Summary
Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.
Abstract
Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo no cérebro de roedores utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método mantém a morfologia topográfica característica do hipocampo, enquanto que permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o desenvolvimento do giro dentado do hipocampo. Adicionalmente, culturas de fatias pode ser mantido durante até 4 semanas, e assim, permitir uma para estudar o processo de maturação de neurónios granulares-nascidos. Culturas de fatias para permitir a manipulação farmacológica eficaz de fatias de hipocampo, enquanto excluindo variáveis complexas, tais como as incertezas relativas à localização anatómica profunda do hipocampo, bem como a barreira de sangue do cérebro. Por estas razões, buscou-se otimizar culturas fatia organotypic especificamente para pesquisa neurogênese pós-natal.
Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais conformados com as orientações de saúde e bem-estar animal do Departamento de Medicina Comparativa da Universidade de Toronto.
1. Preparação de fatias do hipocampo
- Esterilizar os seguintes instrumentos usando o autoclave seco a 125 ° C: cabo de bisturi (# 3) (2), fórceps padrão standard, grande (1), Small dissector tesoura (dobrado para o outro) (1), Micro colher (colher e plana extremidades espátula) (1), Micro-espátulas (arredondados e extremidades arredondadas cônicos) (2), pincel fino (1), Fogo polido Pasteur pipeta (2), praças de gaze, 2 x 2 polegadas (5).
- Quando estéril, colocar os instrumentos em um recipiente estéril e manter coberto até o uso. Imediatamente antes da dissecação, mergulhe os instrumentos em uma solução de etanol a 70%.
- Prepara-se uma placa de cultura de 6 poços com inserção de cultura antes de iniciar o procedimento de dissecção por adição de 1 ml de meio de cultura / poço e armazenando a placa na incubadora a 35 ° C, umand 5% de CO 2.
2. Organizar instrumentos de dissecação em estéril de fluxo laminar
- Pulveriza-se a câmara de fluxo laminar com etanol a 70% e remover instrumentos esterilizados dissecção a partir de álcool. Permitir que os instrumentos para secar enquanto descansa em uma placa de Petri esterilizada para evitar o contato entre o álcool e o tecido do cérebro dissecado.
- Depósito 5-7 ml de solução de dissecação gelada esterilizados em 2 grandes placas de Petri estéreis. Um prato vai relaxar e limpar a cabeça (sujo), o outro para o resfriamento e enxaguar a esvaziado cérebro (limpo). Coloque um papel de filtro esterilizado numa das tampas de placas de Petri para dissecar o cérebro.
- Colocar uma pequena quantidade de papel de filtro, esterilizado em uma pequena tampa da caixa de Petri para dissecar o hipocampo. Depósito 3-5 ml de solução esterilizada dissecação gelada em 2 pequenos, placas de Petri estéreis. Um prato vai realizar o hipocampo escavado para fora, ninguém vai segurar seções durante a separação das secções do hipocampodissecção sob microscópio.
- Prepare o cortador de tecidos gravando um pedaço de papel de filtro esterilizado para a fase de corte e a montagem de uma lâmina de barbear estéril. Molhar o papel de filtro com solução de dissecação esterilizado.
- Spray de um bio-saco limpo com álcool e coloque-o em fluxo laminar bancada limpa.
3. Hippocampal Dissection
- Pulverizar o filhote de rato P7 Sprague Dawley com etanol 70% fora do fluxo laminar bancada limpa e rapidamente decapitar o animal usando grandes tesouras cirúrgicas estéreis dentro do banco de fluxo laminar. Deixe a cabeça cair na solução de dissecação gelada em uma das placas de Petri.
- Na placa de Petri, enxaguar o sangue e rapidamente transferir a cabeça para papel de filtro esterilizado, lado ventral para baixo.
- Usando o bisturi, cortar ao longo da superfície dorsal no plano sagital para expor o crânio subjacente. Cortar através da pele, mas não o osso subjacente, que é macio e facilmente penetrável em ratos de tsua idade. Separe este bisturi "sujo" e não usar em tecido cerebral.
- Usando as pequenas tesouras de dissecção (anguladas para o outro) e uma pinça, cortado o crânio ao longo da sutura sagital do crânio para bregma, o ponto na anatomia do crânio onde a sutura coronal é entrecortada perpendicularmente pela sutura sagital. Use uma pinça para puxar abas crânio para cima e longe da linha média do crânio.
- Coloque a colher micro no lado inferior do cérebro, por baixo do tronco cerebral, para levantar suavemente para fora do cérebro do crânio. Levante o cérebro para expor os nervos ópticos e bulbo olfatório na superfície basal do cérebro. Corte essas estruturas com uma tesoura pequena para separar totalmente o cérebro de crânio. Remover e transferir o cérebro intacto para o outro prato de Petri contendo solução grande dissecação gelada.
- Usando o micro colher, transferir o cérebro a uma tampa pequena placa de Petri contendo papel de filtro estéril. Com uma pipeta de Pasteur estéril, lavar o cérebro com algumas gotas de dissecting solução para manter o tecido úmido.
- Usando uma lâmina de bisturi "clean" cortar os dois hemisférios separados. Transfira o hemisfério esquerdo volta a grande placa de Petri com micro colher e coloque o lado pia hemisfério baixo na solução de dissecação gelada para posterior utilização.
- Ver a face medial do hemisfério direito e identificar o fornix borda, uma banda de destaque da matéria branca ao longo da borda medial do hipocampo. Usando um bisturi estéril, faça um corte sagital através do fundo de saco, mas tome cuidado, pois apenas 0,5 cm da ponta do bisturi vai ser suficiente para cortar o fundo de saco.
- Usando 2 micro-espátulas, remova o primeiro hipocampo do hemisfério direito, colocando a mão-espátula direita no tronco cerebral e levantando o córtex sobreposta com a espátula esquerdo. Suavemente levantar o córtex para revelar o ventrículo lateral e medial da superfície do hipocampo. A linha curva branca, a fímbria, agora deve estar visível.
- Alinhe a curvatura da espátula com a curvatura da fímbria e pressione suavemente a espátula sob a fímbria. Deslize a espátula esquerda e passeio ao longo do eixo rostral-caudal e levante espátula na direção dorsal para remover hipocampo.
- Transferir o hipocampo de uma 2ª pequena placa de Petri com solução de dissecção gelado. Repita o mesmo procedimento no hemisfério esquerdo para remover o hipocampo esquerdo.
- Usando uma espátula micro, transferir cuidadosamente o hipocampo para o palco cortador de tecidos. Dispor-los adjacentes e paralelos um ao outro e perpendiculares ao eixo da lâmina de helicóptero. Utilização de um pincel para posicionar o tecido e adição de algumas gotas de solução de dissecção no topo do hipocampos.
- Corte o tecido em 400 mm fatias sem parar para remover fatias individuais (geralmente eles não vão aderir à lâmina). Depois de todo o hipocampo foi cortado, use o pincel para transferir delicadamente as seções para a 2ª pequena placa de Petri com solução de dissecção.
- De acordo com anúncioissecting microscópio, separe cuidadosamente as fatias flutuante usando amicro-espátula e pincel.
- Remova a placa de cultura de pré-preparados com inserção de cultura do incubador e lugar numa câmara de fluxo laminar.
- Usando uma pipeta de Pasteur polida ao fogo, desenhar 4-5 fatias para a pipeta de transferência e fatias à superfície apical de membrana inserção de cultura. Em seguida, ajuste o posicionamento com um pincel e deixe espaço entre as seções individuais e da fronteira da inserção da cultura.
- Usando uma pipeta de Pasteur estéril, remover o excesso de solução de dissecação da superfície apical de membrana.
NOTA: Ao remover solução evitar desenhar cortes de tecido para a pipeta. Como alternativa, use uma pipeta regular (P200 ou P1000) com pontas de pipetas esterilizadas para remover lentamente solução. - Colocar a placa de cultura com meio de cultura contendo soro e as fatias de hipocampo de volta na incubadora a 35 ° C e 5% de CO 2.
NOTA: Se as chamadas experiênciapara a geração de culturas de vários animais, limpar completamente o fluxo laminar banco limpo entre dissecções. Retorno instrumentos para solução de álcool e substituir todas as placas de Petri, papéis de filtro e lâminas de barbear estéril, antes da segunda dissecção.
4. alimentação e manutenção de Organotípicas Slices
- Culturas para alimentação animal em um fluxo laminar estéril bancada limpa.
- Realize a primeira alimentação das seções de cultura dois dias pós-dissecção. Aspirar meio de cultura de idade que usa a pipeta de vidro esterilizado.
- Use estéreis 5 ml pipeta serológica para adicionar 1 ml de, meio contendo soro fresco, estéril aos poços.
- Gentilmente substituir a inserção da cultura e tomar cuidado para remover as bolhas de ar que podem ter se formado debaixo da superfície da membrana.
- Após a primeira alimentação, mudar meio todos os outros dias.
5. Incubar fatias de tecido com timidina Analogues para Label Newborn Neurônios
- A fim de estudara maturação e integração de células granulares do denteado do hipocampo, incubar as fatias organotípicas com um análogo da timidina, tal como bromodesoxiuridina (BrdU) ou Chlorodeoxyuridine (CldU). Aqui, nós utilizamos CldU devido à sua maior solubilidade em solução salina.
- Após 3DIV, adicionar 1 ml de / ml de solução concentrada CldU 10 mg em solução salina a 1 ml de meio de cultura para uma concentração final de 10 ug / ml. Se BrdU é usado, corrigir a concentração para as diferenças de peso molecular. Adicionar meio com CldU para poços de cultura e incuba-se o tecido com CldU contendo meio durante 2 horas a 35 ° C.
- Após 2 h de incubação a 35 ° C, remover o meio contendo CldU e substitua com meio de alimentação regular para retomar a programação de alimentação normal (descrito acima).
6. Os tecidos Fixation e Armazenamento
- Estabeleça um cronograma para a aplicação de tratamentos e fixação de amostras de tecido antes de iniciar experimentos de cultura (Figura 2B). <li> A um dia predeterminado pós-dissecação, preparar o seguinte numa hotte de laboratório: uma proveta de 10-50 ml contendo 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato salino (PBS); um copo vazio para o meio de cultura descartados; pequeno fórceps; e uma pipeta de 1000 ml com pontas descartáveis.
- Remova a placa de cultura (s) a partir de câmara de incubação e transferência para uma coifa. Inclinação das inserções individuais de placas bem com fórceps. Em seguida, utilizar uma pipeta para remover o meio de cultura e transferência para uma proveta de eliminação. Inclinar a placa de cultura a um ângulo para ajudar a garantir que todo o meio de cultura é removido.
- Concluir a remoção por meio de uma placa de cultura de cada vez. Ao meio foi removido, adicionar 1 ml de PFA 4% para cada poço de cultura e sele bem placa com parafilm. Repita o procedimento para o maior número de placas de cultura como placas necessárias e transferir para geladeira a 4 ° C, durante 24 horas.
- Após 24 horas, prepare o seguinte em um exaustor: 10-50 taça ml contendo 0,1% de azida de sódio em PBS; um vazioTaça por PFA descartado (siga as precauções de segurança ao descartar substâncias tóxicas); pequeno fórceps; e 1.000 ml pipeta com pontas descartáveis.
- Siga o procedimento descrito no ponto 6.4 para a adição de PFA, mas adicionar 1 ml de PBS com azida de sódio em vez disso. Uma vez terminada a transmissão, placas de poços de vedação para uso futuro por envolvimento bordas em parafilm e armazenar na geladeira a 4 ° C.
7. O corte do tecido por imuno-histoquímica
- Realizar tecido corte usando um vibratome. A seguinte série de passos ajudar a maximizar o rendimento de secções de tecido utilizáveis a partir de culturas organotípicas.
NOTA: Imediatamente após dissecação do hipocampo e plaqueamento das fatias, o tecido tem uma espessura de aproximadamente 400 um. No entanto, depois de 2-3 semanas na câmara de incubação, fatias de tecido começará a achatar, resultando numa espessura de secção final de 150-300 | im. - Prepare os seguintes itens para a seção de tecido cultivado: a # 11 bisturi blade e manusear, um prato de vidro Petri contendo PBS gelado, um micro-dissecação fórceps, e uma fase de corte vibratome limpa para montar tecido.
- Usar um bisturi para cuidadosamente cortada ao longo do perímetro da membrana inserção circular de modo que ele pode ser separado da carcaça inserção de plástico. Deixar um amplo espaço entre a fatia culta e o bisturi.
- Transferir a membrana inserção individual para uma placa de Petri contendo PBS. Após lavagem em PBS, utilize uma pinça para transferir a membrana para a fase de montagem vibratome.
- Em seguida, usar o bisturi para eliminar o excesso de membrana que envolve fatias cultivadas e cortar o excesso de material para criar bordas limpas. Este passo irá garantir a membrana é plana e pode aderir facilmente à superfície de corte.
- Colocar 1-2 gotas de adesivo sobre a fase de corte vibratome e espalhar em camada uniforme utilizando uma agulha 22 G. Espalhe adesiva em uma forma retangular com a borda longa paralela à lâmina de corte do vibratome. Execute esta etaparapidamente, para evitar que o adesivo de secagem.
- Use uma pinça para transferir a membrana aparadas contendo fatias do hipocampo para o estágio de corte e gentilmente posicionar a membrana na cola e garantir que não haja bolhas de ar.
- Como o superglue seca, transferir o palco vibratome com a membrana colada de volta para a PBS contendo placa de Petri. Prepare a lâmina vibratome e uma azida de sódio contendo 48 poços para armazenar seções do tecido.
- Use vibratome para gerar 30 mm secções do tecido fatia organotípicas e transferência para uma placa de 48 poços contendo azida de sódio para armazenamento e subsequente coloração imuno-histoquímica.
- Consulte os protocolos de imuno-histoquímica 26,29 coloração pré-existentes.
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Representative Results
Determinar se as culturas organotypic seria adequado para a investigação a neurogênese adulta necessário que preencham dois critérios principais: 1) que fatias manter características morfológicas características de fatias do hipocampo após 10-21 dias in vitro (DIV), e 2) que PED-nascidos pode ser quantificada utilizando técnicas de imuno-histoquímica padrão comumente empregados na pesquisa neurogênese adulta. Relativamente ao primeiro critério, a Figura 1A e 1B destacar a morfologia do hipocampo preservada. Traços característicos, como o giro denteado (DG), regiões CA1 e CA3 são facilmente identificáveis.
Em relação ao segundo critério, Figura 1C (painel superior) fornece uma amostra representativa de PED-nascidos que co-expressam o marcador endógeno neuronal, duplacortina (DCX) em verde e o análogo de timidina exógeno, 5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU) em vermelho. Estes neurónios estão localizados na sub-grzona anular do DG do hipocampo. A fim de assegurar a correta nascimento namoro de neurônios, identificamos CldU + núcleos que co-express DCX. A microscopia confocal é necessário nesta fase para identificar com sucesso neurónios dupla marcados porque as células de candidatos deve co-expressam o marcador de interesse ao longo do eixo Z da célula. Os dados da amostra obtida com tal rendimento de rotulagem dupla cerca de 17% das células CldU + que expressavam DCX e 35% de células CldU + que expressavam CaBP aos 12 dias após a aplicação CldU. O valor de DCX é muito semelhante ao passo que o valor CaBP é consideravelmente menor do que valor comparável obtido in vivo 26. Condições de cultura de tecidos pode ser responsável por uma percentagem relativamente baixa de células CABP +.
A Figura 2A apresenta os passos de dissecação, que procedem da esquerda para a direita (1-8): começando com a decapitação dos animais (1), remoção de cérebro (2), transferência de cérebro de solução gelada de dissecção (3), dissecarion de hipocampo de hemisférios esquerdo e direito (4), o armazenamento de hipocampos dissecados em solução dissecção gelado (5), a transferência de ambos os hipocampos para Stoelting cortador de tecido e corte em 400 mm (6), a separação de fatias individuais sob estereomicroscópio (7), e plaqueamento tecido em inserções de cultura de células (8). Procedendo-se desta maneira ajuda a manter um ambiente estéril, todo o processo de cultura.
Por último, uma vez que o curso a tempo de desenvolvimento é uma característica importante da neurogênese, optou-se incubar as fatias cultivadas com CldU para exatamente 2 horas após 3 DIV a etiqueta dividindo células-tronco neurais. A janela de tempo estreita para administração CldU foi escolhido para aumentar a probabilidade de que os neurónios rotulados constituída uma população homogénea de células em, aproximadamente, a mesma fase de maturação (Figura 2). Com relação à rotulagem CldU, uma característica crítica da neurogênese em função do hipocampo é que em um gitempo ven há uma população heterogênea de células granulares dentados em vários estágios de maturação 27,28.
Quadro 1. Amostra fotografias microscópio de fluorescência destacando preservada morfologia do hipocampo. (A) fatia Organotípicas a partir de 12 dias após a dissecção immunolabeled para CldU (verde) e CaBP (vermelho), 20x imagem composta de ar (Barra de escala = 500 mm). (B) micrografia Amostra de fatia de 21 dias após a dissecção immunolabeled para CldU ( vermelho) e DCX (verde) (cor-esquema oposto da figura 1A), 20x de ar (Scale bar = 100 mm). (C) O painel superior. Fotografia microscópio confocal Representante de células co-expressando ClXdU e marcador neuronal imaturo endógeno, DCX. PED co-expressando DCX (verde) e CldU (vermelha) são contadas como novos neurônios. A seta indica um double-labelevou celular em estágio inicial de desenvolvimento, 40X de imersão em óleo (Escala bar = 10 mm). Células comparáveis foram observados 10 dias de pós-marcação in vivo 26. Lower painel. Imagens fluorescentes representativos de células que co-expressam CldU (verde) e CaBP (vermelho). A seta indica uma célula de marcação dupla, 40X microfotograf ia de fluorescência (Barra de escala = 10 um). Giro DG-dentados. GCL-grânulo camada de células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. (A) Ilustração das etapas sequenciais para dissecação do hipocampo em fluxo laminar bancada limpa. A linha pontilhada indica (direita) zones "não esterilizadas" (à esquerda) e "estéreis" da área de dissecção. (B) Timeline para organoculturas fatia PVAc preparados a partir de filhotes de ratos P7 (start). Notações indicam aplicação de análogo da timidina, CldU *, e "tratamento", que podem incluir vários agentes farmacológicos adequados à questão experimental. As culturas são fixadas com paraformaldeído em tempos de parada desejados de aplicação CldU (Fix culturas). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do reagente / Equipamentos | Companhia | Número de Catálogo | Comentários / Descrição |
| 5-cloro-2'-desoxiuridina (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Perigosos, Carcinogenic |
| Cultura celular insere, em 30 mm de diâmetro, 0,4 um ptamanho minério | Thermo Scientific | 140660 | Nuclon revestimento delta sobre essas inserções proporciona melhor aderência tecidual e melhora a qualidade da fatia. |
| Cônico Centrífuga tubos (estéril) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tesoura de dissecção (angulado a lado) | Ferramentas Ciência Belas | 14082-09 | |
| Meio essencial mínimo (MEM) | Gibco | 11095; líquido | Armazenar a 4 ° C |
| Eclipse Ni-L microscópio fluorescente | Nikon | ||
| Cola para tecido | Krazy Glue | KG585 | Use quantidade mínima de cola para conseguir a adesão como qualquer tecido exposto a cola será inutilizável para IHC. |
| Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Armazenar a 4 ° C |
| O soro de cavalo inactivado pelo calor (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Faça 50 ml alíquotas e armazenar a -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Pipetas de vidro modificados (parte inferior da pipeta Pasteur removido e borda suavizada com Bunsen chama) | |||
| Prato de Petri (100 mm x 15 mm) e (60 mm x 15 mm) | Marca Fisher | FB0875712 e FB0875713A | |
| Lâminas de bisturi nº 11 | Ferramentas Ciência Belas | 10011-00 | |
| Cabo de bisturi # 3 | Ferramentas Ciência Belas | 10003-12 | |
| Pipettes sorológicos | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Fórceps padrão standard | Ferramentas Ciência Belas | 11000-12 | |
| Filtro de vácuo estéril | Thermo Scientific- | 565-0020 | |
| Tesoura Cirúrgica | Ferramentas Ciência Belas | 14054-13 | |
| Seringa conduzido unidade de filtro | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Cortador de tecidos com palco móvel | Stoelting | 51425 | |
| Pincel de ponta fina |
Tabela 1. insumos e reagentes
| Solução | Ingredientes e Instruções |
| Solução Dissection | a) 500 ml de Hank &# 39; s solução salina equilibrada (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) Adicionar 2,2 g de D-glucose. | |
| c) Adicionar 0,5 g de sacarose. | |
| d) Adicionar 1,787 g HEPES. | |
| e) Mistura-se durante 30 min com placa de agitação magnética. | |
| f) A utilização do medidor de pH para garantir solução tem um pH final = 7,4. | |
| g) Utilize osmômetro para garantir osmolaridade final = 320-330 mOsm. | |
| h) Esterilizar em solução estéril de fluxo laminar utilizando filtração sob vácuo através de filtro de 0,2 um. | |
| Contendo soro de meio de cultura: 100 mL de Meio Essencial Mínimo (MEM) (Gibco 11095), 50 ml de soro de cavalo (Gibco 16050-122), 50 ml de HBSS. | a) Adicionar o seguinte para 50 ml de HBSS em copo e dissolver em 37 ° C num banho de água. Misturar com um agitador magnético. |
| b) 1,3 g de D-glucose. | |
| c) 36 mg de MgSO4. | |
| d) O ácido ascórbico 17,6 mg. | |
| e) 5 mL de solução 2M CaCl 2 estoque. | |
| f) Adicionar 50 ul Antibiótico-antimicótico (100x estoque, estéril; Gibco 15140-062). | |
| g) 1 ug / ml de insulina. | |
| h) Esterilizar por filtração a solução acima através de um filtro de 0,2 um. | |
| i) mistura de solução filtrada com 100 ml de MEM e 50 ml de soro de cavalo em câmara de fluxo laminar. | |
| j) Faça alíquotas de 50 ml em tubos de centrífuga cônicos estéreis (Fisher Scientific-14-432-22) e armazenar a 4 ° C. | |
| Solução de paraformaldeído a 4% fixativo. | a) Preparar tampão fosfato salino (PBS), adicionando o seguinte a 300 ml de H2O destilada e mistura na placa de agitação magnética. |
| b) Adicionar 2,7 g de fosfato de sódio monobásico (NaH 2 PO 4). | |
| c) Adicionar 11,5 g de sódio phosphate dibásico (NaHPO4). | |
| d) Adicionar 9,0 g de cloreto de sódio (NaCl). | |
| e) Aquecer aprox. 700 ml de H2O destilada a 55 ° C e desligue o fogo. | |
| f) Adicionar 40 g de paraformaldeído (PFA) e agitar em 700 ml de água usando placa de agitação magnética. | |
| g) Combina-se o PBS (a, b, c, d) e PFA (e, f) soluções, ajustar o pH a 7,4 e superior até ao volume final de 1000 ml. | |
| 0,1% de Azida de sódio Solução | a) Adicionar 1 g de azida de sódio em pó (NaN3) a 1 L de solução de PBS. |
| b) Mix usando placa de agitação magnética e armazenar a 4 ° C. |
Tabela 2. Soluções e Receitas
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Discussion
Seguindo CldU (ou BrdU) a administração, o calendário de aplicação de agentes farmacológicos podem ser escolhidas como alvo para PED-nascidos durante janelas específicas do desenvolvimento. Por exemplo, um agente hipotético pode ser aplicada durante a segunda semana pós-injecção CldU, o que é proposto para coincidir com a idade de neurónios imaturos que se encontram numa fase de desenvolvimento em que o GABA é despolarizantes. Estudos futuros utilizando este protocolo poderá adaptar o agente farmacológico e a janela de exposição para "alfaiate" a abordagem à questão experimental específica de interesse.
Um critério importante para determinar que as culturas fatia são um modelo válido para a investigação neurogênese pós-natal é a capacidade de manchar e quantificar novos neurônios no hipocampo. As duas principais conclusões de apoio a esta hipótese fosse que a análise microscópica revelou reatividade imuno-histoquímico para CldU e marcadores de proteínas endógenas nos mesmos neurônios.Quando utilizado em combinação com marcadores neuronais endógenos, análogos de timidina, tais como BrdU e CldU são poderosas ferramentas para a pesquisa neurogenesis.
A aplicação de análogos de timidina, tais como BrdU, através de injecções intraperitoneais é vulgarmente utilizado em investigação neurogénese para neurónios submetidos a etiqueta da fase S da mitose 29. Abordagens semelhantes podem ser empregues em culturas organotípicas com certas modificações. Por exemplo, estudos anteriores administrado BrdU (0,5 uM, durante 3 dias) para cortar as culturas após 18 ~ 14 DIV. Revendo os dados apresentados nesse documento revela que algumas das métricas utilizadas para quantificar a neurogénese não empregam as técnicas convencionais utilizadas no campo neurogénese, ou seja, a quantificação da estereologia 30. Por exemplo, quando relatar a co-expressão de BrdU e Neuronal-núcleos (NeuN) células positivas, que indicam um número total de células "por cultura" em vez de fornecer informarção sobre a área de tecido ou volume.
Estudos subsequentes melhorou neste método seccionando as fatias cultivadas a cada 10 mm seções, o que melhorou protocolos de visualização e imunohistoquímica, permitindo que os anticorpos a permear mais facilmente as amostras de tecido 31. 28 Bunk et al. Relataram a dupla marcação com BrdU (10 mm para 3 dias) como o número de células co-marcado por seção 10 mm, mas não forneceu informações sobre a área ou região do hipocampo comparativo específico estudado ou seja, CA1, CA3 ou DG. Além disso, a análise das imagens de microscopia confocal de fluorescência e não forma convincente que a morfologia do hipocampo foi mantida com sucesso.
É importante notar que ambos os estudos utilizado um período de exposição de BrdU de 3 dias, o que tem desvantagens associadas. BrdU foi muito auxiliado estudos neurogênese, permitindo que os investigadores para rastrear células recém divididas em various regiões do cérebro. No entanto, a toxicidade BrdU tem também sido bem caracterizado. Seu uso tem sido mostrado para causar anormalidades morfológicas e comportamentais 32,33 e os efeitos negativos sobre o ciclo celular, diferenciação, migração e sobrevivência das células-tronco neurais 34-36. A administração prolongada de BrdU nos estudos anteriormente mencionados podem ter introduzido variáveis interferentes que alteravam a fisiologia do hipocampo e ao mesmo tempo alguns efeitos secundários da administração de BrdU pode ser inevitável, o nosso protocolo experimental foi concebido para limitar a algumas destas complicações por incubação do tecido com análogos da timidina para 2 hr. Além disso, optamos por utilizar CldU em vez de BrdU porque mostrou melhor solubilidade do que BrdU ao preparar a solução de incubação. Embora o protocolo de três dias pode ser útil para certos modelos experimentais, por exemplo, maximizar a marcação das células em proliferação, este protocolo hr 2 tem uma vantagem de pulso-marcação de um relativamente pequeno população de células que podem ser estudadas em tempos de sobrevivência desejados (ver Figura 2B).
Ao comparar o nível de produção neuronal segundo dois métodos diferentes de aplicação BrdU, Namba et al. Dado um importante contributo para técnicas de rotulagem em culturas fatia organotypic 37. Os autores intraperitoneal comparação (IP) de injecção de BrdU (50 mg / kg) no dia 5 (P5) ratos pós-natais com culturas in vitro que receberam meio de cultura contendo 1 uM de BrdU durante 30 min imediatamente após o explante do tecido. Eles relatam diferença estatística significativa entre as in-vivo e in vitro injeção cedo BrdU em tecido cultivado. Os autores não apresentar imagens claras que definem a estrutura do hipocampo, mas eles relatam immunoreactivity BrdU como porcentagens do total de células na camada de células granulares. Enquanto eles empregam contagem estereológica, proporcionando uma medida por área ou volume seria valioso. Em geral, Os estudos citados apresentam culturas organotypic como um minucioso detalhamento de pós-natais culturas fatia do hipocampo, com aplicações para o estudo da neurogênese e perturbações farmacológicos. Usando esta técnica, fatias do hipocampo pode ser mantida durante até 21 dias in vitro (DIV) e drogas pode ser adicionado ao meio em qualquer ponto durante o período de cultura para estudar o efeito sobre a neurogénese.
Nosso objetivo foi identificar uma população discreta, relativamente homogêneo de PED, fornecendo uma breve aplicação 'pulso' de CldU para 2 horas. Uma estratégia comumente empregado para estudar a neurogênese envolve a identificação do estágio de maturação de um neurônio via coloração imuno-histoquímica para vários marcadores endógenos, com um análogo da timidina. A microscopia confocal de fluorescência e confirmou a presença de núcleos que incorporaram os CldU análogos de timidina e, por conseguinte, foram submetidos activamente mitose durante o período de cultura. A Figura 2 in vivo podem ser adaptadas para cultura de lâminas.
Especificamente, um método vulgarmente utilizado em investigação neurogénese da realização da coloração imuno-histoquímica para a proteína do microtúbulo associado, DCX, que é predominantemente expressa em neurónios imaturos a partir do dia 3-21 e o marcador neuronal madura, Calbindina (CaBP), que se expressa plenamente seguinte 28 dias pós-mitose. O fenótipo das células CldU + foi determinada usando estes marcadores 26 endógeno.
Métodos melhorados para manter culturas fatia para períodos mais longos pode ter a vantagem adicional de permitir mais CldU + neurônios para alcançar a maturidade, CaBP + palco. Actualmente, uma limitação da abordagem de cultura organotípica é que o tecido está a mudar continuamente durante o período de cultura. Por exemplo, imediatamente após a dissecação do hipocampo e chapeamento de fatias, a tissue tem uma largura de aproximadamente 400 mm. No entanto, depois de 2-3 semanas na câmara de incubação, fatias de tecido começará a fina, o que resulta numa largura final entre 250-350 mM. Isto limita a quantidade de tecido que pode ser utilizado para imuno-histoquímica e deve ser considerado quando se planear quantos animais a ser usado para um projecto. Experimentos adicionais irá ajudar a caracterizar as alterações funcionais na fisiologia do hipocampo que ocorrem in vitro.
O protocolo para o corte e coloração fatias de hipocampo foi desenvolvido para analisar as alterações celulares e morfológicas que ocorrem durante o período de cultivo. Culturas fatia proporcionar uma oportunidade para testar o efeito de vários agentes farmacológicos como PED hipocampo passam por diferentes estágios de desenvolvimento durante a maturação e representam uma valiosa ferramenta para estudos futuros neurogênese adulta.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
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