Het aanpassen van de Mens Videofluoroscopisch Swallow Studie Methoden voor het opsporen en karakteriseren Dysphagia in Muizen Disease Models

Summary

Deze studie succesvol menselijk Videofluoroscopisch slikken studie (VFSS) methoden voor gebruik met murine ziektemodellen behoeve van translationeel dysfagie onderzoek vergemakkelijken aangepast.

Abstract

Deze studie aangepaste menselijke Videofluoroscopisch slikken studie (VFSS) methoden voor gebruik met murine ziektemodellen behoeve van translationeel dysfagie onderzoek vergemakkelijkt. Succesvolle resultaten zijn afhankelijk van drie belangrijke componenten: testkamers die zichzelf voeden toestaan ​​terwijl ongebreidelde in een afgesloten ruimte, recepten die de aversieve smaak / geur van commercieel beschikbare orale contrastmiddelen maskeren, en een stap-voor-stap testprotocol dat maakt kwantificering van zwaluw fysiologie. Eliminatie van één of meer van deze componenten een nadelig effect op de studieresultaten hebben. Bovendien zal het energieniveau vermogen van het fluoroscopie systeem welke slikken parameters onderzocht kan. De meeste onderzoekscentra hoge energie doorlichting ontworpen voor gebruik bij mensen en grotere dieren, hetgeen resulteert in uitzonderlijk slechte beeldkwaliteit bij het testen van muizen en andere kleine knaagdieren. Ondanks deze beperking, hebben we zeven VFS geïdentificeerdS parameters die consequent kwantificeerbaar muizen bij gebruik van een hoge energie fluoroscoop in combinatie met de nieuwe muis VFSS protocol. We hebben onlangs een lage energie fluoroscopie systeem verkregen met een uitzonderlijk hoge beeldresolutie en vergroting mogelijkheden die is ontworpen voor gebruik met muizen en andere kleine knaagdieren. Voorbereiding gebruik van dit nieuwe systeem, in combinatie met de nieuwe muizen VFSS protocol, heeft 13 slik parameters die consequent kwantificeerbaar muizen, die bijna het dubbele aantal verkregen met conventionele (dat wil zeggen, hoge energie) geïdentificeerd doorlichting. Identificatie van bijkomende zwaluw parameters wordt verwacht aangezien we het optimaliseren van de mogelijkheden van dit nieuwe systeem. De resultaten tot nu toe tonen het nut van het gebruik van een lage energie fluoroscopie systeem op te sporen en te kwantificeren subtiele veranderingen in zwaluw fysiologie die anders misschien over het hoofd gezien bij het gebruik van hoge energie doorlichting om muizen ziekte modellen te onderzoeken.

Introduction

Dysfagie (slikken impairment) is een veel voorkomend symptoom van een groot aantal medische aandoeningen die mensen van alle leeftijden. Voorbeelden omvatten beroerte, ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer, hersenverlamming, spierdystrofie, amyotrofe laterale sclerose (ALS), de ziekte van Batten, hoofd en halskanker, vroeggeboorte en geavanceerde veroudering. Dysfagie is sterk gecorreleerd met mortaliteit, gewoonlijk als gevolg van ernstige ondervoeding of longontsteking die ontstaat wanneer bacteriën beladen voedsel / vloeistof / speeksel in de longen ingeademd ^1-4. Deze slopende en levensbedreigende medische aandoening treft meer dan 15 miljoen mensen per jaar in de Verenigde Staten alleen al ^3. Ondanks de hoge prevalentie en bijbehorende negatieve resultaten zijn de huidige behandelingsmogelijkheden voor dysfagie beperkt tot palliatieve (plaats curatief) benaderingen, zoals dieet modificatie (bijv vermijden specifieke voedsel / vloeistof consistenties), orthostatische veranderingen (bijvoorbeeld, Tucking de kin bij het ​​slikken), motor benaderingen (bijv oefent gericht spieren in de mondholte, keelholte, strottenhoofd en), sensorische benaderingen (bijv uitvoering smaak, temperatuur, en / of mechanische stimulatie) en sondevoeding (bijvoorbeeld voeding en hydratatie toegediend via nasogastrische (NG) buis of percutane endoscopische gastrostomie (PEG) buis). Deze behandelingen dienen slechts als symptomatische behandeling in plaats van gericht op de onderliggende oorzaken van het probleem. Inderdaad, een belangrijke belemmering voor de ontdekking van nieuwe, effectieve behandelingen voor dysfagie is de beperkte wetenschappelijke kennis van de verantwoordelijke pathologische mechanismen die waarschijnlijk verschillend voor elke ziekte.

Dysfagie diagnose wordt voornamelijk gemaakt met behulp van een radiografisch procedure genaamd een Videofluoroscopisch slikken studie (VFSS), ook bekend als een aangepaste barium slikken studie. In de afgelopen 30-plus jaren is deze diagnostische test beschouwd als de gouden standaard voor evaluating zwaluw functie ^5-7. Deze test houdt in dat de patiënt zitten of staan ​​op het pad van de X-stralen van een fluoroscopie machine, terwijl vrijwillig inname van voedsel en vloeibare consistenties gemengd met een oraal contrastmiddel, meestal bariumsulfaat ^8,9 of iohexol ^10. Als de patiënt slikt, kan voedsel en vloeistof bevattende contrastmiddel zien in real time via een computermonitor op weg van de mond naar de maag. Weke delen ook zijn zichtbaar en kunnen worden beoordeeld ten opzichte van de structuur en functie. Patiënten worden gevraagd om de verschillende zwaluwen van elk voedsel en vloeibare consistentie te voeren, die allemaal op video opgenomen voor latere weergave en beeld-voor-beeld-analyse om de aanwezigheid en de mate van dysfagie te kwantificeren. Talrijke fysiologische componenten van slikken zijn meestal geanalyseerd, zoals de anatomische triggerpoint van de keelholte zwaluw, bolus transittijd via de keelholte en de slokdarm, omvang en duur van larynGeal hoogte, locatie en hoeveelheid post-zwaluw residu, en het optreden van en fysiologische reden voor aspiratie ^7,11.

Aspecten van het menselijk VFSS protocol werden onlangs aangepast voor het bestuderen van de vrij te gedragen ratten; werden echter resultaten beperkt, omdat de ratten in het Videofluoroscopisch gezichtsveld is gebleven tijdens de test ^12. VFSS niet eerder geprobeerd muizen. Succesvolle aanpassing van de menselijke VFSS protocol voor muizen en ratten zou een nieuwe onderzoeksmethode de honderden thans bestaande murine (muis en rat) modellen van ziekten waarvan bekend is dat dysfagie veroorzaken bij de mens kunnen onderzoeken. Deze nieuwe methode (hierna te noemen muizen VFSS) zou dus haasten identificatie en validatie van muismodellen van dysfagie die geschikt zijn voor het onderzoeken van de onderliggende neurofysiologische mechanismen in spieren, zenuwen, en hersenweefsel dat pathologisch zijn en bijdragen aan dysfagie zijn in mens. Bovendien zou muizen VFSS identificatie van objectieve metingen (biomarkers) van zwaluw functie / dysfunctie die rechtstreeks kan worden vergeleken met de mens mogelijk te maken. Deze cross-species Videofluoroscopisch biomarkers kan dan als nieuwe uitkomstmaten behandelingseffectiviteit preklinische studies met muizen en ratten, die beter zou vertalen naar klinische proeven met mensen kwantificeren.

Hiertoe werd het muriene VFSS protocol vastgesteld middels -100 muizen van beide geslachten. Alle muizen waren ofwel C57 of hybride C57 / SJL stammen. De C57 muizen werden niet genetisch veranderde, terwijl C57 / SJL was de achtergrond stam voor een kolonie van transgene SOD1-G93A (of SOD1) muizen, de meest gebruikte diermodel van ALS. De SOD1 kolonie was een geschatte 50-50 mix van transgene (dat wil zeggen, ALS getroffen) muizen en niet-transgene (dat wil zeggen, onaangetast) nestgenoten.

De muizen VFSS protocol bestaat uit drie componenten:

1. Recepten die de aversieve smaak / geur van orale contrastmiddelen te maskeren en te produceren voldoende radiodensity om een ​​adequate visualisatie van slikken toestaan,
2. Een stap-voor-stap testprotocol dat dier naleving maximaliseert, minimaliseert de totale testtijd en blootstelling aan straling, en maakt kwantificering van verscheidene slikt parameters voor elke fase van slikken (dwz orale, faryngeale en oesofageale).

Het gecombineerde effect van een comfortabele, lage spanning, zichzelf voeden onderzoek omgeving die de beoordeling van de typische voeden en slikken gedrag van muizen toelaat.

Protocol

De muizen VFSS protocol volgt een goedgekeurde Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocol en NIH richtlijnen.

1. Construct Observation Chambers uit Polycarbonaat Tubing en Afdekken (figuur 1)

1. Snijd 5 cm breed, vierkant polycarbonaat buis (~ 2 mm wanddikte) in 16 cm lengte met een handmatige freesmachine. De meeste muizen voldoende passen binnen deze afmetingen, hetgeen resulteert in een smalle testkamer dat lopen en omdraaien wens mogelijk maakt. Een wanddikte van ~ 2 mm biedt voldoende stevigheid zonder aanzienlijk verzwakken van de X-stralen.
   1. Twee types van kamers zijn essentieel om dit protocol: "uitloop buizen", ontworpen voor het leveren van vloeistoffen via de tuit, en "ventilatiebuizen", ontworpen voor het leveren van vloeistoffen via pin-bowl.
      1. Voor "spuit tubes", een kleine langwerpige gat (12 x 8 mm) in de top van elke buis nabij een uiteinde via een manuele frees machine. Dit gat wordt gebruikt om te drinken oplossingen via een sipper buis uitloop leveren tijdens gedragsconditionering en VFSS testen.
      2. Voor "ventilatiebuizen" drill 9 kleine ventilatiegaten in de top van elke buis nabij een uiteinde. Deze buis wordt gebruikt tijdens VFSS testen met een pin-bowl in plaats van sipper buis.
      3. Het is mogelijk om tuit buizen te gebruiken bij het afleveren van vloeibare via peg-bowl; echter, moet de opening in de kamer plafond geblokkeerd storende verkennende gedrag voorkomen muizen (zie stap 6.2.2).
2. Cut polycarbonaat folie (3/4 "dik) in eindkappen (50 x 50 mm, 2 per buis) met een geautomatiseerde freesmachine, ook wel een numerieke besturing (CNC) machine.
   1. Mill een langwerpige groef (19 x 6 mm) nabij een rand van het binnenvlak van iedere eindkap. Gebruik deze groef aan een pin-bowl veilig te stellen voor muizen om uit te drinken tijdens VFSS testen.
   2. Mill 5 ronde ventilatieopeningen (6 mm diameter) Door elke eindkap.
   3. Mill een kleinere ronde gaten (5 mm diameter) door de eindkap, direct boven de langwerpige groef. Gebruik dit gat om vloeistof te leveren in de peg-bowl tijdens VFSS testen.
   4. Aan de buitenkant gezicht van de end-cap, molen een 9/16 "diameter beveiligingsverzinking dat is 1/4" diep rond deze kleinere gat.
   5. Mill afstand 2 mm langs de omtrek van de binnenzijde van de eindkap op een diepte van 7 mm tot een stap die gemakkelijk voegt naar het uiteinde van de buis te maken.
   6. Molen 1 mm groef in de stap van de eindkap op een O-ring, die nodig is om te voorkomen dat de einddop van het vallen van het uiteinde van het buisje.
   7. Ronden blootgesteld randen en schuine alle hoeken van de eindkappen om te voorkomen dat het kauwen van muizen.
3. Maak peg-kommen van polycarbonaat platen met behulp van een CNC-machine. Totale afmetingen moet 24 x 19 x 6 mm ^3, met een 10 x 3 mm ² kom-vorm depressie aan de ene kant zijn. Een peg-bowl is needed voor elke buis. Peg-schalen moet goed voegen in de langwerpige groef in de eindkappen (figuur 2).

Figuur 1:. Waarneming Chambers Observatie kamers werden ontworpen om vrij gedragen dieren in de fluoroscopie gezichtsveld behouden. Deze foto's tonen kamer componenten van essentieel belang voor het uitvoeren van VFSS. Top: "uitloop buis", ontworpen voor het leveren van vloeistoffen via uitloop. Bottom: "ventilatie buis", ontworpen voor het leveren van vloeistoffen via pin-bowl. De twee end-caps zijn uitwisselbaar tussen uitloop en ventilatie buizen.

Figuur 2:. Peg-schalen Elke peg-bowl klikt in een groef in de binnenzijde van iedere eindkap. Links:ongemonteerd componenten. Midden: geassembleerde onderdelen. Rechts:. Buitenkant gezicht van de end-cap Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Construct Sipper Tube Flessen van Centrifuge Tubes, Silicone Stoppers en Metal tuiten (figuur 3)

1. Gebruik een stopper boor (5/16 ") om een ​​middengat door elk siliconenstop.
2. Breng een paar druppels minerale olie in het boorgat en handmatig invoegen een metalen tuit in het brede uiteinde van de stop. Straight balpen tuiten hebben de voorkeur omdat straight open-end tuiten resulteren in een overmatige lekken en spatten van het contrastmiddel in de observatie kamer, die kunnen interfereren met visualisatie tijdens het testen.
3. Stel de tuit lengte zodat overspant de gehele lengte van de siliconen stop en zich ongeveer 3 cm voorbij het brede uiteinde van de stop.
4. Steek het smalle einde van elke stop (die een druppelbuis) in een 30 ml centrifugebuis.
5. Controleer of de tuit lengte adequaat door deze door het langwerpige gat in de bovenkant van de waarnemingskamer. De tuit punt moet ongeveer 1 cm rusten van het kamerplafond, die voldoende lang gezonde volwassen muizen te bereiken.
   OPMERKING: Langere lengtes resulteren in muizen drinken tijdens het draaien / kantelen van het hoofd, die visualisatie van slikken tijdens VFSS verduistert.
6. Verleng de uitloop lengte aan jongere muizen, kleinere muis stammen, en de muis ziekte modellen die niet de tuit kan bereiken als gevolg van motorische beperking van de ledematen tegemoet.
7. Was de nieuw gemaakte tuiten voor gebruik om de minerale olie, siliconen puin, en andere verontreinigingen te verwijderen tijdens het hanteren.

Figuur 3: Sipper. Tube Flessen Links: gemonteerde componenten. Midden: geassembleerde onderdelen. Rechts:. Muis drinken uit sipper buis in waarnemingskamer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

3. Teken een Spuit Delivery System voor gebruik met Peg-kommen (figuur 4)

1. Gebruik een draaibank adapters maken voor aansluiting polyethyleen (PE) buis aan het waarnemingskamer eindkappen, als volgt beschreven.
   1. Knip 1/2 "diameter acetal staafmateriaal in 1 1/4" lengte secties hierna buis adapters (of adapters).
   2. Aan een uiteinde van elke adapter, verminderen een "sectie lengte bij de tip 3/16" 1/2 diameter, hierin aangeduid als het smalle uiteinde.
   3. Voor de resterende 3/4 "lengte gedeelte van elke adapter (dwz, de 1/2" einde diameter), machine groeven voor handmatige grip tijdens onse. Deze sectie wordt hierna groothoek.
   4. In het brede uiteinde van elke adapter, boor een gat in het midden, dat is "diameter en 1" 0,098 diep.
   5. Boor en ruimen het resterende deel van het centrale gat in elke adapter 0,096 "naar een goede pasvorm op de PE buis leveren.  
2. Snijd PE slang (PE 240, inwendige diameter 1,67 mm) om de gewenste lengte met behulp van een schaar. Een 3-4 voetlengte de afstand tussen de onderzoeker en fluoroscope voldoende toeneemt tijdens VFSS testen om straling veiligheid te verbeteren.
   OPMERKING: Langere lengtes zal een groter volume van het contrastmiddel oplossing tijdens VFSS testen, misschien wel groter dan de standaard 30 ml recept benutten.
3. Plaats een stompe getipt 15 G naald volledig in het ene uiteinde van de PE-slang. De montage moet goed aansluiten.
4. Plaats het andere (vrije) uiteinde van de PE buis door het middelste gat van de adapter buis vanaf tHij brede uiteinde.
5. Trek de PE slang uit de smalle uiteinde van de adapter, zodat het zich uitstrekt ~ 2 mm.
6. Steek het smalle uiteinde van de adapter (met ~ 2 mm PE slang die zich uitstrekt van het) in de eind-dop van een observatie-buis; het moet goed passen in het verzonken gat zich direct boven de pin-bowl.
7. Pas de PE buis lengte bij het smalle uiteinde van de adapter, zodat het nauwelijks zich boven de kom depressie bij pin-schaal.
8. Vul een 10 ml spuit (zonder naald bevestigd) met water uit een beker en verwijder eventuele luchtbellen.
9. Bevestig de spuit aan de naald einde van de PE-slang.
10. Duw langzaam de zuiger om water te leveren in de peg-bowl in de observatie kamer. Stop wanneer de pin-bowl is bijna vol. Vermijd overvulling, die spatten zal veroorzaken tijdens het drinken.
11. Als de pin-bowl niet goed vullen, de lengte van de PE buis tot boven de pin-bowl.
12. Over-verlenging van de PEslang zal verleiden muizen te kauwen tijdens het testen, in plaats van het drinken van de pin-bowl.
13. Als de PE slang niet ver genoeg verlenging neemt vloeistof draaien op de bodem van de waarnemingskamer plaats van vullen van de pin-schaal.
14. Na gebruik, verwijder de spuit en was de hele spuit afgiftesysteem met water en zeep. Gebruik een spuit van 10 ml aan de lucht duwen door de PE-slang aan op het water te verwijderen. Steriliseren in autoclaaf als nodig.

Figuur 4:. Spuit Delivery System Links: gemonteerde componenten. Midden: geassembleerde onderdelen. Rechts:. Muis drinken uit peg-bowl in waarnemingskamer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

4. Construeer een Gemotoriseerde Scissof heftafel voor Remote Positionering van de Observation Chamber (Figuur 5)

1. Bouw een schaarhoogwerker met een 12 x 12 cm platform dat kan verhogen en verlagen van 5 cm het bekijken muizen in verschillende posities binnen de fluoroscopie gezichtsveld tegemoet. Lift materiaal moet metaal of plastic voor gemakkelijke reiniging met ontsmettingsmiddelen.
2. Mount stappenmotoren de hoogte en longitudinale positie van de lift passen.
3. Echtpaar de eerste stappenmotor aan de schaarlift mechanisme om de hoogte te regelen door het vertalen van een lat. Deze koppeling kan een lood schroef of een tandheugel met rondsel gearing zijn.
4. Koppel de tweede stappenmotor aan de schaarlift frame naar de longitudinale positie te controleren door het vertalen van de gehele laadklepframe ten opzichte van de tafel. Deze koppeling kan een lood schroef of een tandheugel met rondsel gearing zijn.
5. Sluit een afstandsbedieningssysteem de stappenmotoren aanpassing van de waarnemingskamer positie mogelijk te maken tijdens beeldvorming en minimaliseert ONDERZOEKtor blootstelling aan straling.
6. Interface handheld afstandsbediening knoppen met een microcontroller chip om de activering en richting van elke stappenmotor controleren.

Figuur 5:. Op afstand bestuurde Schaarheftafel Links: zijaanzicht van schaarlift tafel. Rechts: heftafel met waarnemingskamer gepositioneerd in fluoroscope. De heftafel past de positie van de observatie kamer om muizen in het gezichtsveld te houden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

5. Voer Behavioral Conditioning Voordat VFSS Testen om Maximal Participatie Zorg

1. 1-2 weken voorafgaand aan het testen, onder voorbehoud van muizen VFSS één 's nachts (12-16 uur) waterhuishouding periode te inducerendorst, gedurende welke tijd water wordt ingehouden op de kooi. Het doel van de waterhuishouding is voor dieren tot dorst, niet uitgedroogd zijn. Dieren moeten alert en ontvankelijk blijven. Deze duur en termijn is essentieel voor uitdroging, die kunnen optreden als gevolg van 2 waterregulatie episodes binnen 1 week voorkomen (dat wil zeggen, een voor gedragsconditionering en een voor VFSS testen).
2. Plaats één "tuitbuis" (met één uiteinde gesloten door een eindkap) op de vloer van een kooi met vers strooisel. Het gesloten einde zou moeten zijn het dichtst bij de uitspuitopening in de kamer plafond. Deze stap zorgt voor voldoende ventilatie tijdens het meerdere muizen slaap ineengedoken in de kamer diepte 's nachts. Het open einde maakt muizen om vrij in te voeren / de kamer te verlaten.
3. Verwijder andere verrijking materiaal (bv, nestlet en hut) om muizen te verkennen en te slapen in de kamer 's nachts (Figuur 6) aan te moedigen. Deze stap verzekert dat muizenzijn gewend aan het zijn in de kamer voor lange looptijden voorafgaand aan VFSS testen.
4. Zorg voor een enkele standaard eten pellet per muis op de vloer van de kooi voor overnachting eten; voorzien niet in water of andere hydratatie bronnen.
5. Gebruik een standaard filter boven aan de muizen in de kooi nachts bevatten, de afmetingen van de waarnemingskamer voorkomen standaard draaddeksel van montage in de kooi. Bewaar de verwijderde draaddeksel (bevattend voedsel en water fles) bovenop het filter top verzwaren het deksel en voorkomen muizen ontsnappen.
6. Voer smakelijkheid testen de volgende ochtend, als hieronder beschreven.
   1. Maak een chocolade-smaak-test oplossing in een 30 ml sipper buis fles, zonder toevoeging van contrastmiddel (dat wil zeggen, substituut water voor iohexol). Dit recept is beschreven in tabel 1. Voeg een flesje per kooi te testen.
   2. Verwijder de observatie kamer en vervang de standaard draad deksel. Bieden de chocolade-smaak gebrachteoplossing (kamertemperatuur ~ 22 ° C) gedurende 2 min per kooi, ingebracht door de draad deksel.
   3. Beoordelen smakelijkheid door het observeren van het drinken van gedrag tijdens de 2 min testperiode.
   4. Score smakelijkheid volgens de volgende criteria:
      1. Latentie de eerste muis drankjes aan de tuit minstens 5 seconden zonder onderbreking.
      2. Percentage muizen per kooi dat de oplossing drinken.
      3. Aantal muizen die tegelijkertijd drinken bij de tuit.
   5. De oplossing wordt verteerbaar beschouwd als de meeste muizen per kooi meerdere lange (> 5 sec) aanvallen drink- en indien meerdere muizen gelijktijdig drinken uit de tuit (figuur 7).
   6. Indien het chocoladesmaak oplossing niet verteerbaar, herhaal smakelijkheid testen met andere smaakversterkers bij verschillende concentraties om een ​​voorkeursoplossing identificeren.
   7. Bieden tot vier verschillende oplossingen (bij verschillende concentraties) een voor eenin willekeurige volgorde om meerdere kooien van muizen in een enkele test dag, zonder een wash-out periode of uitspoeling oplossing. Geschikt smaken enhancers om te overwegen voor muizen bestaan ​​uit suiker, kaas, pindakaas, diverse fruit en noten smaken, en melk.
      OPMERKING: smakelijkheid niet uitvoeren testen van meer dan een keer per week om uitdroging van herhaalde waterregulatie episodes te voorkomen.
   8. Het kan enkele weken duren om met succes de aangewezen oplossing voor elke stam van muizen te identificeren. Het doel is om kandidaat smaken die in meerdere lange (> 5 sec) periodes van drinken na blootstelling herkennen aan muizen onmiddellijk (<30 sec), omdat deze kwalificaties essentieel voor het verkrijgen van succesvolle VFSS resultaten worden geacht.
7. Na een gewenste smaak oplossing is geïdentificeerd, terug de waarnemingskamer elke kooi te gedragsconditionering verder, als hieronder beschreven.
   1. Sluit het ene uiteinde-cap aan de observatie kamer aan het einde het dichtst bij deovaal (uitloop) gat.
   2. Bieden muizen de chocoladesmaak oplossing gedurende 2-3 uur aan door de druppelbuis fles door het ovale gat in de bovenkant van de kamer. Deze stap zorgt ervoor dat alle muizen zijn geconditioneerd om te drinken diep in de observatie kamer.
   3. Verwijder de draad deksel de waarnemingskamer tegemoet.
   4. Plaats 1 voedsel pellet per muis op de kooi vloer voor ad libitum verbruik tijdens de testperiode.
   5. Bedek de kooi met een standaard filter boven naar muizen niet kunnen ontsnappen voor de rest van de gedragsconditionering periode. Bewaar de verwijderde draad deksel (met voedsel en water fles) op de bovenkant van het filter boven naar verzwaren het deksel.
8. Zorg voor water en voedsel ad libitum in de kooi toen gedragsconditionering is voltooid.
9. Was de observatie kamers (buizen en end-caps) en sipper buis flessen (tuiten en centrifuge buizen) met water en zeep; steriliseren autoclaaf als nodig. Vermijdenmet aceton om de buizen schoon als het permanente vertroebeling welke de buis opake plaats doorschijnend maakt veroorzaakt.

Figuur 6:. Muizen Exploring Observation Chambers Muizen zijn van nature geneigd om onderdak te zoeken in kleine ruimtes. Daardoor zij vrij komen en verken de waarneming buis wanneer deze zich in de kooi. De meeste muizen worden gevonden slapen in de kamer in de ochtend. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

<td> Chocolade Siroop

INGREDIËNTEN	Chocolade Solution (voor Smakelijkheid Testing)	Chocolade-Flavored Iohexol (voor VFSS Testing)
3 ml	3 ml
Iohexol (350 mg jood / ml)	0 ml	15 ml
Water (DI of gefilterd)	Regel 30 ml eindvolume (27 ml)	Regel 30 ml eindvolume (12 ml)
Final Volume	30 ml	30 ml

Tabel 1: chocolade-smaak-testoplossing Verkozen door C57 en C57 / SJL muisstammen.

Figuur 7:. Smakelijkheid Testen Een indicator van smaak voorkeur tijdens smakelijkheid testen is het aantal muizen die tegelijkertijd drinken uit een tuit in de kooi. Deze afbeelding toont vier muizen tegelijkertijd het drinken van een chocolade-smaak-oplossing, die werd geïdentificeerd als devoorkeur smaakversterker door C57 en C57 / SJL stammen.

6. VFSS Testen Voorbereiding

1. Onderwerp muizen om een 's nachts water reguleringsperiode (dwz onthouden water voor 12-16 uur), zoals beschreven in stap 5 hierboven.
   1. Plaats één "ventilatiebuis" (met één uiteinde gesloten door een eindkap) op de vloer van een kooi met vers strooisel. Het gesloten einde zou moeten zijn het dichtst bij de ventilatiegaten in de kamer plafond. Deze stap zorgt voor voldoende ventilatie tijdens het meerdere muizen slaap ineengedoken in de kamer diepte 's nachts. Het open einde maakt muizen om vrij in te voeren / de kamer te verlaten.
2. De volgende ochtend, verwijder bevuilde observatie kamers van kooien en even uitspoelen met warm stromend water en droog in de voorbereiding op VFSS testen.
   1. Verwijder en reinig slechts één kamer in een tijd om te voorkomen dat het mengen van kamers tussen kooien, die overmatig verkennende gedrag kan leiden datsignificant interfereren met VFSS testen.
   2. Als "uitloop buizen" worden gebruikt in plaats van "ventilatiebuizen" voor VFSS testen, plaatst u een siliconen plug in de tuit opening van de observatie kamer plafond tot verkennende gedrag (Figuur 8) te voorkomen.
   3. Label elke kamer (bv, met hun kooi nummer) om mix te voorkomen.
      OPMERKING: Gebruik een droog uitwisbare marker om elke gereinigd buis etiket voordat u het terug in de kooi. Permanent marker mogen worden omdat het wordt geabsorbeerd door het buismateriaal en niet wassen, zelfs met alcohol of aceton.
3. Bereid de chocoladesmaak iohexol oplossing (of andere smakelijke oplossing).
   1. Maak een recept (30 ml) van de testoplossing (Tabel 1) meerdere kooien.
   2. VOORZORGSMAATREGELEN VOOR iohexol: Bewaar ongeopende iohexol flessen bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht. Gebruik geopend iohexol flessen binnen 24hr, zoals de viscositeit en smaak binnen een dag of zo na blootstelling aan lucht kan veranderen. Als alternatief bevriezen monsters van single-porties (15 ml) in centrifuge buizen voor langdurige opslag. Bereide iohexol testoplossingen moeten binnen enkele uren worden om de versheid te garanderen en vermijding voorkomen muizen. Dien iohexol oplossingen bij kamertemperatuur te voorkomen verwarrende de studie door temperatuureffecten op slikken functie. Gebruik geen overgebleven voorbereid testoplossing niet bevriezen, zoals de chocolade smaak bitter wordt met bevriezing en resulteert in het vermijden van muizen.
4. Bereid de fluoroscopie milieu.
   1. Gebruikt u een (leeg) observatie kamer en peg-bowl (of sipper buis uitloop) om de optimale hoogte en positie binnen de fluoroscope balk die visualisatie van het drinken in de laterale (horizontale) vlak toestaat te bepalen.
   2. Stel de fluoroscopie beeldsnelheid 30 beelden per seconde; hogere (maar niet lager) framesnelheden worden gebruikt indien beschikbaar.
   3. ENSure een radiopake marker juiste kalibratie wordt op de fluorescoop camera / detector zodat deze zichtbaar op de monitor gedurende de gehele test. Deze stap is nodig om de kalibratie van de lengte metingen gebruikt voor het kwantificeren van zwaluw parameters mogelijk te maken.

Figuur 8:. Siliconen Plug Bij gebruik van Peg-Bowls Links: siliconen plug. Rechts: silicone plug wordt getrokken door de druppelbuis opening in de top van de waarnemingskamer. Deze plug voorkomt dat muizen raakt afgeleid door de uitspuitopening bij het ​​gebruik van een pin-bowl in plaats van sipper buis tijdens VFSS testen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

7. VFSS Testen van Muizen

1. Til de kamer uit de kooi en voorzichtig bevestig de 2 ^e end-cap (met peg-bowl bevestigd, als een sipper buis niet wordt gebruikt), zorg dat u de muis (vooral de staart) niet bekneld raken.
   Opmerking: Deze benadering minimaliseert de muis stressrespons gevolge van het behandelen, wat vooral belangrijk voor muizen die zijn getest voor de eerste keer.
2. Met herhaalde testen, kunnen muizen gemakkelijk worden overgehaald om de kamer in te voeren wanneer het wordt geplaatst in de voorkant van hen in de kooi, of wanneer opgeschort door de staart over de kamer te openen.

Plaats de waarnemingskamer (met de muis) in de fluoroscopie machine VFSS testen beginnen in het laterale vlak (dat wil zeggen, horizontaal röntgenbundel).

Zorg voor de chocolade-smaak iohexol oplossing (tabel 1) via pin-bowl of sipper buis fles.

1. Bij gebruik van een pin-bowlLeveren de oplossing via de spuit afgiftesysteem in stap 3 hierboven beschreven. Dit systeem maakt het mogelijk snel en eenvoudig bijvullen van de pin-kom zoals nodig.
2. Bij gebruik van een druppelbuis fles, plaatst de druppelbuis door de ovale opening in de top van de waarnemingskamer. Kantel de fles zodat de tuit is gericht naar het midden van de kamer.

Start de videofluoroscopie opname wanneer de muis begint te drinken.

1. Stel de positie van de waarnemingskamer (via de afstandsbediening schaarheftafel in stap 4 beschreven) zodat het slikmechanisme zichtbaar in het gezichtsveld.
2. Pauzeren opnemen telkens wanneer de muis zich afwendt van de pin-bowl of tuit om de duur van de blootstelling aan straling te minimaliseren.
3. Hervatten opname wanneer de muis terug naar de uitloop of pin-bowl.
4. Vul de peg-kom zoals nodig.
5. Stop met het testen als de muis niet binnen 5 min doet drinken. Het doel is om verschillende lon opnemeng (> 5 sec) scheuten aanhoudende drinken, die typisch is voor de meeste muizen binnen de eerste 2 minuten van het testen.
6. Terug noncompliant muizen om de kooi (zonder water) voor hertesten op een later tijdstip op dezelfde dag; niet meer dan 24 uur water reguleringsperiode. Muizen die noncompliant gedurende drie proeven worden verwijderd uit de studie.

Indien nodig, verandert de fluorescoop om muizen te testen in de dorsale-ventrale vlak (dat wil zeggen verticaal röntgenbundel). Dit vlak wordt gebruikt om afwijkingen in bolus stroom door de keelholte en de slokdarm identificeren bij het inslikken.

Bij het testen van meerdere muizen van dezelfde kooi:

1. Reinig de peg-bowl (en de punt van de PE buis) of sipper buis uitloop met een droge papieren handdoek tussen muizen.
2. Reinig de observatie kamer als nodig is tussen de muizen aan een spetterde iohexol op de wanden te verwijderen. Spoel de kamer met kraanwater en droog met een papieren handdoek.

Bij het testen van muizen weerma verschillende kooi:

1. Gebruik een nieuwe pin-schaal (of wijzigen van de sipper buis uitloop). Anders kunnen muizen worden afgeleid door de geur van andere muizen die dronken uit dezelfde pin-bowl of sipper buis. De pin-kommen en sipper buizen moeten worden geëtiketteerd om verwarring te voorkomen.

Wanneer het testen van alle muizen in één kooi is voltooid, om te voorzien van water en voedsel in de kooi.

Was de observatie kamers (buizen en eindkappen), pin-kommen, spuit leveringssysteem en sipper buis flessen (tuiten en centrifuge buizen, indien gebruikt) met water en zeep; steriliseren autoclaaf als nodig.

Gooi eventuele resterende iohexol oplossing zoals voorgeschreven door veiligheidsrichtlijnen; afvalstroom kan op de meeste faciliteiten aanvaardbaar zijn.

8. Video Analysis

1. Gebruik maken van een video-editing software programma dat frame-voor-frame analyse van de videofluoroscopie opnames toelaat om de zwaluw parameters die van belang (tabel 2) te kwantificeren. Identificeren van ten minste twee getrainde beoordelaars om elke video in een blinde manier te analyseren: Een primaire recensent en een of twee secundaire beoordelingen.
   1. Primaire recensent: Bekijk elke video naar 3-5 lang (ongeveer 5 sec) drinkgelagen identificeren en te analyseren. Dit criterium is gebaseerd op gepubliceerde niet-radiografische zwaluw studies met muizen ^13,14 en VFSS met ratten ¹² waaruit blijkt dat 3-5 maatregelen per zwaluw parameter voldoende voor statistische analyses.
   2. Secundaire reviewers: de 3-5 maatregelen per zwaluw parameter voor elke muis die in eerste instantie werden geïdentificeerd en door de primaire recensent geanalyseerd zelfstandig verwerken.
2. Identificeren recensent discrepanties voor elke muis. Heranalyseer alle afwijkingen als recensent groep tot 100% consensus te bereiken.
3. Middel de 3-5 consensus (dwz onbetwiste) waarden voor elke slikken parameter om de gemiddelde waarde voor elke muis voor gebruik in statistische analyses te verkrijgen. Wanneer minder dan 3 MEASURes worden verkregen voor een enkele zwaluw parameter voor een bepaalde muis, voert u een ontbrekende waarde (dat wil zeggen, niet nul) in de statistische database voor de overeenkomstige zwaluw parameter.

SWALLOW PARAMETERS	BESCHRIJVING
Inter-Swallow Interval (ISI)	Het aantal video-frames tussen twee opeenvolgende, ononderbroken zwaluwen. De start frame voor het berekenen van ISI is de "rust kader" die zichtbaar overdracht van de bolus uit de valleculae naar de slokdarm onmiddellijk voorafgaat. Het einde van het chassis is de "rust kader" van de volgende zwaluw. Het aantal frames tussen de twee opeenvolgende slikt wordt dan gedeeld door 30 frames per seconde (fps) converteren naar tijd (sec).
Kaak Excursie Rate (Lick Rate Equivalent)	De tong is niet duidelijkzichtbaar tijdens VFSS tot kwantificering van lik tarief mogelijk te maken; echter kaak excursie tarief is eenvoudig te kwantificeren. Tijdens likken, dient de kaak openen om de tong toe uitsteken vanuit de mond. Daarom is het aantal van de kaak open / dicht (excursie) cycli per seconde (30 beelden), terwijl het drinken is gelijk aan tarief likken. Elke kaak excursie cyclus begint met de bek maximaal open (dat samenvalt met tong uitsteken) en eindigt wanneer de klauw terugkeert naar maximaal geopende stand. Volgende cycli van de kaak sluiting en heropening worden geteld als afzonderlijke kaak excursie afleveringen.
Kaak Excursie Afstand	De afstand van de kaak opent tijdens kaak excursie cycli, te meten in mm tussen de bovenkaak en onderkaak snijtanden.
Lik-Swallow Ratio	Het aantal kaak excursie cycli die zich voordoen tijdens elke ISI (dat wil zeggen, tussen twee opeenvolgende, ononderbroken zwaluwen).
Swallow Rate	Het aantal zwaluwen die zich tijdens elke 2 sec aflevering van ononderbroken drinken op de tuit.
Keelholte Transit Time (PTT)	De tijd die het kost de bolus te worden opgeslokt door de keelholte. De beginframe is identiek aan de ISI start frame (dwz de "ruststelsel" die zichtbaar overdracht van de bolus van het valleculae onmiddellijk voorafgaat). De eindframe is wanneer de staart van de bolus volledig voorbij de 2e halswervel (C2), die het duidelijkst anatomische mijlpaal in de cervicale wervelkolom van de muis. Het aantal frames tussen begin- en eindframe wordt vervolgens gedeeld door 30 fps en omgezet in milliseconden (msec).
Bolus Snelheid door Keelholte	Faryngeale bolus snelheid wordt gemeten ten opzichte van PTT (hierboven beschreven). Met behulp van ImageJ software, wordt de afstand (mm) van de valleculae naar de C2 wervel gemeten, geschaald met behulp van een kalibratie-marker. Dit distance (mm) wordt dan gedeeld door PTT (msec) bolus snelheid (mm / ms) te bepalen.
Oesofageale Transit Time (ETT)	De ETT beginframe is identiek aan het PTT eindframe (hierboven beschreven). De ETT eindframe is wanneer de bolus volledig is ingevoerd de maag, die wordt gedefinieerd als het verdwijnen van de bolus van de slokdarm. Het aantal frames tussen de ETT begin- en eindframe wordt vervolgens gedeeld door 30 fps en omgezet in msec.
Bolus Snelheid door slokdarm	Esophageal bolus snelheid gemeten ten opzichte ETT (hierboven beschreven). Met behulp van ImageJ software, de afstand (mm) gemeten vanaf de C2 wervel aan de gastro-oesofageale overgang, geschaald met behulp van kalibratie marker. Deze afstand (mm) wordt dan gedeeld door ETT (msec) bolus snelheid (mm / ms) te bepalen.
Bolus Snelheid door keelholte en slokdarm	Deze parameter wordt gebruikt wanneer C2 is geen gemakkelijk zichtbaar anatomische mijlpaal; vandaar,is het niet mogelijk om onderscheid te maken tussen de keelholte en de slokdarm stadia van slikken. In dergelijke gevallen wordt bolus snelheid door de pharynx en larynx gecombineerd in een enkele parameter slikken. De beginframe is identiek aan de PTT start frame (dwz de "ruststelsel" die zichtbaar overdracht van de bolus van het valleculae onmiddellijk voorafgaat). De eindframe is identiek aan het ETT eindframe (wanneer de bolus volledig is ingevoerd de maag). Het aantal frames tussen deze twee gebeurtenissen gedeeld door 30 fps en omgezet in msec.
Bolus Area	Met behulp van ImageJ software, wordt bolus gebied gemeten op de vallecular "ruststelsel" vóór aanvang van de keelholte zwaluw, geschaald met behulp van een kalibratie-marker.
Keelholte Residu Area	Keelholte residu gebied wordt gemeten met behulp van ImageJ software, geschaald met behulp van een kalibratie-marker.
Volume van Liquid Consumed	Het volume vloeistof verbruikt een druppelbuis fles is moeilijk te schatten door lekkage van de tuit. De hoeveelheid vloeistof verbruikt van een pin-bowl kan nauwkeuriger worden als volgt berekend: 1) bepalen de dichtheid (dwz verhouding van gewicht tot volume) van de gekalibreerde hoeveelheid vloeistof die werd toegediend in de PEG-bowl, 2 ) bepaalt het gewicht van het PEG-schaal met de resterende vloeistof, 3) Voer deze waarden in een gewicht tot volume converter (bijv http://www.thecalculatorsite.com/conversions/weighttovolume.php .

Tabel 2: Slik Parameters kwantificeerbare Tijdens Muriene VFSS.

Representative Results

We hebben met succes ontwikkeld van een roman en repliceerbaar muizen-specifieke VFSS protocol dat testkamers dat zelf geeft toe, recepten voor het aromatiseren van orale contrastmiddelen, en een stap-voor-stap testprotocol dat kwantificering van zwaluw fysiologie toelaat omvat. Het energieniveau vermogen van de fluoroscopie systeem bepaald welke slikken parameters kon worden onderzocht in muizen. We aanvankelijk gebruikte hoge energie doorlichting ontworpen voor gebruik met mensen en grotere dieren (bijvoorbeeld GE Advantx, GE OEC 9600, en Omega Cardiac Cath CS-25, elk met 30 frames per seconde). Echter, deze systemen had onvoldoende vergroting mogelijkheden voor het testen van muizen, die slechts een klein deel van het gezichtsveld resulteerde in het dier vulling (Figuur 9). Daardoor beeldkwaliteit uitzonderlijk slecht, waardoor het onmogelijk meeste structuren van het slikmechanisme visualiseren. Ondanks deze beperking, identificeerden we 7 objectieve VFSS slikken parameters constant kwantificeerbare muizen waren bij gebruik van een conventionele (dat wil zeggen, hoge energie) fluoroscoop in combinatie met de nieuwe muizen VFSS protocol (Tabel 3). Bovendien identificeerden we de vallecular ruimte als de anatomische triggerpunt voor inslikken door gezonde volwassen muizen (3-17 maanden), en muizen met voorwaarden van gevorderde leeftijd (> 18 maanden) en eindstadium ALS.

Figuur 9:. High Energy Fluoroscopie Systems Links: representatief beeld van een muis verkregen met behulp van hoge-energie (dwz conventionele) fluoroscopiesystemen. Merk op dat de muis vult slechts een klein deel van de fluoroscopie gezichtsveld, waardoor het onvoldoende vergroting mogelijk is met gewone doorlichting voor beeldvorming knaagdieren demonstreren. Rechts: Zelfde afbeelding vergroot post-capture met behulp van een video-editing software programma. Zwarte pijl: slik triggerpoint (valleculae). Witte pijl:. Bolus in de distale slokdarm, onmiddellijk voorafgaand aan het passeren van de GE-splitsing (witte asterisk) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

SWALLOW PARAMETERS	High Energy System	Low Energy System
Inter-Swallow Interval (ISI)	X	X
Kaak Excursie Rate (Lick Rate Equivalent)	X	X
Kaak Excursie Afstand	X	X
Lik-Swallow Ratio	X	X
Swallow Rate	X	X
Pharyngeal Transit Time (PTT)		X
Bolus Snelheid door Keelholte		X
Oesofageale Transit Time (ETT)		X
Bolus Snelheid door slokdarm		X
Bolus Snelheid door keelholte en slokdarm	X	X
Bolus Area		X
Keelholte Residu Area		X
Volume van Liquid Consumed	X	X

Tabel 3: Slik Parameters kwantificeerbare Met behulp van hoge versus lage Energy Fluoroscopie Systems.

We hebben onlangs verkregen een lage energie vergroting fluoroscopie systeem genaamd The LabScope (Glenbrook Technologies, Randolph, NJ) die specifiek is ontworpen voor ons lab voor gebruik metmuizen en andere kleine knaagdieren (figuur 10). De aanzienlijk grotere vergrotingsfactor van dit systeem maakte het onmogelijk is om alle slikmechanisme van een muis zien in één gezichtsveld. In plaats daarvan worden twee testpunten vereist, zoals getoond in figuur 11. Positie 1 staat visualisatie van de gehele kop en proximale borstkas. Deze positie is noodzakelijk voor de beoordeling van de orale en faryngeale fase van het slikken. Positie 2 vergunningen visualisatie van de zwaluw triggerpoint (dwz valleculae) naar de gastro (GE) kruising. Deze positie is voor de beoordeling van de slokdarm fase van slikken. Voorbereidende werk met behulp van de LabScope in combinatie met de nieuwe muizen VFSS protocol heeft 13 objectieve zwaluw parameters die consequent kwantificeerbaar bij muizen, dat is bijna het dubbele van het aantal verkregen met behulp van hoge-energie (dwz conventionele) doorlichting (tabel 3) geïdentificeerd. Deze o ESULTATEN wordt toegeschreven aan de vergroting geavanceerde mogelijkheden van de LabScope, die zorgt voor visualisatie van verschillende anatomische structuren (Figuur 12) die in hoofdzaak onzichtbaar waren bij gebruik van conventionele systemen: bv tongbeen, luchtpijp en halswervels. Daardoor hebben we ook de video analyseren bewijs larynx penetratie en aspiratie. Noch penetratie noch aspiratie waargenomen voor muizen in deze studie, ongeacht gezondheid of ziekten.

Figuur 10:. De LabScope Links: De LabScope presteert als een desktop fluoroscope voor kleine dieren. Rechts: Close-up van de LabScope met gelabelde componenten. De schaarheftafel positioneert een observatie kamer binnen het fluoroscope gezichtsveld. tp_upload / 52.319 / 52319fig10highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 11:. Low Energy Fluoroscopie System Beelden van een muis verkregen met een lage energie fluoroscopie systeem. Merk op dat de hoge vergroting vermogen voorkomt visualisatie van het gehele slikken mechanisme dat in de fluoroscopie gezichtsveld. Links: Positie 1 - maakt visualisatie van de gehele kop en proximale thoracale regio. De zwaluw triggerpoint (zwarte pijl) wordt hoofdzakelijk gecentreerd binnen het gezichtsveld. Rechts: Stand 2 - vergunningen visualisatie van de zwaluw triggerpoint (zwarte pijl) om het GE splitsing (wit sterretje). Let op de bolus door het distale slokdarm (witte pijl). g11highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 12:. Anatomische structuren zichtbaar met behulp van een Low Energy Fluoroscopie System Zelfs op de laagste vergrotingsinstelling (links), Boney structuren van het hoofd en de nek van een muis zijn gemakkelijk zichtbaar met behulp van onze lage energie fluoroscopie systeem (dat wil zeggen, de LabScope). Anatomische structuren binnen het zwarte vierkant worden afgebeeld (gemerkt) bij hogere vergroting naar rechts. Verbeterde visualisatie van Boney structuren maakt kwantificering van een aantal extra zwaluw parameters die onmogelijk te analyseren met behulp van hoge-energie doorlichting waren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

t "> Slik rate en inter-zwaluw interval zijn representatief VFSS parameters die kunnen worden gekwantificeerd met behulp van een lage of hoge energie fluoroscopiesystemen in combinatie met de nieuwe muizen VFSS protocol Deze twee zwaluw parameters werden gekwantificeerd voor drie groepen muizen:. SOD1-G93A (SOD1) transgene muizen (dat wil zeggen, een model van ALS) bij ziekte eindstadium tussen de 4-5 maanden oud, C57 muizen leeftijd (18-24 maanden) en een controlegroep van gezonde jonge (4-8 maanden van leeftijd) C57 muizen en niet-transgene nestgenoten van de SOD1 kolonie. Alle gegevens hebben betrekking op slechts drinktuit, met behulp van een lage of hoge energie fluoroscopie systeem. Er werden geen significante verschillen gevonden tussen jonge C57 muizen en jonge niet-transgene (controle) muizen uit de SOD1 kolonie ten opzichte van deze twee zwaluw parameters. Daarom werden de gegevens gecombineerd in een algemene "controle" groep jonge gezonde muizen voor de vergelijking met C57 muizen leeftijd en eindstadium SOD1 muizen Slik tarief (dat wil zeggen,het aantal zwaluwen tijdens 2 opeenvolgende seconden ononderbroken drink) was beduidend langzamer voor SOD1 muizen in vergelijking met C57 muizen en controles leeftijd. Inter-swallow interval (dat wil zeggen de tijd tussen twee opeenvolgende slikt) was niet significant verschillend tussen de groepen. Deze bevindingen ondersteunen de gedachte dat dysfagie profielen waarschijnlijk duidelijk verschillend voor elke ziektetoestand (figuur 13) zijn.

Figuur 13:. Voorlopige bevindingen Deze figuur toont representatief voorlopige bevindingen voor twee VFSS zwaluw parameters gekwantificeerd aan de hand van de muizen VFSS protocol: slik rate (links) en inter-zwaluw interval (rechts). Slik was significant lager voor SOD1 muizen in vergelijking met C57 muizen en controles leeftijd. Er werden geen significante groepsverschillen werden geïdentificeerd voor inter-swallow interval. Lijnen bovenaan de balkjes statistisch significante verschillen (p <0,05) tussen groepen, die met Bonferroni paarsgewijze vergelijkingen. Fout balken geven ± 1 SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Honderden murine (muis en rat) modellen beschikbaar waarmee menselijke ziekten te bestuderen. Slechts drie murine ziektemodellen zijn specifiek onderzocht opzichte van dysfagie: een muismodel ^13,14 en ratmodellen Parkinson ^12,15-17 en beroerte ^18. Elk van deze voorstudies gebruikt verschillende methoden om dysfagie te beoordelen, waardoor het onmogelijk is om zinvolle vergelijkingen tussen soorten en ziekten veroorzaakt worden. Deze belangrijke beperking kan in toekomstige studies worden opgelost door gebruik te maken van de nieuw ontwikkelde muizen VFSS protocol dat objectieve kwantificering van talrijke zwaluw parameters in zelf-voeden van dieren mogelijk maakt.

Succesvolle VFSS uitkomsten zijn afhankelijk van drie belangrijke componenten: 1) testkamers die zichzelf voeden toestaan ​​terwijl ongebreidelde in een afgesloten ruimte, 2) recepten die de aversieve smaak / geur van commercieel beschikbare orale contrast ag maskerenents, en 3) een stap voor stap testprotocol dat kwantificering van slikken fysiologie toelaat. Het gecombineerde effect van een comfortabele, lage spanning, zichzelf voeden onderzoek omgeving die typische voeden en slikken gedrag oproept. Eliminatie van één of meer van deze componenten een nadelig effect op de studieresultaten hebben. Voorbeelden van negatieve resultaten zijn onvermogen om de dieren in fluoroscopie gezichtsveld, ongewenst gedrag dat afleiden van alcoholgebruik, afkeer orale contrastmiddel behouden en onvermogen om te slikken parameters vanwege onvoldoende drinken episodes kwantificeren.

Een belangrijke uitdaging in het verkrijgen van een optimale VFSS uitkomsten was het ontwerpen van een geschikte testkamer. Talrijke herzieningen van onze prototype culmineerde in een observatie kamer die voldoende onderhoudt muizen in het gezichtsveld en voorkomt gedragingen die afleiden van het drinken. De kamers werden gemaakt met behulp van freesmachines uniforme afmetingen van th te verkrijgene buizen en eindkappen, waardoor de uitwisselbaarheid van componenten zorgen voor enkele observatie kamers van dezelfde diameter. De inwendige afmetingen (diameter en lengte) werden vergeleken met iets groter dan lichaamslengte volwassen muis, wat resulteerde in een smalle testkamer die voldoende toelaat lopen in een rechte lijn en draaien rond zijn. De smalle ontwerp, in combinatie met de strategische positionering van de uitloop en peg-bowl op slechts het einde, houdt het hoofd en lichaam van muizen uitgelijnd langs de lengte van de kamer, terwijl het drinken. Eenmaal bezig drinken, muizen blijft opmerkelijk zichzelf gestabiliseerd op de tuit of schaal gedurende meerdere seconden, wat resulteert in minimale beweging artefact verstoren testen. Zo is het mogelijk om een ​​onvervalste, close-up observatie / video-opname en Videofluoroscopisch beeldvorming van muizen, terwijl het drinken in de laterale en dorsale-ventrale vliegtuigen te verkrijgen.

Muizen (en andere kleine knaagdieren) zijn van nature geneigd om te zienk onderdak in kleine ruimtes. Daardoor zij vrij voert de testkamer (met één uiteinde reeds gesloten door een eindkap) wanneer deze zich in de kooi, zodat er geen spanning / angst veroorzaakt door het hanteren (bijvoorbeeld handmatig oppakken van het dier te plaatsen in de kamer). Zodra de muis komt in de kamer, wordt het andere uiteinde afgesloten door het aanbrengen van een ^2e end-cap. Dit ontwerp voorkomt ontsnappen terwijl het creëren van een lage angst testkamer voor muizen om vrij te verkennen.

De vierkante vorm van de kamer biedt ingebouwde motion stabiliteit die haar toestaat om te worden gebruikt in een vrijstaande mode, waardoor de noodzaak voor het testen binnen een standaard knaagdieren kooi. De gehele inrichting is licht van gewicht, draagbaar, stapelbaar voor opslag, stevige, gemakkelijk schoon te maken, en kan worden geautoclaveerd. Terwijl de kamers oorspronkelijk ontworpen voor gebruik met fluoroscopie, ze ook geschikt spot film radiografie, neuroafbeeldings- (bijvoorbeeld MRI, PET, CT) en Visual observatie / video-opname van verschillende gedragingen.

Een tweede belangrijke uitdaging te overwinnen was het maskeren van de aversieve smaak / geur van orale contrastmiddelen (dwz, bariumsulfaat en iohexol). Aangezien smaakgevoeligheid grote verschillen tussen muizenstammen ^19-21 en misschien met de leeftijd ^22,23, was het noodzakelijk om een testoplossing die was smakelijk alle muizen, ongeacht stam en leeftijd identificeren. Deze uitkomst is essentieel om directe vergelijkingen van slik functie / dysfunctie in stammen en leeftijden toe, terwijl tegelijkertijd verstorende als gevolg van verschillen in rheologische (bijvoorbeeld viscositeit, dichtheid, enz.) En chemische eigenschappen van de testoplossingen. Hiervoor hebben we een eenvoudige, snelle smakelijkheid screening benadering de voorkeur smaakversterker het aversieve smaak / geur van orale contrastmiddelen masker tijdens murine VFSS identificeren. Methoden werden gemodelleerd na de korte blootstelling test, die een lik vereistometer (dat wil zeggen, likken sensor) te likken tarieven opnemen tijdens de eerste 2 min na een water reguleringsperiode (dat wil zeggen, het achterhouden van water 's nachts) om de dorst ^24,25 induceren. Een lickometer was niet beschikbaar voor deze studie; Daarom werd de voorkeur beoordeeld door gedragsobservaties, evenals standaard video-opname methoden voor het likken rente die eerder zijn gevalideerd in ons lab ^13,14. Met behulp van deze smakelijkheid screening aanpak werd chocolade geïdentificeerd als de voorkeur smaakversterker door C57 en C57 / SJL stammen. Specifiek, 100% van de muizen in elke kooi gemakkelijk dronken chocolade gearomatiseerde oplossingen binnen 30 seconden blootstelling, met meerdere muizen gelijktijdig drinken aan de tuit. De toevoeging van barium had slechts kort drinkgelagen meeste muizen, ongeacht barium of chocolade concentratie.

Een alternatief voor barium is iohexol, een jodium-gebaseerde contrastmiddel dat pas recent volledig erkend als een suitabel alternatief voor bariumsulfaat voor menselijke VFSS ^10; dus het is nog niet gestandaardiseerd hiervoor. Verschillende concentraties chocoladesmaak iohexol kregen muizen. Recepten die tot een oplossing leverbaar iohexol (350 mg jodium per ml) 50% waren direct dronken meeste muizen na een nacht waterhuishouding periode. Hogere concentraties resulteerde in vermijdingsgedrag. Een 50% iohexol (350 mg jodium per ml) oplossing geproduceerd voldoende radiodensity terwijl wordt opgeslokt door muizen, terwijl lagere concentraties waren duidelijk minder zichtbaar en gehinderd kwantificering van zwaluw fysiologie. Daarom is de optimale testoplossing VFSS muizen werd geïdentificeerd als 50% iohexol oplossing chocoladesmaak toegevoegd. Herhaal smakelijkheid tests niet tot vermijdingsgedrag of bijwerkingen.

Een derde uitdaging om te overwinnen is het voorkomen van muizen uit te draaien / kantelen hun hoofd terwijl het drinken, die visualisatie verduistertvan het slikmechanisme tijdens VFSS. Het drinken van een pin-bowl net boven de grond aan een einde van de kamer opgelost probleem. Er zijn een aantal extra voordelen van een pen-schaal plaats van een druppelbuis fles. Bijvoorbeeld kan een gekalibreerde volume van vloeistof in de pen-bowl worden gepipetteerd via een ventilatie-opening in de eindkap van de waarneming buis. Deze aanpak maakt kwantificering van de minuut volume van de testoplossing verbruikt tijdens de korte VFSS duur van de test. Bovendien is het grotere oppervlak van de testoplossing in de pin-bowl, vergeleken met een kleine druppelbuis opening kan zorgen voor meer olfactorische stimulatie drinken verder te motiveren. Peg-schalen kunnen beter geschikt voor het bestuderen van jonge of kleiner stam muizen, aangezien de schaal hoogte een gestandaardiseerde afstand van de vloer. In tegenstelling, moet sipper buis lengtes worden aangepast aan verschillende grootte muizen, die voegt een andere potentieel verstorende variabele om te overwegen tegemoet. Ook, muis-modusls van neurologische aandoeningen kan moeite hebben het bereiken van een sipper buis fles vanwege motorische beperking van de ledematen hebben, terwijl ze gemakkelijk een pin kom kan bereiken. Muizen met tong en / of kaak dysfunctie onvoldoende kunnen drukken de bal in de tuit om de vloeistof; met behulp van peg-kommen kan dit verwarren elimineren. Om deze redenen is het gebruik van PEG-kommen over druppelbuis flessen is de voorkeursmethode van muizen VFSS testen. Echter, de waarneming kamers ontworpen tuit drinken geschikt als nodig. Een belangrijke kanttekening te overwegen is dat likken tarieven bekend zijn verschillen tussen uitloop en kom drinken ^13,26. Daarom moet de keuze van een van beide uitloop of peg-bowl voor VFSS consistente binnen en tussen experimenten.

Een vierde uitdaging was om kwantificeerbare zwaluw parameters te identificeren voor muizen die vergelijkbaar is met de VFSS parameters vaak gebruikt in de menselijke studies en de klinische praktijk zijn. Onze voorlopige bevindingen toonden detype fluoroscopie systeem bepaalt welke slikken parameters kunnen worden onderzocht bij muizen. De meeste onderzoekscentra en medische instellingen hebben een hoge energie (75-95 kV, 1-5 mA) doorlichting ontworpen voor gebruik met mensen en grotere dieren, die resulteren in een uitzonderlijk slechte beeldkwaliteit bij het testen van muizen en andere kleine dieren. Als voorbeeld, een recente studie met een hoge energie fluoroscope met ratten kon slechts 4 kwantificeerbare zwaluw parameters ¹² te identificeren, en we waren in staat om slechts 7 zwaluw parameters in deze huidige studie te identificeren voor muizen. Om deze belangrijke beperking te omzeilen, hebben we onlangs verkregen een lage energie fluoroscopie systeem genaamd The LabScope (Glenbrook Technologies). Het systeem is een miniatuur fluoroscoop die een continue kegelbundel van röntgenstralen met foton-energieën tussen 15 en 40 kV en een piek buis stroom van 0,2 mA (8 W maximaal vermogen) opwekt. De lagere energieniveaus van dit systeem beter gedempt door de dunne bot en weke delen van muizen en leveren daarmee higher contrast resolutie dan conventionele (dat wil zeggen, hoge energie) doorlichting. De röntgenbundel van de LabScope is gericht op een 5 cm diameter image intensifier, dat aanzienlijk kleiner is dan de 15-57 cm diameter beeld beeldversterker conventionele doorlichting. De minimale source-naar-intensifier afstand (SID) van de LabScope is ~ 6 cm (in tegenstelling tot ~ 30 cm conventionele doorlichting), die voorziet in verhoogde vergroting mogelijkheden. Bovendien, De LabScope maakt gebruik van gepatenteerde technologie die digitaal het beeld vergroot tot 40 keer in real-time, zonder wijziging van de SID. Het resultaat is in wezen een röntgenmicroscoop die in en uit kunnen opnieuw in realtime kleine gebieden van belang, zoals het slikmechanisme van een muis zien.

Een groot voordeel van deze lage-energie-fluoroscopie systeem werkt beter straling veiligheid. Naast de dieren die lagere stralingsdoses met The LabScope, zijn onderzoekers met behulp van het systeem blootgesteld aan beduidend less straling scatter. De blootstelling aan straling direct voor de eenheid op het bedieningspaneel 10,3 mR / hr. Op een afstand 1 m voor de eenheid, blootstelling daalt tot 580 μR / uur. De meeste andere locaties in de kamer hebben een zeer lage blootstelling onder de 10 μR / uur. Ondanks deze verbetering, hebben we extra maatregelen om de veiligheid van straling te verbeteren. Zo heeft loodhoudende acryl afscherming is toegevoegd rond De LabScope om verspreide X-ray fotonen, die onderzoekers in staat stelt muizen VFSS testen uit te voeren zonder het dragen van persoonlijke afscherming (bijvoorbeeld lood schorten, schildklier schilden, en glazen) te blokkeren. Bovendien, het helder acryl maakt visualisatie van de muis op afstand. Verder stralingsveiligheid wordt geleverd door een gemotoriseerde schaarheftafel, die op afstand wordt bestuurd door de onderzoeker. Van een afstand tot 3 m van het fluoroscope, kunnen onderzoekers de op afstand bestuurbare apparaat gebruiken om de verticale en horizontale positie van de observatie kamer binnen de X-ray bea passenm. Hierdoor kan de anatomische gebieden van belang worden gehandhaafd binnen het fluoroscopie gezichtsveld terwijl de muis vrij binnen de waarnemingskamer beweegt. Hoewel de schaarhoogwerker is ontworpen voor gebruik met de LabScope is ook geschikt voor gebruik met conventionele doorlichting stralingsveiligheid voor onderzoekers verbeteren. Een laatste stap stralingsveiligheid verbeteren tijdens murine VFSS omvat het gebruik van een injectiespuit afgiftesysteem voor vloeistoffen. Dit systeem omvat een 3-4 voet (of meer, indien nodig) lengte van PE buis, dat snelle en efficiënte levering van vloeistoffen in de pen-bowl afstand toelaat. Deze injectiespuit afgiftesysteem voor vloeistoffen, in combinatie met de waarneming kamers, ook kan worden gebruikt met conventionele doorlichting.

Voorbereiding middels de LabScope, in combinatie met de nieuwe muizen VFSS protocol toont een belangrijk voordeel boven conventionele systemen: het aantal slikken parameters die ik betrouwbaar worden gekwantificeerds bijna verdubbeld. Echter, weke delen van de slikmechanisme (bijv, tong, velum, farynxachterwand en epiglottis) van muizen zijn niet direct zichtbaar bij gebruik van lage of hoge energie fluoroscopiesystemen. Daarom hebben we ons gericht op het kwantificeren van bolus stroom maatregelen in plaats van de biomechanica van het slikken. We waren vooral geïnteresseerd in de parameters die kunnen worden gekwantificeerd op basis van eenheden van tijd, ruimte, afstand, volume, enz., In plaats van met behulp van Likertschaal maatregelen. Talrijke bolus stromingsparameters vergadering deze eis zijn beschreven in het menselijk VFSS literatuur, zoals orale transittijd ^27-29, keelholte transittijd ^27-33, en slokdarmkanker transittijd ^34-36, om er maar een paar te noemen. Bolus transport via de mondholte niet gemakkelijk zichtbaar bij muizen, waarschijnlijk vanwege de kleine afmeting bolus bij spontane drinken. Echter, waren we in staat om op betrouwbare wijze te kwantificeren keelholte en slokdarm transittijden, alsookals een aantal andere maatregelen met betrekking tot bolus doorstroming en de klaring. Identificatie van bijkomende translationeel zwaluw parameters wordt verwacht aangezien we het optimaliseren van de mogelijkheden van de LabScope.

Resultaten van deze studie toonden aan dat muizen nemen verschillende ritmische licks per zwaluw tijdens spontane drinken, met elke kleine vloeibare bolus sequentieel vullen van de vallecular ruimte vóór de inwerkingtreding van het faryngeale zwaluw. Dit gedrag, die typisch is voor zoogdieren die gebruik likken als het belangrijkste middel van inname van vloeibare ^37-40, lijkt op de ritmische zuigen-slikken patroon van menselijke zuigeling slikken en al zuigeling zoogdieren in het algemeen. Zuigeling slikken fysiologie wordt gekenmerkt door verschillende ritmische zuigt gevolgd door een reflexieve pharyngeal zwaluw, algemeen omschreven als de zuigen-slikken cyclus ^37,41-43. Aldus kan de ritmische tong en kaak bewegingen betrokken bij de voeropnamegedrag likken gedrag van muizen meer vergelijkbaar zijn zuigen gedrag brom voeropnamegedrageen baby in plaats beker drinken door kinderen en volwassenen. We zijn dan ook het kwantificeren van de lik tarief en lik-zwaluw verhouding van muizen voor toekomstige vergelijkingen met het zuigen tarief en zuigen-slikken verhouding van de menselijke baby's. Misschien muizen VFSS onderzoek zal inzicht geven in ontwikkelingsprocessen slikstoornissen.

Zoals met elke nieuwe onderzoeksmethode, hebben verbeterpunten geïdentificeerd. Zo werd het muriene VFSS protocol ontwikkeld met alleen C57 en C57 / SJL muizen stammen; het is nog niet getest met ratten. De waarneming kamers zal moeten worden opgeschaald in grootte (diameter en lengte) om het groter lichaam van ratten tegemoet. Ook is het onbekend of chocoladesmaak iohexol geschikt als universele murine VFSS testoplossing. Daarom wordt grotere schaal testen met meerdere stammen van muizen en ratten waarborgt daartoe. Ook moet het gebruik van barium als contrastmiddel voor muizen VFSS niet worden uitgesloten. Muizen opteert de iohexol recepten dan barium; echter meer rigoureuze en systematische pogingen tot het maskeren van de aversieve smaak / geur van barium kan smakelijk alternatief voor iohexol bieden. Toekomstige studies waarin de effecten van iohexol en bariumsulfaat (evenals andere potentiële orale contrastmiddelen) op smaak voorkeur en slikken fysiologie bij muizen en ratten zou ongetwijfeld leveren belangrijke informatie die direct relevant is en translationeel menselijke VFSS.

VFSS met mensen omvat verschillende consistenties van voedsel en vloeistof, en dysfagie is het duidelijkst bij het ​​slikken dunne vloeistoffen en droog, vast voedsel ^44,45. Het murine VFSS protocol wordt daarom uitgebreid met extra consistenties dat detectie en kwantificering van dysfagie in ziektemodellen kunnen vergemakkelijken. Het zal ook nodig zijn om de viscositeit testen van de vloeistof recepten voor muizen VFSS uit te voeren om de viscositeit aan te passen aan die gebruikt worden tijdens de menselijke VFSS overeenkomen. Het aanpakken van deze limietaties zal identificatie van translationeel VFSS biomarkers van dysfagie die rechtstreeks kunnen worden vergeleken tussen muizen, ratten en mensen te vergemakkelijken.

Het nut van murine VFSS aanzienlijk kan worden verbeterd door het implanteren radiopake markers in zachte weefselstructuren van het slikmechanisme die anders niet zichtbaar, waardoor onderzoek naar de biomechanica van slikken toelaat. Deze aanpak is met succes gebruikt voor vele jaren aan de biomechanica te bestuderen van het slikken in kindervoeding varkens, met behulp van een assortiment van metalen clips en draden ^37,42. We verwachten het gebruik van gelijksoortige, maar kleiner, markers in muizen zouden kwantificering van verscheidene extra slik parameters voor vergelijking met grotere zoogdieren, waaronder mensen mogelijk. Wij ontwikkelen momenteel methodologie voor het implanteren radiopaque markers in de tong, zachte gehemelte, keelholte, strottenhoofd, en proximale slokdarm van muizen om deze hypothese te testen.

De video recording framerate van De LabScope en conventionele doorlichting is beperkt tot 30 frames per seconde (fps). Echter, onze voorlopige resultaten bleek dat de gehele faryngeale fase van het slikken van gezonde muizen bij minder dan 66 msec (dwz 2 frames), wat ongeveer 10 keer sneller dan mensen. Zo, de faryngeale fase van het slikken bij muizen gebeurt zo snel dat de details zijn niet merkbaar met een 30 fps camera. Een hogere framesnelheid (waarschijnlijk> 100 fps) is nodig om voldoende visualiseren en kwantificeren uiterst snelle en complexe bewegingen van de faryngeale fase van het slikken bij muizen en andere knaagdieren. In combinatie met een hogere framesnelheid, waarin biplanair technologie voor 3D-fluoroscopische beeldvorming zou zeker uit te breiden het hulpprogramma muizen VFSS. Daarom moet de toekomstige overwegingen bij het ontwerp onder meer een hogere framesnelheid camera en biplanair imaging-mogelijkheden.

Tenslotte heeft lage stralingsdoses aangetoond steriliteit veroorzakenvrouwelijke C57 muizen, wat resulteert in gewijzigde niveaus van ovariële gestimuleerde hormonen die levensduur studies ⁴⁶ kan verwarren. Resultaten bijzonder met betrekking tot de effecten van herhaalde lage stralingsdoses blootstelling verbonden VFSS testen nog niet onderzocht bij muizen, andere dieren of mensen. Echter ovariële dysfunctie (geen blootstelling straling) in menselijke vrouwen verbonden met darmmotiliteit en specifiek dysfagie in sommige gevallen ^47, die nog een waarschuwing geeft te overwegen bij het ​​ontwerpen van toekomstige VFSS studies vrouwen (dieren en mensen omvatten ). Uitsluiting van vrouwen moet worden vermeden, aangezien significante sekseverschillen in zwaluw functie zijn gemeld voor mensen ^48,49 en belangrijk op te sporen en te karakteriseren in dierziekte modellen zo goed zou komen. Derhalve resultaten van longitudinale VFSS studies bij muizen en ratten van beide geslachten enorm translationele is voor mensen opzichte van dysphagia, evenals de risico's van lage stralingsdoses blootstelling verbonden herhalen VFSS testen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycarbonate tubing for observation chambers	McMaster-Carr	3161T41	Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall
Polycarbonate sheet  for observation chambers	McMaster-Carr	9115K71	End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4"
Polycarbonate sheet  for observation chambers	McMaster-Carr	8574K281	Peg-bowls for observation tubes
Silicone O-rings  for end-caps of observation chambers	McMaster-Carr	9396K108	S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r
Silicone stoppers for observation chambers	McMaster-Carr	2903K22	Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at
Centrifuge tubes for sipper tube bottles	Evergreen Scientific	222-3530-G80	30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/
Silcone stoppers for sipper tube bottles	Saint-Gobain Performance Plastics	DX263031-10	Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack;  http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS
Stopper borers for sipper tube bottles	Thomas Scientific	3276G40	Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch  http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt
Drinking tubes for sipper tube bottles	Ancare	TD-100	2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point
Iohexol for making oral contrast agent solution	GE Healthcare		350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque
Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent	Herseys
10 ml syringe for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	309604	Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp
Catheter tubing for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	427451	Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp
Needle for syringe delivery system	Becton, Dickinson and Company	427560	15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp
Delrin acetal resin rod for syringe delivery system	McMaster-Carr	8576K15	1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf
Acrylic sheeting for scissor lift	Ponoko		Laser cut http://www.ponoko.com
3D printed ABS frame	Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri
Brass rods for scissor lift	Amazon	TTRB-03-12-03	made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M
Drawer slide for scissor lift	Richelieu	10292G116	Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754
28BYJ-48 stepper motor for scissor lift			2 each
ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift	Toshiba	ULN2003APG	Used as stepper drivers (2 each)
ATTINY85 microcontroller for scissor lift	Atmel	ATTINY85-20PU	2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html
Nylon spur gear	McMaster-Carr	57655K34	2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz
Nylon spur gear rack	McMaster-Carr	57655K62	2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9
4-40 nylon machine screws	McMaster-Carr	95133A315	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q
4-40 nylon hex nuts	McMaster-Carr	94812A200	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29
Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104	McMaster-Carr	9452K318	Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7