).
Esofágico Transit Time (ETT)	O quadro inicial TET é idêntica à estrutura de extremidade PTT (descrito acima). A armação de extremidade TET é quando o bolus entrou completamente o estômago, a qual é definida como o desaparecimento do bolo a partir do esófago. O número de quadros entre o início eo fim quadros ETT é então dividido por 30 fps e convertido em milisegundos.
Bolus velocidade através de Esôfago	Velocidade de bolus esofágico é medido em relação ao tubo endotraqueal (descrito acima). Utilizando o software ImageJ, a distância (mm) é medido a partir da vértebra C2 a junção gastroesofágico, dimensionado usando o marcador de calibração. Esta distância (mm) é depois dividido por ETT (ms) para determinar a velocidade de bolus (mm / ms).
Bolus velocidade pela faringe e esôfago	Este parâmetro é utilizado quando C2 não é um marco anatômico facilmente visível; daí,não é possível distinguir entre a faringe e fases esofágica de deglutição. Em tais casos, a velocidade de bolus através da faringe e da laringe é combinado num único parâmetro andorinha. O quadro inicial é idêntico ao quadro inicial PTT (ou seja, o "frame resto" que precede imediatamente a transferência visível do bolo alimentar da valéculas). A armação de extremidade é idêntica à estrutura de extremidade TE (ou seja, quando o bolo entrou completamente o estômago). O número de quadros entre estes dois eventos é dividido por 30 fps e convertido em milisegundos.
Bolus Area	Usando o software ImageJ, área de bolus é medido pelo vallecular "frame de descanso" antes do início da faringe andorinha, escalado usando um marcador de calibração.
Pharyngeal Resíduos Área	Área da faringe resíduo é medida usando o software ImageJ, dimensionado usando um marcador de calibração.
Volume de Consu Líquidomed	O volume de líquido consumido a partir de um frasco de tubo Sipper é difícil de estimar devido à fuga através do bico. No entanto, o volume de líquido consumido de um pino de taça pode ser calculada de forma mais precisa como se segue: 1) determinar a densidade (ou seja, relação de peso para volume) do volume calibrado de líquido que foi administrada em uma tigela para cavilha, 2 ) determinar o peso da tigela para cavilha contém o líquido residual, 3) inserir estes valores de peso para um conversor de volume (por exemplo, http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php .

Tabela 2: Andorinha parâmetros quantificáveis ​​Durante Murino VFSS.

Representative Results

Nós projetamos com sucesso um romance e um protocolo específico VFSS-murino replicável que inclui câmaras de ensaio que permitam a auto-alimentação, receitas para aromatização de agentes de contraste orais, e um protocolo de teste passo-a-passo que permite a quantificação da fisiologia andorinha. A capacidade de o nível de energia do sistema de fluoroscopia determinado que engolir parâmetros poderiam ser investigados em ratinhos. Nós inicialmente utilizado fluoroscopia de alta energia projetados para uso com pessoas e animais maiores (por exemplo, GE Advantx, GE OEC 9600, e Omega Cardiac Cath CS-25, cada um com 30 quadros por segundo). No entanto, estes sistemas tinham capacidades de ampliação suficientes para testes ratinhos, o que resultou no enchimento dos animais apenas uma pequena porção do campo de visão (Figura 9). Como resultado, a qualidade de imagem era excepcionalmente fraca, impossibilitando a visualizar a maioria das estruturas do mecanismo de deglutição. Apesar desta limitação, foram identificados 7 VFS objetivoS engolir parâmetros que eram consistentemente quantificável para ratinhos quando se utiliza uma (ou seja, alta energia) fluoroscopia convencional em combinação com o novo protocolo VFSS murino (Tabela 3). Além disso, identificou-se o espaço vallecular como o ponto de disparo anatómica para engolir em ratinhos adultos saudáveis ​​(3-17 meses de idade), bem como condições de ratos com idade avançada (> 18 meses) e ALS em fase terminal.

Figura 9:. Energia fluoroscopia Sistemas de Alto Esquerda: Imagem representativa de um rato obtidos utilizando alta energia (ou seja, os sistemas convencionais) fluoroscopia. Note-se que o rato preenche apenas uma pequena porção do campo de vista de fluoroscopia, demonstrando assim a capacidade de ampliação insuficiente de fluoroscopia convencional para roedores de imagem. Direita: A mesma imagem ampliada pós-capture usando um programa de software de edição de vídeo. Seta preta: engolir ponto de disparo (valéculas). Seta branca:. Bolus no esôfago distal, imediatamente antes de passar através da junção GE (asterisco branco) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

PARÂMETROS ANDORINHA	Sistema de Alta Energia	Low Energy System
Inter-Swallow Interval (ISI)	X	X
Jaw Excursion Rate (Lamba taxa equivalente)	X	X
Jaw Excursion Distância	X	X
Rácio de lambe-Swallow	X	X
Swallow Taxa	X	X
Pharyngeal Transit Time (PTT)		X
Bolus velocidade pela faringe		X
Esofágico Transit Time (ETT)		X
Bolus velocidade através de Esôfago		X
Bolus velocidade pela faringe e esôfago	X	X
Bolus Area		X
Pharyngeal Resíduos Área		X
Volume de líquidos consumidos	X	X

Tabela 3: Andorinha Parâmetros Quantificável Usando alta versus baixa energia fluoroscopia Systems.

Recentemente, adquiriu um sistema de fluoroscopia baixa ampliação energia chamada The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ) que foi projetado especificamente para o nosso laboratório para uso comratos e outros roedores pequenos (Figura 10). No entanto, os acentuadamente maiores níveis de ampliação deste sistema tornaram impossível para visualizar todo o mecanismo de deglutição de um rato em um único campo de visão. Em vez disso, são necessárias duas posições de teste, como mostrado na Figura 11. Posição 1 permite a visualização de toda a cabeça e a região proximal torácica. Esta posição é necessário para avaliar as fases oral e faríngea da deglutição. Posição 2 permite a visualização do ponto gatilho andorinha (ie, valéculas) à gastroesofágico (GE). Esta posição é necessário para avaliar a fase esofágica da deglutição. Trabalhos preliminares usando O LabScope em combinação com o novo protocolo VFSS murino identificou 13 parâmetros andorinha objetivas que são consistentemente quantificáveis ​​em camundongos, o que é quase o dobro do número obtido usando alta energia fluoroscopia (ie, convencionais) (Tabela 3). Este o ESULTADOS é atribuído às capacidades de ampliação avançados da LabScope, que permite a visualização de inúmeras estruturas anatômicas (Figura 12), que eram essencialmente invisível quando usando sistemas convencionais: por exemplo, osso hióide, traquéia e vértebras cervicais. Como resultado, nós também foram capazes de analisar os vídeos para a evidência de penetração laríngea e aspiração. Nem penetração aspiração nem foi observado para qualquer rato neste estudo, independentemente das condições de saúde ou doença.

Figura 10:. O LabScope Esquerda: O LabScope executa como um fluoroscope área de trabalho para pequenos animais. Direita: Close-up vista do LabScope com componentes marcados. A tabela de elevador de tesoura é posicionar uma câmara de observação dentro do campo fluoroscope de vista. tp_upload / 52319 / "target =" _ 52319fig10highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Low Energy. Fluoroscopy Sistema de Imagens de um rato obtidos utilizando um sistema de baixa energia fluoroscopia. Note-se que a capacidade de ampliação elevada impede a visualização de todo o mecanismo de andorinha no interior do campo de visão da fluoroscopia. Esquerda: Posição 1 - permite a visualização de toda a cabeça e região torácica proximal. O ponto de disparo andorinha (seta preta) está essencialmente centrada dentro do campo de visão. Direita: Posição 2 - permite a visualização do ponto gatilho andorinha (seta preta) para a junção GE (asterisco branco). Nota do bolo que passa através do esófago distai (seta branca). "target =" _ g11highres.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12:. Usando estruturas anatômicas Visible um Fluoroscopy Sistema Low Energy Mesmo na configuração mais baixa ampliação (à esquerda), estruturas ósseas da cabeça e do pescoço de um rato são facilmente visíveis através do nosso sistema de baixa fluoroscopia energia (ie, A LabScope). As estruturas anatômicas dentro do quadrado preto são mostrados (e rotulados) em maior ampliação para a direita. Melhor visualização das estruturas ósseas permite a quantificação de vários parâmetros andorinha adicionais que eram impossíveis de analisar usando fluoroscopia de alta energia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

t "> Swallow taxa e intervalo inter-andorinha são parâmetros representativos VFSS que podem ser quantificados utilizando ou sistemas de baixas ou altas fluoroscopia energia em combinação com o novo protocolo VFSS murino foram quantificados Esses dois parâmetros engolir para três grupos de ratos:. SOD1-G93A (SOD1) ratinhos transgénicos (isto é, um modelo de esclerose lateral amiotrófica), a doença em fase terminal entre 4-5 meses de idade, os ratinhos C57 envelhecidos (18-24 meses de idade), e um grupo de indivíduos saudáveis ​​jovens (4-8 meses de controle de idade) camundongos C57 e irmãos não transgênicas da colônia SOD1. Todos os dados referem-se a bebedouro só, usando um sistema de baixa ou alta fluoroscopia energia. Não foram encontradas diferenças significativas entre os ratos jovens C57 e jovens não transgênico controle) ratos (do SOD1 colônia em relação a estes dois parâmetros andorinha;., portanto, os dados foram combinados em um grupo geral "controle" de camundongos jovens saudáveis ​​para comparação com os ratos e camundongos com idade entre C57 SOD1 em fase terminal taxa de Andorinha (ie,o número de andorinha durante 2 segundos consecutivos de beber ininterrupto) foi significativamente mais lenta para ratos SOD1 em comparação com os ratos e os controlos com idades entre C57. Intervalo de Inter-andorinha (ou seja, o tempo entre duas andorinhas sucessivas) não foi significativamente diferente entre os grupos. Estes resultados suportam a noção de que os perfis de disfagia provável que seja distintamente diferente para cada condição da doença (Figura 13).

Figura 13:. Resultados preliminares Esta figura mostra resultados preliminares representativos dos dois parâmetros andorinha VFSS quantificados utilizando o protocolo VFSS murino: taxa (à esquerda) e intervalo inter-andorinha (à direita) engolir. Engula taxa foi significativamente mais lento para ratos SOD1 em comparação com camundongos e controles com idades entre C57. Não foram identificadas diferenças significativas entre os grupos para a inter-andorinha entreval. Linhas no topo das barras indicam diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) entre os grupos, identificados utilizando comparações de pares de Bonferroni. As barras de erro representam ± 1 SEM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Centenas de modelos murina (rato e rato) estão comercialmente disponíveis para estudar doenças humanas. No entanto, apenas três modelos de doenças murino foram investigadas especificamente em relação à disfagia: um modelo de mouse ALS ^13,14 e ratos modelos da doença de Parkinson ^12,15-17 e acidente vascular cerebral ^18. Cada um desses estudos preliminares utilizados diferentes metodologias para avaliar a disfagia, tornando-o impossível derivar comparações significativas entre espécies e doenças. Esta importante limitação pode ser superada em estudos futuros, utilizando o protocolo VFSS murino recém-desenvolvido que permite a quantificação objetiva de inúmeros parâmetros Andorinha em animais auto-alimentação.

VFSS resultados bem-sucedidos são depende de três componentes críticos: 1) câmaras de teste que permitem a auto-alimentação ao estar desenfreado em um espaço confinado, 2) receitas que mascaram o sabor aversivo / odor de venda no mercado ag contraste oralentos, e 3) um protocolo de teste passo-a-passo que permite a quantificação da fisiologia engolir. O efeito combinado produz um baixo stress, ambiente confortável, auto-alimentando exame que evoca alimentação típica e comportamentos de deglutição. A eliminação de um ou mais desses componentes vai ter um impacto negativo nos resultados do estudo. Exemplos de resultados negativos incluem a incapacidade de manter os animais no campo fluoroscopia de vista, comportamentos indesejáveis ​​que distraem de beber, a aversão ao agente de contraste oral, e incapacidade de quantificar parâmetros engolir devido a episódios de bebedeira insuficientes.

Um dos grandes desafios na obtenção de resultados ótimos VFSS estava projetando uma câmara de teste adequado. Numerosas revisões de nosso projeto protótipo culminou em uma câmara de observação que mantém suficientemente ratos no campo de visão e previne comportamentos que distraem de beber. As câmaras foram feitas utilizando máquinas de trituração para obter dimensões uniformes de the tubos e tampas finais, garantindo assim a permutabilidade de componentes para várias câmaras de observação do mesmo diâmetro. As dimensões internas (diâmetro e comprimento) foram pareados a ser um pouco maior do que o tamanho do corpo de um rato adulto, o que resultou em uma câmara de teste suficientemente estreito que permite andar em linha reta e se virar. O desenho estreito, em combinação com o posicionamento estratégico do bico e da cavilha de taça em somente no final, mantém a cabeça e corpo de ratos alinhadas ao longo do comprimento da câmara, enquanto o consumo. Uma vez envolvido em beber, ratos permanecem notavelmente auto-estabilizado no bico ou tigela por alguns segundos de cada vez, resultando em artefato movimento mínimo para interferir com o teste. Assim, é possível obter sem distorções, observação close-up de gravação / vídeo e imagem videofluoroscópica de ratos, enquanto o consumo nos planos laterais e dorso-ventral.

Ratos (e outros pequenos roedores) são naturalmente inclinados a verk abrigo em espaços pequenos. Como resultado, eles entrar livremente na câmara de ensaio (com uma extremidade já fechada por uma tampa final), quando ele é colocado na gaiola, eliminando desse modo o esforço / ansiedade causados ​​por manuseamento (isto é, escolhe-se manualmente o animal para colocá-lo na câmara). Uma vez que o rato entra na câmara, a outra extremidade é fechada por uma ponteira de fixação tampa 2 ^nd. Este projeto impede fuga ao criar uma câmara de teste ansiedade baixo para os ratos para explorar livremente.

A forma quadrada da câmara fornece base de estabilidade de movimento que permite que ele seja utilizado de uma maneira livre de pé, eliminando assim a necessidade de testes dentro de uma gaiola de roedor padrão. Todo o aparelho é leve, portátil, empilhável para fins de armazenamento, resistente, fácil de limpar e pode ser autoclavado. Ainda que as câmaras foram inicialmente projetados para uso com fluoroscopia, eles também são compatíveis com a radiografia spot-filme, neuroimagem (por exemplo, ressonância magnética, PET, CT), e visual observação / gravação de vídeo de vários comportamentos.

Um segundo grande desafio de superar foi mascarar o aversivo gosto / odor de agentes de contraste orais (ou seja, sulfato de bário e Iohexol). Dado que a sensibilidade ao sabor varia amplamente entre as estirpes de ratinho ^19-21 e talvez com ^22,23 idade, foi necessário identificar uma única solução de ensaio que foi aceitável para todos os ratinhos, independentemente da estirpe e idade. Este resultado é essencial para permitir uma comparação directa da capacidade de deglutição / disfunção entre estirpes e idades, eliminando simultaneamente os resultados de confusão devida a diferenças na reologia (por exemplo, viscosidade, densidade, etc.) e as propriedades químicas das soluções de ensaio. Para este fim, foi desenvolvida uma abordagem simples palatabilidade rápida, de triagem para identificar o intensificador de sabor preferido para mascarar o gosto repugnante / odor de agentes de contraste oral durante VFSS murino. Os métodos foram modelado após o teste de exposição breve, o que exige uma lambidaometer (ie sensor, lambida) a registar taxas de lamber durante a primeira 2 min depois de um período de regulação de água (ou seja, a retenção de água durante a noite) para induzir sede ^24,25. A lickometer não estava disponível para este estudo; portanto, a preferência foi avaliada por observações comportamentais, bem como métodos de gravação de vídeo padrão para taxa lambida que tenham sido previamente validado em nosso laboratório ^13,14. Utilizando esta abordagem de rastreio palatabilidade, o chocolate foi identificado como o intensificador de sabor preferido por estirpes C57 e C57 / SJL. Especificamente, 100% dos ratinhos em cada gaiola prontamente bebeu soluções de chocolate com sabor dentro de 30 segundos de exposição, simultaneamente com vários ratinhos beber no bico. No entanto, a adição de bário resultou em apenas breves ataques bebendo pela maioria dos ratinhos, independentemente da concentração de bário ou de chocolate.

Uma alternativa é a de bário iohexol, um agente de contraste contendo iodo, que apenas recentemente foi reconhecida como um suitabela alternativa ao sulfato de bário para VFSS humano ^10; assim, ainda não foi normalizado para esta finalidade. Várias concentrações diferentes de iohexol achocolatados foram oferecidos aos camundongos. Receitas contendo até uma solução a 50% do estoque iohexol (350 mg de iodo por ml) foram prontamente bebeu pela maioria dos camundongos após um período de regulação da água durante a noite. As concentrações mais elevadas resultaram em comportamentos de esquiva. Uma solução ioexol 50% (350 mg de iodo por ml) produzido radiodensity suficiente ao ser engolido por ratos, enquanto que concentrações mais baixas foram marcadamente menos visível e impediu quantificação da fisiologia andorinha. Portanto, a solução de ensaio óptima para VFSS com ratinhos foi identificado como uma solução 50% de iohexol com aroma de chocolate adicionado. Testes de palatabilidade Repita não resultou em comportamentos de fuga ou eventos adversos.

Um terceiro desafio a superar estava impedindo ratos de girar / inclinar sua cabeça enquanto beber, que obscurece a visualizaçãodo mecanismo de deglutição durante VFSS. Potável a partir de uma bacia de peg-posicionado logo acima do chão, numa extremidade da câmara resolvido este problema. Existem várias vantagens adicionais da utilização de uma cavilha de taça em vez de uma garrafa tubo Sipper. Por exemplo, um volume calibrado de líquido pode ser pipetado para a cavilha de taça através de um orifício de ventilação na tampa final do tubo de observação. Esta abordagem permite a quantificação do volume de solução de teste consumiu durante o breve período de teste VFSS minuto. Além disso, o aumento da área de superfície da solução teste na taça peg, em comparação com uma abertura de pequeno tubo sipper, pode proporcionar maior estímulo olfativo para motivar ainda mais beber. PEG-taças pode ser mais adequado para o estudo da estirpe de ratos jovens ou mais pequenas, como a altura do recipiente é uma distância estandardizada a partir do piso. Em contraste, comprimentos de tubo sipper deve ser ajustado para acomodar diferentes camundongos de tamanho, o que acrescenta uma outra variável potencialmente confundindo a considerar. Além disso, o modo de ratols de doenças neurológicas podem ter dificuldade em atingir uma garrafa tubo sipper devido ao comprometimento motor dos membros, enquanto que eles podem facilmente chegar a um bowl peg. Ratos com língua e / ou sintomas de disfunção pode ser incapaz de pressionar suficientemente a bola no bico para aceder ao líquido; usando peg-bacias pode eliminar essa confundem. Por estas razões, o uso de PEG-taças ao longo do tubo sipper garrafas é o método preferido de teste VFSS murino. No entanto, as câmaras de observação foram concebidos para acomodar bocal para beber, conforme necessário. Uma ressalva importante a considerar é que as taxas de lamber são conhecidos por diferem entre bico e bacia beber ^13,26. Portanto, a escolha de bico ou peg-bacia para VFSS deve ser coerente dentro e entre experimentos.

Um quarto desafio foi identificar parâmetros andorinha quantificáveis ​​para ratos que são comparáveis ​​aos parâmetros VFSS comumente utilizados em pesquisas humanos e prática clínica. Nossos resultados preliminares mostraram atipo de sistema de fluoroscopia determina que engolir parâmetros podem ser investigados em ratinhos. A maioria dos centros de pesquisa e definições médicas têm alta energia (75-95 kV, 1-5 mA) fluoroscopia projetado para uso com pessoas e animais de maior porte, que resultam em excepcionalmente má qualidade de imagem ao testar os ratos e outros pequenos animais. Como exemplo, um estudo recente usando um fluoroscope alta energia com ratos foi capaz de identificar apenas 4 parâmetros quantificáveis ​​andorinha ^12, e fomos capazes de identificar apenas 7 parâmetros engolir para ratos no presente estudo. Para superar esta limitação importante, obtivemos recentemente um sistema de baixa fluoroscopia energia chamada The LabScope (Glenbrook Technologies). O sistema é um fluoroscópio miniatura, que gera um feixe contínuo de cone de raios X com energias de fotões entre 15 e 40 kV e um pico de corrente no tubo de 0,2 mA (8 W de potência máxima). Os níveis mais baixos de energia deste sistema são melhor atenuada pelo osso e tecido mole fina de ratinhos e, assim, proporcionar mais altos padrõesresolução de contraste r do que o convencional (ou seja, de alta energia) fluoroscopia. O feixe de raios-X de O LabScope é dirigida a um cinco centímetros de diâmetro intensificador de imagem, que é marcadamente menor do que a 15-57 cm de diâmetro intensificador de imagem de fluoroscopia convencionais. A distância mínima da fonte ao intensificador (SID) do LabScope é ~ 6 cm (em contraste com ~ 30 cm para fluoroscopia convencionais), o que proporciona uma maior capacidade de ampliação. Além disso, O LabScope usa tecnologia patenteada que amplia digitalmente a imagem em até 40 vezes, em tempo real, sem alterar o SID. O resultado é, em essência, um raio-X microscópio que pode zoom in e out em tempo real para visualizar pequenas regiões de interesse, como o mecanismo de deglutição de um mouse.

A grande vantagem deste sistema de fluoroscopia de baixa energia é melhorada segurança de radiação. Além dos animais que receberam doses mais baixas com o LabScope, os investigadores que utilizam o sistema são expostos a les significativamentes dispersão da radiação. A exposição à radiação diretamente na frente da unidade no painel de controle é de 10,3 mR / hr. A uma distância de 1 m na frente da unidade, a exposição cai para 580 mR / hr. A maioria dos outros locais da sala tem baixíssima exposição abaixo dos 10 mR / hr. Apesar desta melhoria, temos tomado medidas adicionais para melhorar a segurança de radiação. Por exemplo, proteção de acrílico com chumbo foi adicionado ao redor do LabScope bloquear fótons espalhados de raios-X, que permite aos pesquisadores para realizar testes VFSS murino sem usar proteção pessoal (por exemplo, aventais de chumbo, protetores de tireóide, e copos). Além disso, o acrílico claro permite a visualização do rato a partir de uma distância. Mais segurança de radiação é fornecida por uma mesa de tesoura elevador motorizado, que é controlada remotamente pelo investigador. A partir de uma distância de até 3 m do fluoroscope, os pesquisadores podem usar o dispositivo de controle remoto para ajustar a posição vertical e horizontal da câmara de observação dentro do bea de raios-Xm. Como resultado, as regiões anatómicas de interesse pode ser mantido dentro do campo de vista fluoroscopia enquanto o rato se move livremente dentro da câmara de observação. Embora o elevador de tesoura foi projetado para uso com o LabScope, também é compatível para uso com fluoroscopia convencionais para melhorar a segurança de radiação para os investigadores. Um passo final para melhorar a segurança da radiação durante murino VFSS implica a utilização de um sistema de entrega de seringa para líquidos. Este sistema inclui um pé de 3-4 (ou mais, se necessário) comprimento de tubagem de PE, o que permite a rápida e eficiente entrega de líquidos para dentro da bacia a partir de uma cavilha de distância. Este sistema de entrega de seringa para líquidos, em combinação com as câmaras de observação, também pode ser utilizado com fluoroscopia convencionais.

Trabalhos preliminares utilizando o LabScope, em combinação com o novo protocolo VFSS murino, demonstra uma importante vantagem em relação aos sistemas convencionais de: o número de parâmetros de andorinha que pode ser quantificada fiavelmente ié quase o dobro. No entanto, as estruturas dos tecidos moles do mecanismo de deglutição (por exemplo, língua, véu, parede posterior da faringe e epiglote) dos camundongos não são facilmente visíveis ao usar sistemas de fluoroscopia de energia baixas ou altas. Portanto, nós nos concentramos em quantificar as medidas de fluxo de bolus, em vez de a biomecânica da deglutição. Estávamos predominantemente interessado em parâmetros que podem ser quantificados com base em unidades de tempo, a área, distância, volume, etc., em vez de usar medidas de escala do tipo Likert. Numerosos parâmetros de fluxo de bolus cumprir estes requisitos foram descritos na literatura VFSS humana, tais como o tempo de trânsito oral, ^{27-29, 27-33} faríngea tempo de trânsito, e o tempo de trânsito esofágico ^34-36, para citar apenas alguns. Transporte Bolus através da cavidade oral não era facilmente visível em ratos, provavelmente devido ao pequeno tamanho bolus durante beber espontânea. No entanto, fomos capazes de quantificar de forma fiável de faringe e esôfago trânsito vezes, bemcomo várias outras medidas relativas ao fluxo de bolus e desembaraço. Identificação de parâmetros de translação andorinha adicionais é esperada, já que otimizar as capacidades do LabScope.

Os resultados deste estudo mostraram que os ratos demorar alguns licks rítmicos por gole durante beber espontânea, com cada pequeno líquido bolus sequencialmente preenchendo o espaço vallecular antes de acionar a andorinha da faringe. Este comportamento, que é típico para os mamíferos que usam lambendo como o principal meio de ingestão de líquido ^37-40, assemelha-se o padrão de chupar-andorinha rítmica da deglutição bebê humano e todos os mamíferos infantis em geral. Infant fisiologia engolir é caracterizada por vários rítmica suga seguido por uma andorinha faríngea reflexiva, comumente descrito como o ciclo de chupar-andorinha ^37,41-43. Assim, os de língua e mandíbula movimentos rítmicos envolvidos nos comportamentos ingestivo de lambedura de ratos pode ser mais comparável ao ingestivo sugadores comportamentos de humum crianças, em vez de copo bebendo por crianças e adultos. Temos sido, portanto, quantificar a relação da taxa e lamber-andorinha lick de camundongos para futuras comparações com a relação de sugar e sugar taxa de-andorinha dos bebês humanos. Talvez a pesquisa VFSS murino irá fornecer insights sobre distúrbios da deglutição de desenvolvimento.

Como acontece com qualquer novo método de pesquisa, áreas de melhoria foram identificadas. Por exemplo, o protocolo VFSS murídeo foi desenvolvido utilizando estirpes C57 e C57 / ratinho SJL; que ainda não tenha sido testada em ratos. As câmaras de observação terá de ser aumentadas em tamanho (diâmetro e comprimento) para acomodar o maior tamanho corporal de ratos. Além disso, não se sabe se o iohexol com sabor a chocolate é adequado como uma solução de teste universal VFSS murino. Portanto, o teste maior escala com várias linhagens de camundongos e ratos é garantido para este fim. Além disso, o uso de bário como um agente de contraste para murino VFSS não deve ser excluída. Ratos preferido claramente o iohexol receitas mais de bário; tentativas porém mais rigorosos e sistemáticos, mascarando o aversivo gosto / odor de bário pode fornecer alternativas palatável para iohexol. Futuros estudos comparando os efeitos do sulfato de bário e iohexol (bem como outros potenciais agentes de contraste oral) sobre a preferência gosto e engolir fisiologia em camundongos e ratos, sem dúvida, fornecer informações importantes que é diretamente relevante e de translação para VFSS humano.

VFSS com os seres humanos inclui várias consistências de alimentos e líquidos, e disfagia é mais aparente ao engolir líquidos finos e secos, alimentos sólidos ^44,45. O protocolo VFSS murino é, por conseguinte, a ser expandido para incluir consistências adicionais que podem facilitar a detecção e quantificação de disfagia em modelos de doenças. Também será necessário para conduzir o teste de viscosidade de líquidos para as receitas VFSS murino, a fim de ajustar as viscosidades para coincidir com os utilizados durante a VFSS humano. Enfrentar estes limiteções vai facilitar a identificação de biomarcadores VFSS translacionais de disfagia, que podem ser comparados directamente entre murganhos, ratos e seres humanos.

O utilitário de VFSS murino pode ser significativamente melhorada através da implantação de marcadores radiopacos em estruturas de tecidos moles do mecanismo de deglutição que de outra forma não são visíveis, permitindo, assim, investigações de biomecânica da deglutição. Esta abordagem tem sido usado com sucesso por muitos anos para estudar a biomecânica da deglutição em porcos infantis, usando uma variedade de clips e fios de metal ^37,42. Esperamos que o uso de marcadores semelhantes, mas de menor dimensão, em ratinhos que permitem a quantificação de vários parâmetros adicionais andorinha para comparação com os grandes mamíferos, incluindo seres humanos. Estamos actualmente a desenvolver metodologia para implantação de marcadores radiopacos para a língua, palato mole, faringe, laringe e esôfago proximal de ratos para testar esta hipótese.

O recordin vídeog taxa de quadros do fluoroscopia LabScope e convencionais é limitado a 30 frames por segundo (fps). No entanto, os nossos resultados preliminares mostraram que toda a fase da faringe de engolir para ratinhos saudáveis ​​ocorre em menos de 66 ms (ou seja, 2 frames), que é aproximadamente 10 vezes mais rápido do que os humanos. Assim, a fase faríngea da deglutição em ratos ocorre tão rapidamente que os detalhes não são sensíveis com uma câmera de 30 fps. A maior taxa de quadros (provável> 100 fps) será necessário suficientemente visualizar e quantificar os movimentos extremamente rápidos e complexos da fase faríngea da deglutição em camundongos e outros roedores. Em conjunto com uma maior taxa de quadros, incorporando tecnologia biplanar para geração de imagens 3D fluoroscopic certamente expandir o murino utilitário VFSS. Portanto, as considerações de design futuras deverão incluir uma câmera de alta taxa de quadros e recursos de imagem biplanares.

Por fim, a radiação de baixa dosagem foi mostrado para provocar esterilidade emC57 fêmeas, resultando em níveis alterados de hormônios ovarianos estimulada que podem confundir estudos tempo de vida ^46. Os resultados relativos especificamente aos efeitos da exposição a radiação de baixa dose repetida associada ao teste VFSS ainda não foram investigados em ratos, outros animais ou seres humanos. No entanto, a disfunção do ovário (não relacionados com a exposição à radiação) em fêmeas humanas tem sido associada a perturbações da motilidade gastrointestinal, e, especificamente, a disfagia, em alguns casos, ^47, que fornece ainda outra ressalva a considerar ao conceber estudos futuros VFSS que incluem fêmeas (animais e seres humanos ). Exclusão de fêmeas devem ser evitados, como diferenças significativas na capacidade de deglutição de gênero têm sido relatados por pessoas ^48,49 e seria importante para detectar e caracterizar em modelos de doenças animais também. Por conseguinte, os resultados de estudos longitudinais VFSS em ratinhos e ratos de ambos os sexos têm um enorme potencial para os seres humanos de translação em relação ao dysphagia, bem como aos riscos de exposição a radiação de baixa dose associados com testes VFSS repetição.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycarbonate tubing for observation chambers	McMaster-Carr	3161T41	Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall
Polycarbonate sheet  for observation chambers	McMaster-Carr	9115K71	End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4"
Polycarbonate sheet  for observation chambers	McMaster-Carr	8574K281	Peg-bowls for observation tubes
Silicone O-rings  for end-caps of observation chambers	McMaster-Carr	9396K108	S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r
Silicone stoppers for observation chambers	McMaster-Carr	2903K22	Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
Centrifuge tubes for sipper tube bottles	Evergreen Scientific	222-3530-G80	30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/
Silcone stoppers for sipper tube bottles	Saint-Gobain Performance Plastics	DX263031-10	Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack;  http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS
Stopper borers for sipper tube bottles	Thomas Scientific	3276G40	Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch  http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
Drinking tubes for sipper tube bottles	Ancare	TD-100	2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point
Iohexol for making oral contrast agent solution	GE Healthcare		350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque
Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent	Herseys
10 ml syringe for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	309604	Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
Catheter tubing for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	427451	Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp
Needle for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	427560	15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp
Delrin acetal resin rod for syringe delivery system	McMaster-Carr	8576K15	1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf
Acrylic sheeting for scissor lift	Ponoko		Laser cut http://www.ponoko.com
3D printed ABS frame	Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri
Brass rods for scissor lift	Amazon	TTRB-03-12-03	made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M
Drawer slide for scissor lift	Richelieu	10292G116	Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754
28BYJ-48 stepper motor for scissor lift			2 each
ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift	Toshiba	ULN2003APG	Used as stepper drivers (2 each)
ATTINY85 microcontroller for scissor lift	Atmel	ATTINY85-20PU	2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html
Nylon spur gear	McMaster-Carr	57655K34	2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz
Nylon spur gear rack	McMaster-Carr	57655K62	2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9
4-40 nylon machine screws	McMaster-Carr	95133A315	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q
4-40 nylon hex nuts	McMaster-Carr	94812A200	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29
Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104	McMaster-Carr	9452K318	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7