Introduction
Rétinite pigmentaire (RP) est une maladie héréditaire qui provoque la perte généralisée de photorécepteurs, qui sont les cellules de la couche la plus externe de la rétine responsable de la transduction de lumière, sous la forme de photons, dans l'activité neuronale. Fait important, les patients atteints de RP ont typiquement des neurones résiduels dans les autres couches de la rétine qui sont encore fonctionnelles. Prothèses rétiniennes sont capables de restaurer une vision limitée à ces patients en ciblant ces neurones survivants avec stimulation électrique pour activer leur parcours 1,2 visuelle. Les résultats d'essais cliniques de perception ont montré de premiers résultats prometteurs et récemment certains appareils ont été approuvés pour un usage commercial. Actuellement, il existe trois principaux emplacements anatomiques dans lequel prothèses rétiniennes cliniques ont été positionnés: epiretinally 3,4, 5,6 et sous-rétinienne suprachoroidally 7,8. Différents dispositifs utilisent différents matériaux et leur forme est personnaliséà l'emplacement dans lequel ils sont implantés. Cependant, ils ont tous créent percepts visuels en activant les neurones résiduelles de la rétine avec des impulsions électriques.
Il ya le potentiel pour une prothèse médicale d'endommager les tissus environnants en raison d'effets mécaniques du placement initial ou des forces en cours ultérieurs. Dans le cas de stimulateurs implantables, tels que les prothèses rétiniennes, il est la contrepartie supplémentaire que les paramètres électriques devraient être dans des limites sûres. La sécurité des patients est primordiale, de sorte dispositifs doit être testé rigoureusement dans les études précliniques avant de passer à la fixation d'un clinique 9-15. Dans notre article d'accompagnement, nous avons décrit une méthode pour évaluer l'histopathologie localisée de l'œil entourant un implant positionné dans l'espace suprachoroïdien 16. Dans la présente manuscrit, nous décrivons une méthode pour visualiser les tissus oculaires entourant un réseau d'électrodes plaquées à la rétine epiretinally, dans une préclinique (feligne) modèle (figure 1).
L'emplacement épirétinienne est la position la plus couramment utilisée pour localiser une prothèse visuelle. réseaux d'électrodes situées ici sont généralement fixés sur la rétine avec une pointe métallique qui pénètre dans toutes les couches 17-20 de l'oeil. Avant les techniques décrites dans le présent manuscrit, il était difficile d'évaluer avec précision la rétine et d'autres tissus environnants immédiatement un virement de bord. La fixation de l'oculaire standard utilisant du formol tamponné neutre causé des dommages de la rétine artefact dû au mouvement différentiel de la rétine et la sclérotique contre le point de l'amure fixe. Par conséquent, toute la réalité du dommage causé par le point d'amure et le réseau epiretinal n'a pas pu être observé avec précision. En outre, la coupe du tissu oculaire ne pouvait pas être effectuée avec le point d'amure de la rétine in situ comme des objets métalliques ne peuvent pas être facilement coupés avec un appareil histologique traditionnelle; enlever le point d'amure avant le traitement histologique a également étéindésirable, car cela a aussi conduit à des lésions rétiniennes artefact.
Le but de la présente étude était double: 1) pour réduire décollement de rétine artefact sorte que tout dommage causé par le point d'amure et le tableau implant epiretinal peut être évaluée de façon fiable; et 2) pour visualiser l'architecture de la rétine à proximité de l'adhésivité sans l'enlever. Afin de parvenir à une vue, une nouvelle technique de fixation a été utilisé (comme décrit dans l'article compagnon 16), ce qui réduit le délaminage de la rétine artefact. Pour atteindre objectif 2, nous avons modifié un plongement, le meulage, le polissage et technique, développée à l'origine pour l'observation in situ d'électrodes d'implant cochléaire en 21-23. Les méthodes décrites dans ce manuscrit permettent la visualisation de la rétine environnante et adjacent à un virement de bord in situ tout en minimisant les dommages à la rétine et artéfactuelles permettant ainsi une évaluation précise des dommages potentiels causés par le point d'amure et le réseau epiretinal.
Protocol
NOTE: Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de recherche et d'éthique de Ear Animal Hospital Royal Victorian yeux et (RVEEH AEC; # 10-199AB). Les sujets ont été traités selon le «Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques" de Medical Research Council (2013) et la «prévention de la cruauté envers les animaux loi" Santé nationale et (1986 et amendements). Toutes les procédures d'évaluation et électrophysiologiques chirurgicaux, cliniques ont été réalisées sous anesthésie et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.
1. énucléation et fixation
REMARQUE: Suivez la procédure d'énucléation et la fixation décrite en détail dans le manuscrit de 16 compagnon, en prenant soin supplémentaire autour de câbles de périphérique ou des ports de vitrectomie, se il est présent. En bref, il se agit de:
- Transcardiaque perfuser le sujet avec une solution saline chaude suivie Buffe neutre froideformol rouge.
- Attachez sutures sur le globe oculaire pour servir de points de repère.
- Énucléer l'œil 16, maintenir les câbles du périphérique et tout attachement patches / onglets.
- Post-fixer l'œil dans une solution de Davidson pour les 18 - 36 heures.
- Transfert à 50% d'éthanol pendant 6-8 heures.
- Transfert à 70% d'éthanol et réfrigérer (4 ° C) jusqu'à ce que la dissection.
2. Electrode Enlèvement et Dissection.
REMARQUE: tous les implants épirétiniennes auront le même facteur de forme, mais en général, il y aura un réseau d'électrodes et une certaine forme de matériau de support flexible et adaptable. Les périphériques qui sont cloués à la rétine disposent d'un trou d'amure où le point d'amure métallique pénètre dans le tableau et l'arrière de l'œil, en gardant ces ensemble.
- Visualiser l'implant et le point où elle est fixée à la rétine.
- En utilisant une lame de 15 degrés faire une incision trans-cornéen périphérique et retirez le capot cornéen à expose l'iris et le cristallin sous-jacents.
- En utilisant une lame de 15 degrés, disinsert les fibres zonulaires de la lentille, retirer la lentille en totalité, l'exposition de la chambre postérieure avec l'implant épirétinienne et le point d'amure de métal in situ.
- Selon l'implant et l'étude effectuée, supprimer des composants étrangers avant de poursuivre la dissection.
NOTE: Dans le présent exemple, le tableau epiretinal en cours d'évaluation composée d'un ensemble d'électrodes de diamant et de l'électronique hermétique prototype logée dans un support conforme de silicone (produit dans la maison; reportez-vous à 20).- Ici, retirez délicatement le paquet électrode de diamant par dissection fine avec un scalpel. Laissez le corps en silicone de l'implant ainsi que le point d'amure de la rétine et les restes du câblage de platine (figure 2). Si un tableau / logement intégré ne fait pas partie de la conception du dispositif à l'étude, puis omettre cette étape (2.2).
- Soigneusementdisséquer un échantillon qui inclut le point d'amure et le tissu environnant dans l'orientation désirée. Utilisez des ciseaux fins de dissection à couper des bandes de pleine épaisseur à l'arrière de l'œil, y compris la sclérotique, la choroïde et de la rétine. Prélever un échantillon, qui donne une vue en coupe longitudinale de l'adhésivité, qui montre toutes les couches rétiniennes adjacentes à la pointe (Figure 2)
REMARQUE: L'orientation désirée pour l'échantillon peut différer en fonction du résultat particulier désiré. Par exemple, si l'on veut examiner la proximité de l'endommager de dépoussiérage pour le disque optique, puis le disque optique devrait être incluse dans l'échantillon.
3. Déshydratation, Embedding, de montage, de broyage, de coloration, et Imagerie
- Déshydrater l'échantillon sur trois jours dans les étapes de production d'éthanol progressistes:
- Déshydrater l'échantillon deux fois dans 70% d'éthanol pendant 2 heures.
- Déshydrater l'échantillon dans 80% d'éthanol pendant 2 heures, puis deux fois O / N.
- Déshydrater l'échantillon dans 90% d'éthanol pendant 2 heures TWICe.
- Déshydrater l'échantillon dans 100% d'éthanol pendant 2 heures deux fois, puis O / N.
- Déshydrater deux fois l'échantillon dans 100% d'acétone pendant 2 heures.
- Retirer l'échantillon de l'acétone et l'observer sous un microscope optique à mesure qu'il sèche à l'air à la température ambiante. Transférer l'échantillon à l'époxy (voir l'étape 3.4), juste avant qu'il ne commence à friser / effondrement.
REMARQUE: en enlevant le liquide à partir des résultats des tissus mous dans les cellules effondrées et retrait. Une appréciation du moment où le curling tissus / effondrement se produit est développé avec l'expérience.
- Retirer l'échantillon de l'acétone et l'observer sous un microscope optique à mesure qu'il sèche à l'air à la température ambiante. Transférer l'échantillon à l'époxy (voir l'étape 3.4), juste avant qu'il ne commence à friser / effondrement.
- Préparer résine époxy de qualité médicale selon les instructions du fabricant. Pour durcir la résine, utiliser soit 55 ° C pendant 1 heure ou 24 heures à température ambiante. Placez dans une chambre à vide pendant environ 5 min à environ 50 mbar pour enlever les bulles d'air. Réglementer le vide manuellement comme un vide excessive provoque le mélange époxy à ébullition et dégazage ne se produira pas efficace
REMARQUE: Effectuez l'étape 3.3 en même temps que l'étape 3.2. - Incluez la sample dans de la résine époxy transparente. Plonger le tissu oculaire en époxy dégazé dans un contenant hermétique approprié et laisser O / N à température ambiante pour guérir.
- Prenez soin d'intégrer l'échantillon dans l'orientation désirée (Figure 2) en redimensionnant et en re-enrobage le bloc époxy durcie. Re-incorporer le bloc redimensionnée contenant le tissu de l'oeil de telle sorte que l'axe long de l'adhésivité est orientée parallèlement au fond du moule (coupelle jaune - Figure 3A).
- Montez la résine dans un porte-échantillon de broyage et broyer l'échantillon (230 à 250 tours par minute avec de l'eau sur, ponçage manuel) en utilisant du papier de carbure de silicium (à partir de 800 grille; figures 3C et 3E).
- Pour la coloration, tremper la surface du sol dans le bleuissement toluidine pour 3-5 min, ou jusqu'à ce que la tache se développe (figure 3F).
- Rincer à l'eau du robinet (figure 3G).
- L'image de la surface du sol de l'échantillon avec un champ d'application haute puissance de dissection de visualiser les couches cellulaires de larétine (figure 3H). Appliquer une goutte d'eau distillée sur la surface supérieure de l'époxy-dessus du spécimen pour lisser la diffraction à l'interface air-résine époxy. Utilisez une fibre source de lumière optique «col de cygne» pour éclairer l'échantillon.
- Répéter les étapes 3.6 à 3.9, à chaque fois une épaisseur de meulage distance prédéterminée de l'échantillon (incrément minimal de meulage précis et reproductible de porte-échantillon est de 20 pm).
Representative Results
Le protocole de fixation réduit sensiblement détachement artefact et le délaminage de la rétine 16. Orientation de l'échantillon dans le bloc de résine époxy a été obtenu en utilisant le procédé constamment enrobage en deux étapes décrit. La procédure de broyage incrémentale nécessaire un niveau modéré de dextérité manuelle pour obtenir des résultats optimaux, mais a été aidé par le porte-échantillon réglable qui fourni un contrôle précis de la résolution de l'incrément. Dans tous les cas (n = 5) le point d'amure a été localisé et sol / poli avec des résultats souhaitables et cohérentes. La rétine à côté des punaises étaient résoluble et colorée appropriée. Le polissage de la surface du bloc de résine époxy avec une # 800 papier au carbure de silicium de grade P était suffisante pour imager la macrostructure cellulaire du tissu enrobé. Un papier de qualité supérieure, ou de diamant suspension peuvent être utilisés pour polir la surface supplémentaire à toute profondeur donnée, si désiré. Un microscope de dissection et fibre optique 'col de cygne' light la source se est avérée appropriée pour l'imagerie de la surface du bloc de masse et l'échantillon de tissu incorporé. La position de la source lumineuse a été modifiée par essais et erreurs pour trouver un emplacement et l'angle qui a donné le meilleur éclairage et le contraste à travers le microscope. L'ajout d'une goutte d'eau distillée sur la surface du bloc, au-dessus de l'échantillon, est utile pour réduire la diffraction de trajet de lumière et / ou des distorsions lisses à l'interface air époxy. La figure 4 montre un exemple d'images de tissu rétinien visualisées immédiatement adjacente à une rétine de titane virer de bord en utilisant cette technique. Décollement de la rétine d'artefact non-pliage et peut être vu de chaque côté de la silicone (figure 4A). L'arbre de la punaise est visible intégré dans silicone; la tête de l'amure a pénétré la rétine et la sclérotique. Il est décollement de la rétine non-artefact dans la rétine non coloré et d'autre de la silicone (figure 4C). La technique a montré que, dans ce cas, there est la désorganisation de la rétine à proximité de l'adhésivité et la compression de la rétine due à une côté à un angle oblique d'insertion. A noter que les images présentées ne sont que des illustrations du succès de la technique, et non collante représentant de dommages histopathologie en général.
Figure 1. Placement d'un réseau d'électrodes épirétinienne. (A) Représentation schématique de l'œil montrant une coupe transversale agrandie de la sclérotique postérieure, la choroïde et de la rétine dégénérée (manquant photorécepteurs). Un réseau d'électrodes est représentée en bleu, apposée epiretinally. (B) assisté par ordinateur d'étirage d'un ensemble d'électrode épirétinienne. un, à circuit intégré («puce») et emballage des électrodes; b, titane attache rétinienne; c, le logement de silicone de qualité médicale; d, point de sortie de plomb. Panel A modifiée de un illustrati originauxsur une gracieuseté de Bionic Vision Australia, auteur Beth Croce. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Electrode élimination et la dissection de l'œil. Grande gamme dynamique macro photographies d'un oeil félin énucléé avec amure epiretinal in situ. (A) la fixation Poster avec le fixateur de Davidson pour préserver l'architecture de la rétine 16, l'œil énucléé a été disséqué. Le paquet de réseau d'électrodes a été retiré du support de silicone (contour carré en pointillés indique l'emplacement d'origine du réseau d'électrodes) avec le point d'amure (flèche) et le corps de silicone de l'implant restant. (B) L'œil a été disséqué avec la section longitudinale adjacente à la punaise(Ligne pointillée). Le collant reste noyé dans la paroi postérieure de l'œilleton (flèche), stabilisée principalement par la sclérotique. La section de tissu contenant le point d'amure a été préparé à l'encastrement de résine et de broyage (segment droite), tandis que la section contenant la rétine sous le réseau d'électrodes enlevé a été préparé pour le traitement histologique norme 16 (segment de gauche). Une règle avec incréments de 0,5 mm est indiqué au bas de chaque panneau. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Epoxy encastrement et le broyage de la tactique et le tissu rétinien. Photographies de l'époxy et intégré échantillon de tissu aligné, de broyage, de coloration et d'imagerie de la sellerie et les tissus de la rétine. (A) Le tac k échantillon a été noyé dans un bloc de résine époxy. Utilisation du moule, l'échantillon a été orienté de sorte que le plan longitudinal est parallèle au fond du moule. (B) Le bloc époxy durcie contenant l'échantillon de dépoussiérage. (C) Le bloc de résine époxy a été montée dans un porte-échantillon broyage, prêt pour meuler . (D) L'échantillon a été orienté sections afin imagées du tissu du sol contiennent les couches cellulaires de la rétine et l'axe longitudinal de l'amure. (E) L'échantillon a été broyé en utilisant du papier de carbure de silicium sur un broyeur rotatif. (F) La surface au sol de le bloc a été coloré avec du bleu de toluidine pour identifier les couches de la rétine. (G) Le bloc a été rincé à l'eau du robinet pour enlever l'excès de colorant. (H) Le toluidine couches de la rétine colorées en bleu et la sellerie ont été imagées en utilisant un champ de dissection haute puissance.
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Figure 4. images de haute et basse puissance de la tactique et de la rétine. À divers moments les images de processus de broyage ont été prises avec un microscope à dissection, montrant des sections longitudinales de l'amure (astérisque) pénétrant à travers l'œil et à la sortie de la sclérotique ('S' ), silicone (hash) et bleu de toluidine teinté et de la rétine non coloré («R») attenant. Notez que ce sont des exemples d'images seulement pour démontrer la technique de visualisation présente, et ne sont pas représentatifs de tous les implants ou tack résultats insertion d'histologie épirétiniennes. restes de sol du câblage de platine sont visibles dans les panneaux AD («W»). (A) de faible puissance, l'image immaculée de la amure pénétrer la rétine et la sclérotique. (B) Haute qualité d'image motorisé du décollement de la rétine et de pliage dans la rétine tache adjacente sur le support de l'image A. silicone (C) image de faible puissance dans au centre de l'arbre de la punaise.
Discussion
Techniques histologiques standard sont incapables de traiter des implants métalliques durs in situ en raison des limites de coupe ces objets de métal, de verre ou même des lames diamant. Dans notre document d'accompagnement 16, nous avons montré que l'utilisation d'une technique de fixation des yeux toute modification pourrait réduire le délaminage de la rétine artefact. Dans le manuscrit en cours, un meulage et de polissage établis technique pour visualiser les implants cochléaires 21-23 in situ a été modifié pour les prothèses rétiniennes. Une adhérence de titane, utilisé pour fixer un réseau d'électrodes de la rétine, epiretinally, a été noyé dans de l'époxy avec le tissu oculaire environnant. Ce bloc de résine a alors été orienté de manière appropriée et la terre progressivement / poli afin de révéler la morphologie des tissus immédiatement adjacente à la punaise de métal. Images de la surface polie du bloc à différentes profondeurs ont été prises avec un microscope de dissection puissant. Cette technique est utile pour: visualisation et évaluatment la réponse du tissu adjacent à l'implant épirétinienne; pour évaluer le traumatisme chirurgical associé à l'implantation de l'implant; pour déterminer la réaction biologique pour les pièces en métaux durs; et à mesurer la distance entre l'implant et la surface de la rétine.
Cette technique sera utile dans les futures études de sécurité pour la visualisation in situ de la région adjacente à une attache rétinienne ou d'autres (par exemple, métalliques) des objets durs dans l'œil dans. Cela a une application directe pour évaluer l'innocuité préclinique de prothèses cloué à la rétine epiretinally. Il peut également être utile pour l'évaluation des dommages aux tissus de la rétine dans des régions en contact avec des implants situés à l'emplacement du sous-rétinien.
Il ya plusieurs façons de vérifier que la technique a été effectuée correctement. A chaque étape, la rétine doit rester attaché aux couches externes de l'œil. Se il ya décollement de la rétine artefact brute, ce qui peut Indicmangé un problème avec la fixation. Lorsque l'échantillon est intégré et re-orienté dans la résine finale bloquer la rétine devrait être proche de l'orthogonale-face de meulage du bloc; ce qui réduira la coupe oblique. Il est utile de vérifier que le nombre d'étapes supplémentaires de broyage (de taille de pas connu) nécessaire pour parcourir un objet (comme une attache rétinienne) corrélation conséquence avec les dimensions de l'objet.
La technique peut être optimisée de plusieurs façons. Rayures sur la surface du bloc époxy associé au processus de broyage peuvent être réduites progressivement polissage de qualité plus fine. Pour la présente étude, nous avons utilisé 800, 1000, 1200, 2400, 4000 et papier au carbure de silicium de qualité. Pâte de diamant pourrait également être utilisé pour améliorer la finition de surface. Une finition de surface plus fine donne une image de qualité supérieure mais au prix de temps de polissage supplémentaire. Un autre élément clé pour améliorer les résultats de cette technique est le choix et la qualité de l'optics et d'éclairage utilisés pour la capture d'image. Autres taches histologiques de base - en particulier les taches de Nissl, peuvent être utilisés à la place du bleu de toluidine, mais peuvent nécessiter une optimisation plus poussée. Certaines taches peuvent tacher la résine ainsi que le tissu (par exemple, l'éosine), donc un vernis peu profonde peut être nécessaire après la coloration de fond pour enlever la décoloration. Taches spécialisées, des colorants fluorescents et la coloration immunohistochimique n'a pas été tentée, mais moins qu'un résultat très spécifique est souhaitée, le temps nécessaire pour effectuer ces tâches à chaque niveau de broyage est susceptible d'être prohibitif. Toutefois, il peut être possible de teindre le tissu dans son ensemble avant l'étape de l'incorporation (étape 3.4) 24.
La principale limite de cette technique est que, une fois la région d'intérêt a été meulés, il ne peut pas être récupéré, par conséquent, il est prudent de capturer plusieurs images (éventuellement redondantes) à une variété de grossissements à chaque étape de meulage et le polissage. Il estégalement important d'utiliser de petits incréments pour chaque réglage de la profondeur de broyage. Une autre limite de cette technique est que de l'agrandissement et de la résolution optique en comparaison avec le tissu monté sur une lame de verre et lu avec un écart (transmission) microscope optique. Aux fins de prototypage et d'évaluer la sécurité d'un dispositif d'implant roman, l'évaluation macropathologique est d'un intérêt primordial. Cette technique fournit un procédé efficace pour l'observation des dommages cliniquement significative associée à une attache rétinienne. Avec la pratique, le temps global nécessaire pour réunir, meuler, polir et de photographier un échantillon donné (une fois embarqués) est comparable au temps qu'il faudrait pour la section d'un bloc de paraffine ou de l'article congelé.
Il ya aussi la possibilité que les techniques actuelles d'être étendu à des applications en dehors du champ d'application des implants rétiniens. Cette technique est adaptée à l'évaluation le tissu adjacent à un implant dur, où l'extraction de l'implant ne est pas feasible ou nuirait à l'interface. Par exemple, cette technique pourrait être étendu à évaluer implants fabriqués à partir de métal (par exemple, le platine, le nitinol, etc.) qui ne peut être coupé par des techniques histologiques classiques, tels que certains cérébrale profonde ou électrodes de nerfs périphériques, les canules pour la délivrance de médicaments, les endoprothèses vasculaires ou des prothèses orthopédiques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
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