Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Retinitis pigmentosa (RP) er en arvelig sykdom som forårsaker utbredt tap av fotoreseptorer, som er cellene i det ytterste laget av retina ansvarlig for å overføre lys, i form av fotoner, inn nevral aktivitet. Viktigere, pasienter med RP har vanligvis rest nevroner i de andre lagene i sin netthinnen som fortsatt er funksjonell. Retinal proteser er i stand til å gjenopprette noe begrenset syn til disse pasientene ved å målrette disse overlevende nevroner med elektrisk stimulering for å aktivere sin visuelle pathway 1,2. Perseptuelle resultater fra kliniske studier har vist lovende tidlige resultater og nylig noen enheter har blitt godkjent for kommersiell bruk. For tiden er det tre hoved anatomiske steder der kliniske retinal proteser har blitt plassert: epiretinally 3,4, subretinally 5,6 og suprachoroidally 7,8. Forskjellige enheter utnytte ulike materialer og deres form er tilpassettil det sted hvor de er implantert. Men de alle skape visuelle persepter ved å aktivere restnerveceller i netthinnen med elektriske pulser.
Det er potensial for enhver medisinsk protese å skade omgivende vev på grunn av mekanisk virkning av den første plassering eller etterfølgende kontinuerlige krefter. I tilfelle av implanterbare stimulatorer, slik som retinale proteser, er det ytterligere betraktning at de elektriske parametre bør være innenfor trygge grenser. Pasientsikkerhet er viktig, så enheter må nøye testet i prekliniske studier før det skifter til en klinisk innstilling 9-15. I vår ledsagende artikkelen, har vi beskrevet en fremgangsmåte for vurdering av den lokaliserte histopatologi av øyet som omgir et implantat plassert i det suprakoroidale rommet 16. I den nåværende manuskriptet, beskriver vi en teknikk for å visualisere øye vevet rundt en elektrodesystem tacked til netthinnen epiretinally, i en preklinisk (felinje) modellen (figur 1).
Den epiretinal plassering er den mest vanlig anvendt posisjon for lokalisering av en visuell protese. Elektrodegrupper som ligger her er vanligvis festet til netthinnen med en metall stift som trenger inn i alle lagene av øyet 17-20. Før teknikkene beskrevet i den nåværende manuskriptet, var det vanskelig å vurdere nøyaktig retinal og andre vev umiddelbart rundt slaget. Standard øyefiksjon hjelp nøytral bufret formalin resulterte i kunstig retinal skade på grunn av differensial bevegelse av netthinnen og sclera mot den faste punktet i tack. Derfor noen faktiske skader forårsaket av halser og epiretinal utvalg ikke kunne være nøyaktig observert. I tillegg seksjonering øyevevet kunne ikke utføres med retinal klebrighet in situ som metallgjenstander ikke lett kan skjæres med tradisjonell histologisk apparat; fjerne tack før histologisk behandling var ogsåuønsket, da dette også ført til kunstig retinal skade.
Målet med denne studien var todelt: 1) å redusere netthinneavløsning artefakt slik at eventuelle skader forårsaket av tack og epiretinal implantat matrisen kan bli pålitelig vurderes; og 2) for å visualisere retinal arkitektur tilstøtende til klebrighet uten å fjerne den. For å oppnå målet 1, ble en ny fikseringsteknikk anvendes (som beskrevet i den tilhørende artikkelen 16), som reduserer kunstig retina delaminering. For å oppnå målet 2, endret vi en forankring, sliping og polering teknikk, opprinnelig utviklet for in situ observasjon av cochleaimplantat- elektroder 21-23. Metodene beskrevet i dette manuskriptet tillater visualisering av netthinnen rundt og ved siden av en tack in situ samtidig minimere kunstig retinal skade og derfor tillater nøyaktig vurdering av eventuelle skader forårsaket av halser og epiretinal array.
Standard histologiske teknikker kan ikke behandle harde metallimplantater i situ på grunn av begrensninger i å kutte disse objektene med metall, glass eller til og med diamantblader. I vår ledsager papir 16, viste at bruken av et modifisert hel-øyefiksjon teknikk kan redusere kunstig retina delaminering. I dagens manuskript, etablert en sliping og polering teknikk for å visualisere cochlea implantat 21-23 in situ ble modifisert for retinal proteser. En titan klebrighet, som brukes for å feste en elektrode array til retina, epiretinally, ble innleiret i epoksy med det omgivende øyevevet. Denne harpiksblokk ble deretter orientert på passende måte og progressivt bakken / polert for å avdekke vevet morfologi umiddelbart tilstøtende til metall klebrighet. Bilder av den polerte overflate av blokken ved forskjellige dybder ble tatt med en kraftig disseksjon mikroskop. Denne teknikken kan brukes til: visualisering og evaluating vevsrespons tilstøtende til epiretinal implantat; for å vurdere det kirurgiske traumer forbundet med implantering av implantatet; å bestemme den biologiske reaksjonen til den harde metallkomponentene; og å måle avstanden mellom implantatet og overflaten av netthinnen.
Denne teknikken vil være nyttig i fremtidige sikkerhetsstudier for in situ visualisering av området ved en retinal klebrighet eller andre harde (f.eks metalliske gjenstander) i øyet. Dette har direkte anvendelse i vurderingen av prekliniske sikkerhets av proteser tacked til netthinnen epiretinally. Det kan også være nyttig for å evaluere vevsskade i retinale regioner i kontakt med implantater som ligger i under retinal sted.
Det er flere måter å bekrefte at teknikken er utført korrekt. På hvert trinn, må netthinnen forbli festet til de ytre lag av øyet. Hvis det er brutto kunstig netthinneavløsning, kan dette indiskespiste et problem med fiksering. Når prøven er innleiret og re-orientert i den endelige harpiks blokkere hinnen bør være nær vinkelrett med slipe-flate av blokken; Dette vil minimere skrå skjæring. Det er nyttig å kontrollere at antall enkeltoppmalingstrinn (med kjent trinnstørrelse) som kreves for å traversere et objekt (så som en retinal tack) korrelerer derfor med dimensjoner av objektet.
Teknikken kan optimaliseres på flere måter. Riper på overflaten av epoxyblokk forbundet med maleprosessen kan reduseres med progressivt finere polering. For denne studien, brukte vi 800, 1000, 1200, 2400, og 4000 siliciumcarbidprodukt papir. Diamantpasta kan også brukes til å forbedre overflatefinishen. En finere overflatefinish gir et bilde med høyere kvalitet, men på bekostning av ekstra polering tid. En annen kritisk faktor for å forbedre utfallet av denne teknikken er valget og kvaliteten på optics og belysning brukes for bildeopptak. Andre grunnleggende histologiske flekker – spesielt Nissl flekker, kan brukes i stedet for toluidinblått, men kan kreve ytterligere optimalisering. Enkelte flekker vil farge harpiksen samt vev (f.eks eosin), og derfor et grunt polish kan være nødvendig etter farging for å fjerne bakgrunns misfarging. Spesialiserte flekker, fluorescerende fargestoffer og immunhistokjemisk farging ble ikke forsøkt, men med mindre et meget bestemt resultat er ønsket, er sannsynligvis å være prohibitive den tid som kreves for å utføre disse flekker på hver sliping nivå. Imidlertid kan det være mulig å sette flekker på vevet som et hele før innstøping trinn (trinn 3.4) 24.
Den største begrensningen med denne teknikken er at når den regionen av interesse er blitt slipt bort, det kan ikke bli hentet frem, derfor er det klokt å fange opp mange (muligens overflødige) bilder på en rekke forstørrelser på hvert trinn i sliping og polering. Det erogså viktig å bruke små trinn for hver sliping dybdejustering. En annen begrensning ved denne teknikk er at den optiske forstørrelse og oppløsningen sammenlignet med vev som er montert på et objektglass og betraktet med en standard (transmisjon) lysmikroskop. Ved anvendelsen av prototyping og vurdere sikkerheten av en roman implanteringsanordning, er brutto patologisk evaluering av primær interesse. Denne teknikken gir en effektiv metode for å observere klinisk relevant skader forbundet med en retinal tack. Med praksis, den totale tiden det tar å samle grind, polsk og fotografere et gitt eksemplar (en gang innebygd) kan sammenlignes med den tiden det ville ta å seksjonen en parafinblokk eller frosne delen.
Det er også potensialet for de foreliggende teknikker til å bli utvidet til anvendelse utenfor omfanget av retinale implantater. Denne teknikken er egnet for evaluering av vev naboliggende til en hard implantat, hvor implantatet ekstraksjon ikke er feasible, eller ville skade grensesnittet. For eksempel, kan denne teknikken bli utvidet til å evaluere implantater laget av metall (f.eks, platina, nitinol, etc.) som ikke kan bli spaltet med konvensjonelle histologiske teknikker, slik som noen dype hjernen eller perifere nerve elektroder, kanyler for medikamentlevering, vaskulære stenter eller ortopediske proteser.
The authors have nothing to disclose.
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
Light microscope | Leica | MZ16 | |
Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |