Summary
여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.
Abstract
여기서 우리는 Organotypic 슬라이스 배양 기술을 이용하여 쥐의 뇌에서 해마 신경 산후을 연구하는 기술을 설명한다. 개발 해마 치아 이랑에되는 약물의 직접 적용을 허용하면서이 방법은 해마의 특징적인 지형 형태를 유지한다. 또한, 슬라이스 배양 물은 4 주까지 유지 될 수 있으며, 따라서, 일 그래뉼은 신생아 신경 세포의 성숙 과정을 연구 할 수있다. 복소 변수를 제외하면서 슬라이스 문화는 해마의 해부학 깊은 위치뿐만 아니라 혈액 뇌 장벽과 관련된 불확실성으로 해마 슬라이스 약리학 효율적인 조작이 가능. 이러한 이유로, 우리는 출생 후 신경 연구를 위해 특별히 Organotypic 슬라이스 문화를 최적화하기 위해 노력했다.
Protocol
참고 : 모든 동물의 절차는 토론토 대학에서 비교 의학과의 동물의 건강과 복지 가이드 라인을 따른다.
해마 조각 1. 준비
- 125 ° C에서 건조 오토 클레이브를 사용하여 다음과 같은기구를 소독 : 메스 핸들 (# 3) (2), 표준 패턴 집게, 대형 (1), 작은 해부학자 시저 (좌우로 각도) (1), 마이크로 스푼 (숟가락과 평면 주걱 끝) (1), 둥근 마이크로 주걱 (및 테이퍼 끝을 둥글게) (2), 미세 붓 (1), 화재 광택 파스퇴르 피펫 (2), 거즈 사각형, 2 × 2 인치 (5).
- 때 살균, 멸균 용기에 악기를 넣어 사용할 때까지 덮여 유지. 즉시 절개하기 전에, 70 % 에탄올 용액에 담궈 악기.
- 35 ° C의 배양기에서 플레이트를 웰 / 배지 1 ㎖를 첨가하고 저장함으로써 절개 절차를 시작하기 전에 배양 인서트 6 웰 배양 플레이트를 준비차 5 % CO 2.
2. 멸균 층류 후드의 해부 도구를 정렬
- 70 % 에탄올과 층류 후드 스프레이 및 알코올 멸균 해부 악기를 제거합니다. 멸균 페트리 접시에 휴식하는 알코올과 해부 뇌 조직 사이의 접촉을 피하도록하면서 악기가 건조하도록 허용합니다.
- 2 개의 대형 멸균 페트리 접시에 살균 얼음처럼 차가운 해부 솔루션의 예금 5-7 ml의. 한 접시 차리고 머리 (더러운), 냉각 밖으로 훔쳐 뇌 (청소)을 세척을 위해 다른 하나를 정리합니다. 뇌를 해부에 대한 페트리 접시 뚜껑 중 하나에 살균 필터 종이를 놓습니다.
- 해마를 해부에 대한 작은 페트리 접시 뚜껑 중 하나에 작은, 살균 필터 종이를 놓습니다. 이 작은, 멸균 페트리 접시에 살균 얼음처럼 차가운 해부 솔루션의 예금 3-5 ml의. 한 접시 하나는 해마 부분의 분리시 섹션을 개최, 밖으로 훔쳐 해마를 개최합니다해부 현미경.
- 절삭 단계 멸균 여과지를 테이핑하고 멸균 면도날을 장착함으로써 조직 초퍼를 준비한다. 멸균 해부 솔루션 필터 종이를 젖은.
- 알코올로 청소 바이오 가방 스프레이와 층류 클린 벤치에 넣습니다.
3. 해마 해부
- 층류 클린 벤치의 외부 70 % 에탄올과 P7 스프 라그 돌리 래트 새끼 스프레이 신속 층류 벤치 내부에 대형 멸균 수술 가위를 사용하여 동물을 참살. 머리는 페트리 접시 중 하나에 얼음처럼 차가운 해부 솔루션으로 떨어 뜨려.
- 페트리 접시에서 피를 씻어하고 빨리 살균 필터 종이에 머리, 복부 측면을 전송합니다.
- 시상면에서 등쪽 표면을 따라 잘라 메스를 사용하면 기본 두개골을 노출. 부드럽고 t의 쥐에서 쉽게 꿰뚫어입니다 기본 뼈, 피부를 통해 잘라 내기,하지만그의 나이. 옆이 "더러운"메스를 설정하고 뇌 조직에 사용하지 마십시오.
- 작은 해부학자의 (좌우로 각도) 가위와 집게를 사용하여, 브레 그마에 두개골의 시상 봉합을 따라 관상 봉합이 시상 봉합에 의해 수직으로 교차하는 두개골의 해부학 적 지점을 두개골을 오픈. 두개골의 정중선에서 위로 떨어져 두개골 플랩을 끌어 집게를 사용합니다.
- 부드럽게 두개골의 두뇌를 리프트, 뇌간 뇌에 아래의 아래쪽에 마이크로 스푼을 넣습니다. 뇌의 기저 표면에 시신경과 후각 망울을 노출 뇌를 들어 올립니다. 완전히 두개골에서 뇌를 분리 작은 가위로 이러한 구조를 잘라. 제거하고 해부 빙냉 용액을 함유하는 다른 큰 페트리 접시에 뇌 손상을 전송.
- 마이크로 숟가락을 사용하여, 멸균 여과지를 함유하는 작은 페트리 접시 뚜껑에 뇌 옮긴다. 멸균 파스퇴르 피펫으로, DIS 몇 방울 뇌를 씻어솔루션을 secting하는 조직 촉촉한 유지합니다.
- "깨끗한"메스 블레이드를 사용하여 떨어져 두 개의 반구를 잘라. 마이크로 스푼으로 큰 페트리 접시로 다시 왼쪽 반구를 전송하고 이후 사용을 위해 얼음처럼 차가운 해부 솔루션 아래 반구 피아 측면을 배치합니다.
- 오른쪽 반구의 내측 얼굴을보고 가장자리 원개, 해마의 안쪽 가장자리를 따라 백질의 눈에 잘 띄는 밴드를 식별합니다. 멸균 메스를 사용하면, 원개를 통해 시상 상처를 만들지 만, 메스 팁 0.5 cm가 원개를 절단하기에 충분하기 때문에주의하십시오.
- 2 마이크로 주걱을 사용하여, 뇌 줄기에 오른쪽 손으로 주걱을 배치하고 왼쪽 주걱 위에 놓인 피질을 들어 올려 오른쪽 반구에서 첫 번째 해마를 제거합니다. 부드럽게 해마의 뇌실 및 내측 표면을 공개하는 피질를 들어 올립니다. 흰색 곡선, fimbria, 지금은 볼 수 있어야합니다.
- curva와 주걱의 곡률을 맞 춥니 다fimbria의 헌과 부드럽게는 fimbria 아래 주걱을 누릅니다. 왼쪽 주걱을 밀어 주동이의 - 꼬리 축을 따라 타고 다음 해마를 제거하는 등의 방향으로 주걱을 들어 올립니다.
- 얼음처럼 차가운 해부 솔루션으로 2 차 작은 페트리 접시에 해마를 전송합니다. 좌측 해마를 제거 좌반구에 동일한 절차를 반복한다.
- 마이크로 주걱을 사용하여 조심스럽게 조직 헬기 단계로 해마를 전송합니다. 초퍼 블레이드의 축이 서로 직교하고 그들에 인접하고 평행 배열. 조직의 위치와 해마의 상단에 해부 솔루션의 몇 방울을 추가하는 붓을 사용합니다.
- 개별 조각을 제거하기 위해 일시 정지하지 않고 400 μm의 조각의 조직을 잘라 (보통 칼날을 준수하지 않을 것이다). 전체 해마가 절단 된 후, 부드럽게 해부 솔루션으로 2 차 작은 페트리 접시에 섹션을 전송하기 위해 붓을 사용합니다.
- 광고에서현미경을 issecting, 조심스럽게 amicro-주걱 및 페인트 브러시를 사용하여 부동 조각을 분리합니다.
- 층류 후드의 보육과 장소에서 문화 인서트 사전 준비 배양 플레이트를 제거합니다.
- 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여, 문화 삽입 멤브레인의 혀끝의 표면에 피펫 및 전송 조각으로 4 ~ 5 조각을 그립니다. 다음으로, 페인트 브러시와 위치를 조정하고 개별 섹션과 문화 삽입의 경계 사이의 공간을 남겨.
- 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여, 막 혀끝의 표면에서 과잉 해부 솔루션을 제거합니다.
참고 : 피펫으로 조직 절편을 그리기 솔루션을 피를 제거하는 동안. 또한, 천천히 용액을 제거 멸균 피펫 팁을 정기적으로 피펫 (P200 또는 P1000)를 사용합니다. - 혈청 함유 배지와 35 ° C에서 인큐베이터에 해마 슬라이스와 5 % CO 2와 문화 판을 놓습니다.
참고 : 실험 호출하는 경우여러 동물 문화를 생성, 철저하게 해부 사이의 층류 클린 벤치를 청소합니다. 알코올 용액에 악기를 돌려 모든 페트리 접시, 여과지와 두 번째 해부하기 전에 멸균 면도날을 교체합니다.
4. 수유와의 Organotypic 조각을 유지
- 멸균 층류 클린 벤치에서 피드 문화.
- 배양 섹션 이일 후 해부의 첫 공급을 수행합니다. 멸균 유리 피펫을 사용하여 대기음 된 배지.
- 우물에 신선한, 멸균, 혈청 함유 배지 1 ㎖를 추가하는 멸균을 5 ml에게 혈청 피펫을 사용합니다.
- 부드럽게 문화 삽입물을 장착하고 막 표면 아래에 형성 할 수있는 공기 방울을 제거하기 위해주의를 기울입니다.
- 처음 공급 한 후, 매일 매체를 변경합니다.
티미 딘 유사체 5. 배양 조직 조각 신생아 뉴런에 레이블을 지정하려면
- 공부를하기 위해성숙과 해마에 이가있는 과립 세포의 통합은 이러한 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 또는 Chlorodeoxyuridine (CldU)로 티미 딘 아날로그로의 Organotypic 슬라이스를 품어. 여기, 우리 때문에 식염수에서의 높은 용해도의 CldU을 사용합니다.
- 3DIV 후, 10 ㎍ / ml의 최종 농도를위한 배양 배지 1 ㎖의 생리 식염수에 10 ㎎ / ㎖ CldU 스톡 용액을 추가 1 μL. BrdU를 사용하는 경우, 분자량의 차이에 대한 농도를 수정한다. 문화 우물에 CldU와 매체를 추가하고 35 ° C에서 2 시간 동안 매체를 CldU이 함유와 조직을 배양한다.
- 35 ° C에서 배양 2 시간에 따라, CldU 함유 배지를 제거하고 (위에서 설명한) 정상 공급 일정을 다시 시작하는 일반 공급 배지로 교체합니다.
6. 조직 고정 및 저장
- 치료를 적용하고 배양 실험 (그림 2B)를 시작하기 전에 조직 샘플을 고정하기위한 타임 라인을 설정합니다. <소정 일 후 해부에서 리>, 실험실 흄 후드에서 다음과 같은 준비 : 10 ~ 50 비이커 인산염 완충 식염수 (PBS)에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 단계; 폐기 배지 빈 비커; 작은 집게; 일회용 팁과 1,000 mL의 피펫.
- 흄 후드 배양 챔버 및 전송에서 배양 플레이트를 분리합니다. 집게로 개별 웰 플레이트 삽입을 기울입니다. 다음으로, 처분 비커에 문화 매체와 전송을 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 모든 문화 매체가 제거되었는지 확인하기 위해 각도로 문화 판을 기울입니다.
- 한번에 한 배양 접시에 대한 매체를 제거 완료. 매체가 제거 된 경우, 잘 각각의 문화에 4 % PFA 1 ㎖를 넣고 잘 파라 필름과 판 인감. 24 시간 동안 4 ° C에서 냉장고에 필요하고 전송 플레이트 많은 문화 판을 반복합니다.
- 24 시간 후, 흄 후드에서 다음을 준비 : 10 ~ 50 PBS의 0.1 % 아 지드 화 나트륨을 함유하는 비이커; 빈폐기 PFA (독성 물질을 폐기 할 때는 안전주의 사항을 준수)에 대한 비커; 작은 집게; 일회용 팁을 1,000 ㎖를 피펫.
- PFA를 추가하는 6.4에 설명 된 절차에 따라, 대신에 아 지드 화 나트륨과 1 ㎖의 PBS를 추가합니다. 일단 완전히 파라 필름의 가장자리를 포장하고 4 ° C에서 냉장고에 저장하여 나중에 사용하기 위해, 인감 웰 플레이트를 옮겼다.
7. 면역 조직에 대한 조직을 단면
- 에 vibratome를 사용하여 단면 조직을 수행합니다. 다음과 같은 일련의 단계가의 Organotypic 문화에서 사용 가능한 조직 섹션의 수율을 극대화 할 수 있도록 도움을줍니다.
주 : 즉시 해마 절제술 및 슬라이스 도금 다음, 조직은 대략 400 ㎛의 두께를 갖는다. 그러나, 배양 챔버 2 ~ 3 주 후, 조직 슬라이스 150-300 ㎛의 마지막 부분 두께의 결과로, 평평하기 시작합니다. - 섹션 배양 조직에 다음 항목을 준비 : # 11 메스 B를짐을 싣다 및 처리, 조직을 탑재 얼음 차가운 PBS, 마이크로 해부 포셉, 깨끗한에 vibratome 절단 단계를 포함하는 유리 페트리 접시.
- 이 플라스틱 인서트 하우징으로부터 분리 될 수 있도록 메스 조심스럽게 원형 인서트 막의 주변을 따라 절단한다. 배양 슬라이스와 메스 사이에 충분한 공간을 두십시오.
- PBS를 함유하는 페트리 접시로 삽입 분리 멤브레인을 전송. PBS에 세척 한 후,에 vibratome 설치 단계로 막을 전송하는 집게를 사용합니다.
- 다음, 배양 한 조각을 둘러싼 초과 멤브레인을 제거하고 깨끗한 가장자리를 만들기 위해 여분의 재료를 절단하기 위해 메스를 사용합니다. 멤브레인을 보장이 단계는 평평하고 쉽게 절삭면에 부착 할 수있다.
- 에 vibratome 절단 단계에서 접착제의 1 ~ 2 방울을 넣고도 22 G 바늘을 사용하여 계층에 확산. 에 vibratome의 칼날 길이가 긴 변에 평행 한 직사각형 형상으로 접착제를 확산. 이 단계를 수행빨리 건조되는 접착제를 방지한다.
- 절단 단계로 해마 슬라이스를 포함 트리밍 멤브레인을 전송하고 부드럽게 접착제에 막을 놓고 기포가 없는지 확인하기 위해 집게를 사용합니다.
- superglue가 건조로, 다시 PBS 포함하는 페트리 접시에 붙어 막을에 vibratome 단계를 전송할 수 있습니다. 에 vibratome 블레이드와 조직 섹션을 저장하기 위해 48 웰 플레이트 함유 아 지드 화 나트륨을 준비한다.
- 스토리지 및 이후의 면역 조직 화학 염색에 대한 48 웰 플레이트 포함, 아 지드 화 나트륨에의 Organotypic 슬라이스 조직 및 전송의 30 μm의 섹션을 생성하기에 vibratome를 사용합니다.
- 면역 조직 화학 염색의 26,29위한 프로토콜 기존 사전을 참조하십시오.
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Representative Results
1) 조각은 체외에서 10~21일 (DIV) 후 해마 조각의 특성 형태 학적 특징을 유지하는 것이, 2) 신생아 DGCs 정량화 할 수있다 :의 Organotypic 문화가 성인 신경 연구에 적합 할 것인지 결정 그들은 두 가지 기준을 만족하는 것이 필요 일반적으로 성인의 신경 연구에 이용 표준 면역 조직 화학적 기법을 사용. 첫 번째 기준과 관련하여,도 1a와 1b는 보존 해마 형태를 강조 표시합니다. 이러한 치아 이랑 (DG)와 같은 특성 기능은 CA1과 CA3 영역은 쉽게 식별 할 수 있습니다.
두 번째 기준과 관련하여, 그림 1C (상단 패널) 신생아 DGCs 녹색의 내인성 신경 세포 마커, Doublecortin (DCX)과 외생 티미 딘 아날로그, 5- 클로로 -2'- 데 옥시 우리 딘 (CldU)의 공동 발현의 대표 샘플을 제공합니다 빨간색. 이 신경 세포는 서브 GR에 있습니다해마 DG의 anular 영역. 뉴런의 정확한 출생 데이트를 보장하기 위해, 우리는 DCX-Express를 공동 CldU + 핵을 식별합니다. 공 초점 현미경은 후보 셀이 셀의 Z 축에 걸쳐 관심 마커를 공동 발현되어야하기 때문에 성공적 이중 표지 된 뉴런을 식별하는이 단계에서 필요하다. 샘플 데이터는 이중 라벨 수율 DCX와 CldU 응용 프로그램을 현재 12 일째 CaBP을 표현 CldU + 세포의 35 %를 표명 CldU + 세포의 약 17 %를 얻을. CaBP 값이 생체 (26)에서 얻어진 비교 그림보다 훨씬 낮은 반면, DCX 값은 매우 유사하다. 표준 조직 배양 조건 CaBP + 세포의 상대적으로 낮은 비율을 책임 일 수있다.
그림 2A를 잘 (1 ~ 8) 왼쪽에서 진행 해부 단계를 제시한다 : 동물의 참수 (2), 뇌의 전송 얼음처럼 차가운 해부 솔루션 (3) 뇌 (1), 제거를 시작하는 해부에서 해마의 이온 왼쪽 해부 해마의 오른쪽 반구 (4), 저장 얼음처럼 차가운 해부 솔루션 (5), Stoelting 조직 헬기에 모두 해마의 전송 및 해부 현미경으로 개별 조각의 400 μm의 (6), 분리에서 단면 세포 배양에 인서트 (7), 및 도금 조직 (8). 이러한 방식으로 진행하는 문화 과정에서 무균 환경을 유지하는 데 도움이됩니다.
개발의 시간 코스는 해마 신경 세포의 중요한 기능이기 때문에 마지막으로, 우리는 정확히 2 시간 레이블 DIV 세 후에는 신경 줄기 세포를 분할하는 CldU와 배양 조각을 배양하기로 결정했습니다. CldU 투여를위한 좁은 시간 윈도우는 신경 세포의 동종 집단 대략 동일한 성숙 단계 (도 2)로 표시된 구성 가능성을 향상시키기 위해 선택되었다. CldU 라벨에 관해서, 해마의 기능에 대한 신경의 하나의 중요한 기능은 병사에 있다는 것입니다VEN 시간은 다양한 성숙 단계 (27, 28)에 이가있는 과립 세포의 이종 인구가있다.
그림 1. 샘플 형광 현미경 사진은 해마의 형태를 보존 하이라이팅. CldU (녹색)과 CaBP (적색), 20 배 공기 합성 이미지에 대한 immunolabeled 십이일 포스트 해부에서 (A)의 Organotypic 슬라이스 (스케일 바 = 500 μm의) From 21 일 조각. (B) 샘플 현미경 CldU에 대한 immunolabeled 해부 (게시 빨간색) 및 DCX (녹색) 그림 1A의 (반대 색상 구성표), 20 배 공기 (스케일 바 = 100 ㎛). (C) 상단 패널. 세포의 대표 공 초점 현미경 사진 공동 발현 ClXdU과 내생 미성숙 신경 세포 마커, DCX. DGCs 공동 발현 DCX (녹색)과 CldU (적색) 신생아 뉴런으로 계산됩니다. 화살표는 두 번 라베를 나타냅니다개발, 40X 기름 침지 (스케일 바 = 10 μm의)의 초기 단계에서 세포를했다. 필적 세포는 생체 내 26 십일에게 후 라벨을 관찰되었다. 낮은 패널. 세포의 대표적인 형광 화상 공동 CldU 발현 (녹색) 및 CaBP (적색). 화살표는 이중 표지 세포, 40X 형광 현미경 (스케일 바 = 10 μm의)을 나타냅니다. DG-치아 이랑 (dentate gyrus). GCL-과립 세포층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
층류 클린 벤치에서 해마 해부에 대한 순차적 인 단계의 그림 2. (A) 그림. 점선은 해부 영역의 "unsterile"(왼쪽)과 "멸균"(오른쪽) 영역을 나타냅니다. 유기 용 (B) 타임 라인P7 쥐 새끼 (시작)으로부터 제조 typic 슬라이스 문화. 표기법 티미 딘 아날로그, CldU * 및 실험 질문에 맞는 다양한 약리 에이전트를 포함 할 수 있습니다 "치료"의 응용 프로그램을 나타냅니다. 문화가 CldU 응용 프로그램 (문화 수정)에서 원하는 체류 시간에 파라 포름 알데히드로 고정되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 / 장비의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 / 설명 |
| 5- 클로로 -2'- 데 옥시 우리 딘 (CldU) | MP 바이오 메디칼 | 105478 | 유해 물질, 발암 성 |
| 세포 배양은 30mm 직경 0.4 μm의 피, 삽입광석 크기 | 과학 열 | 140660 | 이러한 삽입에 Nuclon 델타 코팅은 더 나은 조직 유착을 제공하며, 슬라이스 품질을 향상시킵니다. |
| 원뿔 원심 분리기 튜브 (멸균) | 피셔 과학 | 14-432-22 | |
| 해부학자 가위 (좌우로 각도) | 파인 과학 도구 | 14082-09 | |
| 최소 필수 배지 (MEM) | 기브 | 11095; 액체 | 4 스토어 ° C에서 |
| 이클립스 니켈 U 형광 현미경 | 니콘 | ||
| 조직에 대한 접착제 | 크레이지 접착제 | KG585 | 접착제에 노출되는 조직 IHC에 대해 사용할 수 없게되므로 접착력을 달성하기 위해 접착제의 최소 금액을 사용합니다. |
| 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (500 mL) 중 | 기브 | 14025-092 | 4 스토어 ° C에서 |
| 말 혈청 열 불 활성화 (500 ㎖) | 기브 | 16050-122 | -20 ° C에서 50 분취 량 및 저장합니다 |
| Kimwipes | 킴벌리 - 클라크 | TW 31KYPBX | |
| 수정 유리 피펫 (분젠 화염 부드럽게 파스퇴르 피펫을 제거하고 가장자리의 아래) | |||
| 페트리 접시 (100mm X 15mm)과 (60mm X 15mm) | 피셔 브랜드 | FB0875712 및 FB0875713A | |
| 메스 블레이드 # 11 | 파인 과학 도구 | 10011-00 | |
| 메스 핸들 # 3 | 파인 과학 도구 | 10003-12 | |
| 혈청 학적 피펫 | Sorfa 의료 플라스틱 (주) | P8050 | |
| 표준 패턴 집게 | 파인 과학 도구 | 11000-12 | |
| 멸균 진공 필터 | 열 과학 | 565-0020 | |
| 외과 용 가위 | 파인 과학 도구 | 14054-13 | |
| 주사기 구동 필터 유닛 | 밀리 포아 - 밀 렉스 | SLGP033RS | |
| 이동 무대와 조직 헬기 | Stoelting | 51425 | |
| 파인 팁 페인트 브러시 |
표 1. 소모품 및 시약
| 해결 | 성분 및 지침 |
| 해부 솔루션 | 행크의) 500 ml의# 39;의 균형 소금 솔루션 (HBSS) (기브-14025-092). |
| B) 2.2 g의 D-포도당을 추가합니다. | |
| C) 0.5 g의 자당을 추가합니다. | |
| D) 1.787 g의 HEPES를 추가합니다. | |
| 전자) 자기 교반 판 30 분간 섞는다. | |
| 솔루션을 보장하기 위해 F)을 사용하여 pH 미터는 7.4 = 최종 pH가 있습니다. | |
| g) 최종 삼투압 = 320-330 mOsm을 보장하기 위해 osmometer를 사용합니다. | |
| H)는 0.2 ㎛의 필터를 통해 진공 여과를 사용하여 무균 층류 후드에서 멸균 용액. | |
| 혈청 함유 배지 : 100 ml의 최소 필수 중간 (MEM) (기브 11095), 50 ml의 말 혈청 (기브 16050-122), 50 ml의 HBSS. | ) 비커에 50 ml의 HBSS에 다음을 추가하고 37 ° C의 물을 욕조에 녹여. 자석 교반기로 혼합. |
| b) 1.3 g D- 글루코스. | |
| C) 36 mg을 황산. | |
| 디) 17.6 mg의 아스코르브 산 (ascorbic acid). | |
| 전자) 2M CaCl2를 원액의 5 μL. | |
| 기브 15140-062); F) 50 μL 항생제 안티 곰팡이 (100 배 주식, 멸균을 추가합니다. | |
| g) / ml의 인슐린 1 μg의. | |
| H), 0.2 ㎛의 필터를 통해 상기 용액을 여과에 의해 멸균. | |
| ⅰ) 믹스 필터링 100 ml의 MEM과 솔루션 및 층류 후드에 50 ml의 말 혈청. | |
| J) 멸균 원뿔 원심 분리기 튜브에 50 ㎖ 씩합니다 (피셔 과학-14-432-22) 및 4 ℃에서 저장. | |
| 4 % 파라 포름 알데히드 정착액 솔루션입니다. | a) H 2 O 증류수 300 ml의 다음과 자기 교반 플레이트에 첨가하여 혼합을 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. |
| b) 2.7 g의 인산 나트륨 일 염기 (NaH를 2 PO 4)을 추가한다. | |
| C) 11.5 g 나트륨 phosphat 추가E 이염 (NaHPO 4). | |
| d) 9.0 g 염화나트륨 (염화나트륨)을 추가한다. | |
| 마) 약 가열한다. 700 55 ° C에 증류수 H 2 O ml의 열을 차단합니다. | |
| F) 40g 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가하고 자기 교반 플레이트를 사용하여 물 700 ml의로 저어. | |
| g)를 PBS (A, B, C, D)를 결합하고 PFA (E, F) 솔루션은 1000 ㎖의 최종 부피로 7.4 및 상부까지 pH를 조정한다. | |
| 0.1 % 아 지드 화 나트륨 솔루션 | a) PBS 용액의 1 L에 아 지드 화 나트륨 분말의 1g (NaN3가)를 추가한다. |
| 나) 혼합 4 ° C에서 자기 교반 플레이트와 저장소를 사용. |
표 2. 솔루션 및 조리법
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Discussion
CldU (또는 BrdU의) 투여 후, 약리 에이전트의 응용 프로그램의 타임 라인이 특히 발달이 진행되는 동안 신생아 DGCs을 대상으로 선택 될 수있다. 예를 들어, 에이전트는 가상의 GABA가 탈분극 곳 발달 단계에있는 미성숙 뉴런의 나이와 일치하는 것이 제안되어 두번째 주 사후 CldU 주입 동안 적용될 수있다. 이 프로토콜을 이용하여 향후 연구 약리 에이전트 및 "맞춤형"관심있는 특정 실험 질문 접근법에 노출 창을 적용 할 수있다.
그 슬라이스 문화가 출생 후 신경 연구를위한 유효한 모델입니다 결정하는 중요한 기준은 해마에서 신생아 신경 세포를 염색하고 정량화 할 수있는 능력이다. 이 가설을지지하는 두 가지 주요 연구 결과는 현미경 분석이 CldU과 같은 신경 세포에서 내인성 단백질 마커에 대한 면역 반응성을 밝혀 것을이었다.내인성 신경 세포 마커와 함께 사용되는 경우 등의 BrdU와 CldU로 티미 딘 유사체는 신경 연구를위한 강력한 도구입니다.
복강 내 주사를 통해 같은 BrdU의 티미 딘 유사체 등의 출원은, 일반적으로 유사 분열 (29)의 S 상을받은 라벨 뉴런 신경 연구에 이용된다. 유사한 접근 방식은 소정의 수정의 Organotypic 배양에 이용 될 수있다. 예를 들어, 이전의 연구 (3 일 0.5 μM)는 14 ~ DIV 18 후 문화를 슬라이스 BrdU의 투여. 그 논문에서 제시 한 데이터를 검토 한 결과, 통계 중 일부는 신경 필드, 즉에 사용되는 표준 기술, stereological 정량화 (30)를 사용하지 않는 신경을 정량화에 사용되는 것을 알 수있다. BrdU의 신경 세포 - 핵 (NeuN) 양성 세포의 공동 발현을보고 할 때 예를 들어, 그들은 알려 제공하는 대신 "배양 당"셀의 총 개수를 나타낸다조직 영역 또는 볼륨에 대한 ATION.
후속 연구는 항체가보다 쉽게 조직 샘플 (31)을 투과 할 수 있도록하여 시각화 및 면역 조직 화학 프로토콜을 개선 개별 10 μm의 섹션에 배양 조각을 단면으로이 방법에 개선. 이층 등. 28 ~ 10㎛ 부당 공동 표지 된 세포의 수와 같은 BrdU의 이중 라벨링 (3 일 동안 10 μM)을보고하지만, 비교 영역 또는 특정 해마 영역 공부 즉, CA1, CA3 또는 정보를 제공하지 않았다 DG. 또한, 공 초점 형광 현미경 이미지의 분석은 설득력 해마 형태가 성공적으로 유지 한 표시되지 않습니다.
중요한 것은, 두 연구는 단점과 연결되어 삼일의 BrdU의 노출 기간을 사용했다. BrdU의 라벨이 크게 연구자들은 버지니아에서 새로 분할 셀을 추적 할 수 있도록함으로써 신경 연구를 주었있다rious 뇌 영역. 그러나, BrdU의 독성은 잘 특징으로하고있다. 그 용도는 형태 학적 및 행동 이상 (32, 33)와 신경줄 기세포의 34-36 세포주기, 분화, 생존 및 이주에 부정적인 영향을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 앞서 언급 한 연구에서 BrdU의의 장기간 투여는 해마 생리를 변경하고 BrdU의 관리에서 일부 부작용은 피할 수 있지만, 우리의 실험 프로토콜 티미 딘 유사체에 대한과 조직을 배양하여 이러한 합병증의 일부를 제한하도록 설계되었습니다 교란 변수를 도입 할 수있다 2 시간. 배양 용액을 제조하는 때 BrdU의보다 용해도를 보여 주었다 때문에 또한, 우리는 대신 BrdU의의 CldU를 사용하기로 결정했습니다. 삼일 프로토콜 특정 실험 설계의 예에 유용 할 수 있지만, 세포의 증식을 극대화 라벨이 2 시간 프로토콜은 상대적으로 작은 펄스의 popula 표지의 이점을 갖는다원하는 생존 시간에 공부하실 수 있습니다 세포의 기 (그림 2B 참조).
Organotypic 슬라이스 배양 37 라벨링 기술에 중요한 기여를 남바 등. BrdU의 애플리케이션의 서로 다른 두 가지 방법에 따라 신경 세포의 생산 수준과 비교하여. 30 분은 바로 조직의 적출에 따라 1 μm의 BrdU의를 포함하는 배양 배지를받은 체외 문화와 출생 후 5 일 (P5) 쥐에서 BrdU의 (50 ㎎ / ㎏)의 저자 비교 복강 내 (IP) 주입. 그들은 사이에 통계적으로 유의 한 차이를보고 생체 배양 조직 및 초기 시험관 BrdU의 주입입니다. 저자는 해마 구조를 개략적으로 선명한 이미지를 제공하지 않았다 그러나 그들은 과립 세포층의 총 세포의 백분율로 BrdU의 면역 반응을보고한다. 그들은 stereological 계산을 사용하는 동안, 지역 또는 부피 측정을 제공하는 도움이 될 것입니다. 대개철저한은 신경과 약리 섭동의 연구를위한 응용 프로그램과 함께, 출생 후의 해마 슬라이스 문화의 디테일로 인용 된 연구 현재의 Organotypic 문화. 이 기술을 사용하여, 해마 슬라이스 체외 (DIV)에서 21 일 동안 유지 될 수 있고 약물이 신경에 영향을 연구하기 위해 배양 기간에있어서 어떤 시점을 배지에 첨가 할 수있다.
우리의 목표는 2 시간 동안 CldU의 간단한 '펄스'응용 프로그램을 제공하여 DGCs의 이산, 상대적으로 동질적인 인구 레이블을했다. 신경을 연구 한 일반적으로 사용 전략은 티미 딘 아날로그와 다양한 내생 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 통해 신경 세포의 성숙 단계의 식별을 포함한다. 공 초점 형광 현미경 티미 딘 아날로그 CldU를 포함하므로 적극적 배양 기간 동안 유사 분열을 겪고 있었다 핵의 존재를 확인할 수 있었다.도 2를 생체 조직의 면역 조직 화학적 분석에 사용되는 프로토콜 슬라이스 문화 적응 될 수 있다는 증거를 제공한다.
특히, 신경 연구에 일반적으로 사용되는 방법은 완전히 다음과 같은 표현 주로 하루 3-21와 성숙한 신경 세포 마커, Calbindin (CaBP)에서 미성숙 신경 세포에서 발현되는 미세 소관 관련 단백질, DCX, 대한 면역 조직 화학 염색을 수행하는 것입니다 이십팔일 후 유사 분열. CldU + 세포의 표현형이 내인성 마커 (26)를 사용하여 측정 하였다.
긴 기간에 대한 슬라이스 문화를 유지하기위한 개선 된 방법이 더 CldU + 신경 세포가 성숙, CaBP + 단계에 도달 할 수있게의 추가 혜택을 가질 수있다. 현재의 Organotypic 배양 방법의 하나의 제한은 연속적 조직 배양 기간 동안 변화하는 점이다. 예를 들어, 즉시 해마 슬라이스 해부 및 도금 다음, TIssue은 약 400 ㎛의 폭을 갖는다. 그러나, 배양 챔버 2 ~ 3 주 후, 조직 슬라이스 250-350 μm의 사이에 최종 폭을 초래하는 씬으로 시작됩니다. 이는 면역 조직 화학을 위해 사용될 수 있고 사업을 위해 얼마나 많은 동물을 계획 할 때 고려해야 할 조직의 양을 제한한다. 추가 실험은 시험관 내에서 발생하는 해마 생리 기능 변경을 특성화하는 데 도움을줍니다.
해마 슬라이스 단면 및 염색 프로토콜은 배양 기간 동안 일어나는 세포의 형태 학적 변화를 분석하기 위해 개발되었다. 슬라이스 문화는 해마 DGCs가 성숙하는 동안 별개의 발달 단계를 통과 미래의 성인 신경 연구를위한 유용한 도구를 나타내는 등 다양한되는 약물의 효과를 테스트 할 수있는 기회를 제공한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
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