Summary
Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.
Abstract
Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak kemirgen beyin hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Gelişmekte olan hipokamp kıvrımlarının farmakolojik maddelerin doğrudan uygulanmasını sağlayan, bu yöntem, hipokampus karakteristik topografik morfolojisini muhafaza eder. Buna ek olarak, dilim kültürlerinin kadar, 4 hafta boyunca muhafaza edilebilir ve böylece, tek bir yeni doğmuş granül nöronların olgunlaşma sürecini çalışma sağlar. Karmaşık değişkenler hariç ederken Dilim kültürleri gibi hipokampus derin anatomik konumu yanı sıra, kan beyin bariyerinin ilgili belirsizlikler gibi hipokampal dilim verimli farmakolojik manipülasyon için izin verir. Bu nedenlerden dolayı, doğum sonrası nöron araştırma için özel Organotipik dilim kültürlerinin optimize etmek için çalışmıştır.
Protocol
NOT: Tüm hayvan prosedürleri Toronto Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Anabilim hayvan sağlığı ve refahı kurallarına uyduğu.
Hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.
- 125 ° C'de kuru otoklav kullanarak aşağıdaki aletleri sterilize: Neşter kolu (# 3) (2), Standart desen forseps, büyük (1), Küçük disektör makas (yan açılı) (1), Mikro kaşık (kaşık ve düz spatula uçları) (1), yuvarlak Mikro-spatula (ve konik uçları yuvarlatılmış) (2), İnce fırça (1), Yangın parlatılmış Pasteur pipeti (2), tül kareler, 2 x 2 inç (5).
- Ne zaman steril, steril bir kap içine koyun ve aletleri kullanıma kadar kapalı tutun. Hemen diseksiyon önce% 70'lik bir etanol çözeltisi içinde aletleri bırakın.
- 35 ° C a kuvöz plaka de / kültür ortamı, 1 ml ilave edilmesi ve depolanması ile diseksiyon işlemine başlamadan önce, bir kültür olarak yerleştirilmiş bir 6-yuvalı kültür plakası hazırlayınnd% 5 CO 2.
2. Steril Laminer Akış kaputu Diseksiyon Araçlar düzenleyin
- % 70 etanol ile laminer akış kaputu Sprey ve alkolden sterilize diseksiyon aletleri çıkarın. Steril Petri kabı üzerinde duran alkol ve disseke beyin dokusu arasındaki teması önlemek için ise araçlar kurumasını bekleyin.
- 2 büyük steril Petri kapları içinde steril, buz gibi soğuk kesme çözeltisi Deposit 5-7 mi. Bir tabak soğuk ve kafa (kirli), soğutma ve scooped beyin (temiz) durulama için diğerini temizler. Beyin dışarı Anatomi için Petri kabı kapaklarının birinde steril filtre kağıdı yerleştirin.
- Hipokampus diseksiyon küçük Petri kabı kapağının birinde küçük, sterilize filtre kağıdı yerleştirin. 2 küçük steril Petri kapları içinde sterilize buz soğukluğunda kesme çözeltisi Deposit 3-5 mi. Bir çanak, bir hipokampal bölümlere ayrılması sırasında bölümleri yapacak, scooped hipokampus yapacakdiseksiyon mikroskop altında.
- Kesme aşamasına steril filtre kağıdı parçası ölçme ve steril bir traş makinesi bıçak ağzı tarafından, doku kesicisi hazırlayın. Sterilize diseksiyon çözümü ile filtre kağıdı ıslatın.
- Alkol ile temiz bir biyo-çanta Sprey ve laminer akış temiz tezgah yerleştirin.
3. Hipokampal Diseksiyon
- Laminer akımlı temiz tezgah dışında% 70 etanol ile P7 Sprague Dawley sıçan yavru Sprey ve hızlı bir şekilde laminer akış tezgah içinde büyük steril cerrahi makas kullanarak hayvan başını kesmek. Baş Petri yemekleri biri buz gibi soğuk diseksiyon çözüm içine bırakalım.
- Petri kabındaki, kan durulayın ve hızlı bir şekilde aşağı sterilize filtre kağıdına kafa, ventral tarafı aktarmak.
- Sagital düzlemde dorsal yüzeyi boyunca kesilmiş neşter kullanarak altta yatan kafatası ortaya çıkarmak. Yumuşak ve t sıçanlarda kolayca nüfuz altta yatan kemik, deri yoluyla kesin değilOnun yaşı. Kenara bu "kirli" neşter ayarlayın ve beyin dokusu üzerinde kullanmayın.
- Küçük disektör (yan açılı) makas ve forseps kullanarak, bregmaya kafatası sagital sütür boyunca koronal sütür sagital sütür ile dik kesişen kafatası üzerinde anatomik nokta kafatasını açık kesti. Kafatasının orta hattan yukarı ve uzağa kafatası kanatları çekmek için forseps kullanın.
- Yavaşça kafatasının dışında beyin kaldırmak için, beyin sapı altındaki beynin alt, mikro kaşık yerleştirin. Beynin bazal yüzeyinde optik sinirler ve koku ampul maruz beyin kaldırın. Tam kafatası beyin ayırmak için küçük makas ile bu yapıları kesin. Çıkarın ve buz soğukluğunda bir kesme çözeltisini ihtiva eden başka bir büyük bir Petri tabağına sağlam beyin aktarın.
- Mikro kaşık kullanarak, steril filtre kağıdı içeren küçük bir Petri-çanak kapak beyin aktarın. Steril bir Pasteur pipeti ile dis birkaç damla ile beyin durulayınçözüm secting doku nemli tutmak için.
- "Temiz" neşter bıçak kullanarak arayla iki hemisfer kesti. Mikro kaşıkla büyük Petri kabı sol arka yarımkürede aktarın ve sonraki kullanım için buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisi içinde aşağı yarımkürede pia tarafı yerleştirin.
- Sağ hemisfer medial yüzünü görüntüleyin ve kenar forniksinin, hipokampusun medial kenarı boyunca beyaz cevher önemli bir bant tespit. Steril bir neşter kullanarak, forniksten aracılığıyla bir sagital kesim yapmak, ancak neşter ucu sadece 0,5 cm forniksinin kesmek için yeterli olacaktır, çünkü dikkat çekmek.
- 2 mikro-spatula kullanarak, beyin sapı üzerinde sağ-spatula yerleştirerek ve sol spatula ile örten korteks kaldırarak sağ hemisfer ilk hipokampus çıkarın. Yavaşça hipokampus lateral ventrikül ve medial yüzeyi ortaya çıkarmak için korteks kaldırın. Beyaz eğri çizgi, Fimbria, şimdi görünür olmalıdır.
- Curva ile spatula eğrilik hizalayınfimbrial Ture ve yavaşça fimbrial altında spatula basın. Sol spatula kaydırın ve rostral-kaudal ekseni boyunca binmek ve daha sonra hipokampus çıkarmak için dorsal yönde spatula kaldırın.
- Buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisi ile bir 2. küçük Petri kabı hipokampus aktarın. Sol hipokampus kaldırmak için sol yarımkürede aynı işlemi tekrarlayın.
- Bir mikro spatula kullanarak, dikkatle doku kıyıcı aşamasına hippocampi aktarın. Kıyıcı bıçak eksenine birbirine dik bunları bitişik ve paralel düzenlemek. Doku konumuna Hipokampuslardan ve üst kesme solüsyonu ve bir kaç damla eklemek için bir fırça kullanılır.
- Bireysel dilimleri kaldırmak için duraklamadan 400 mikron dilimleri doku kesin (genellikle bıçak uygun olmaz). Bütün hipokamp kesilmiş sonra, yavaşça diseksiyon çözeltisi ile 2. küçük bir Petri tabağına bölümleri aktarmak için fırça kullanılır.
- Reklamın altındamikroskop issecting, dikkatle amicro-spatula ve fırça kullanarak kayan dilimleri ayırmak.
- Bir laminar akış başlığı içinde kuluçka ve yerine kültür girişi ile önceden hazırlanmış bir kültür tabağı çıkarın.
- Bir yangın cilalı Pasteur pipet kullanarak, kültür insert membran apikal yüzeye pipet ve transfer dilimler halinde 4-5 dilim çizin. Sonraki, bir fırça ile konumlandırma ayarlayın ve bireysel bölümlere ve kültür insert sınırında arasında boşluk bırakın.
- Steril bir Pasteur pipeti kullanılarak, zarın tepe yüzey aşırı kesme uzaklaştırın.
NOT: pipet içine doku bölümleri çizim çözüm kaçınınız çıkarırken. Alternatif olarak, yavaş yavaş çözüm kaldırmak için sterilize pipet uçları ile düzenli pipet (P200 veya P1000) kullanın. - Serum içeren kültür ortamı ile, 35 ° C'de tekrar inkübatör içine hipokampal dilimler ve% 5 CO2 ile birlikte kültür plakası yerleştirin.
NOT: Deney aramaları durumundaBirden hayvanlardan kültürleri üretmek için, iyice diseksiyonların arasındaki laminer akış temiz tezgah temizleyin. Alkol çözüm araçları dönün ve tüm Petri-yemekleri, filtre kağıtları ve ikinci diseksiyon öncesinde steril Jilet değiştirin.
4. Beslenme ve Organotipik Dilimleri bakımı
- Steril bir laminer akımlı temiz tezgah Yem kültürleri.
- Kültürlü bölümlerde 2 gün sonrası diseksiyon ilk beslenmesini yapın. Steril cam pipet kullanarak aspire eski kültür ortamı.
- Çukurlara, taze, steril, serum ihtiva eden ortamda 1 ml eklemek için 5 ml steril serolojik pipet kullanın.
- Yavaşça kültür yuvasını yerine ve membran yüzeyinde altında oluşmuş olabilecek herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için özen gösterin.
- İlk besleme sonra, her gün orta değiştirin.
Timidin Analoglarının 5. Enkübe Doku Dilimleri Yenidoğan Nöronlar Etiket için
- Incelemek için,olgunlaşma ve hipokampus dentat granül hücrelerin entegrasyonu Bromodoksiüridin (BrdU) veya Chlorodeoxyuridine (CldU) gibi bir timidin analoğu olan Organotipik dilimleri inkübe edin. Burada, çünkü tuzlu su içinde daha yüksek çözünürlüğe sahip CldU kullanır.
- 3DIV sonra, 10 ug / ml'lik bir son konsantrasyon için, kültür ortamı içinde 1 ml tuzlu su içinde 10 mg / ml CldU stok çözeltisi 1 ul ekle. BrdU kullanılırsa, molekül ağırlığı farklılıkları konsantrasyonu düzeltin. Kültür çukurlarına CldU ile ortamı ilave edin ve 35 ° C'de 2 saat boyunca ortam CldU-içeren doku inkübe edin.
- 35 ° C'de inkübasyon 2 saat sonra, CldU içeren orta kaldırmak ve (aşağıda belirtilmiştir), normal beslenme programı devam etmek için düzenli olarak besleme ortamı ile değiştirin.
6. Doku Fiksasyon ve Depolama
- Tedavileri uygulayarak ve kültür deneyleri (Şekil 2B) başlamadan önce doku örnekleri sabitlemek için bir zaman çizelgesi oluşturulması. <önceden tespit edilmiş bir gün sonraki diseksiyon Li>, bir laboratuar bir davlumbaz aşağıdaki hazırlamak: 10-50 ml'lik beher cam, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ihtiva etmektedir; atılan kültür ortamı için boş bir beher; küçük forseps; tek kullanımlık uçları olan ve 1.000 ml'lik pipet.
- Davlumbaz için kuluçka odası ve transfer kültür plakası (ler) sökün. Forseps ile bireysel kuyu plaka ekler eğin. Sonraki, bir bertaraf beher kültür ortamı ve transferi kaldırmak için bir pipet kullanın. Tüm kültür ortamı çıkarılır emin olmak için bir açıyla kültürü plakası yatırın.
- Bir seferde bir kültür plaka için ortamı çıkarmadan bitirin. Orta kaldırıldığında, her bir kültür için% 4 PFA 1 ml ekleyin ve iyice parafilm plaka sızdırmaz. 24 saat süre ile 4 ° C'de bir buzdolabı için gerekli ve aktarma levhaları kadar kültür plakaları için tekrarlayın.
- 24 saat sonra, bir çeker ocak içinde, aşağıdaki hazırlama: 10-50 PBS içinde% 0.1 sodyum azid ihtiva eden mi beher; Boşatılan PFA (toksik maddelerin imha ederken güvenlik önlemlerine uyun) için beher; küçük forseps; tek kullanımlık uçları olan ve 1.000 ml pipet.
- PFA eklemek için 6.4 özetlenen prosedürü uygulayın, ancak bunun yerine sodyumazid ile PBS 1 ml ekleyin. Bir kez tamamen parafilm kenarları sarılması ve 4 ° C'de buzdolabında muhafaza gelecekteki kullanım için, sızdırmaz kuyucuğu aktarılır.
7. İmmünohistokimya için Doku Kesit
- Bir vibratome kullanarak kesit doku gerçekleştirin. adımlar aşağıdaki serisi organotipik kültürlerden kullanılabilir doku kesitlerinin verimi üst düzeye çıkarmanıza yardımcı.
Not: hemen hipokampal diseksiyon ve dilimlerin kaplama ardından doku yaklaşık 400 um'lik bir kalınlığa sahiptir. Bununla birlikte, inkübasyon odasında 2-3 hafta sonra doku dilimleri 150-300 um'lik bir son kısmı kalınlığı ile sonuçlanarak, düzleştirmek başlayacaktır. - Bölüm kültürlü dokuya aşağıdaki öğeleri hazırlayın: # 11 neşter bLade ve idare, doku monte buz soğuk PBS, bir mikro-diseksiyonu forseps ve temiz bir vibratome kesme aşamasını içeren bir cam Petri.
- Plastik uç gövdesinden ayrılmış, böylece bir neşter kullanarak dikkatli bir şekilde dairesel uç zarın çevresi boyunca kesmek için kullanılır. Kültürlü dilim ve neşter arasındaki geniş boşluk bırakın.
- PBS içeren bir petri tabağına konulacak ve müstakil uç membran aktarın. PBS ile durulandıktan sonra vibratome montaj aşamasına membran aktarmak için forseps kullanır.
- Sonraki, kültürlü dilimleri çevreleyen membran aşırı ortadan kaldırmak ve temiz kenarları oluşturmak için fazla malzeme kesip neşter kullanın. Membran sağlayacak bu adım, düz ve kolayca kesme yüzeyine yapışabilir.
- Vibratome kesme sahnede yapışkan 1-2 damla koyun ve hatta 22 G iğne kullanılarak katmanda yayıldı. Vibratome kesme bıçağının uzun kenar paralel bir dikdörtgen şekil yapıştırıcıyı yayıldı. Bu adımı gerçekleştirinhızlı bir şekilde, kurutma yapıştırıcıyı önler.
- Kesme aşamasına hipokampal dilimleri içeren kesilmiş membran aktarmak ve yavaşça tutkal membran konumlandırmak ve hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olmak için forseps kullanın.
- Süper yapıştırıcı kurudukça geri içeren PBS Petri kabı yapıştırılmış membran ile vibratome aşamasına aktarılır. Vibratome bıçak ve doku bölümleri depolamak için bir 48 oyuklu plaka ihtiva eden sodyum azid hazırlayın.
- Depolama ve daha sonra immünohistokimyasal boyanması için bir 48 oyuklu plaka içeren sodyum azide Organotipik dilim doku ve transferin 30 um bölümler oluşturmak için vibratome kullanın.
- Immünohistokimyasal boyama 26,29 için protokolleri mevcut önceden başvurun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1) dilimleri, in vitro olarak 10-21 gün sonra (DIV), sonra hipokampal dilimler karakteristik morfolojik özelliklerini korumak ve 2) yenidoğan KEGM sayısal edilebilir: Organotipik kültürler yetişkin nöron araştırma için uygun olacağını belirlemek iki ana kriterlerine uygun olması gerekmektedir erişkin nöron araştırma kullanılan standart immünohistokimyasal teknikler kullanılarak. İlk kriter ilgili olarak, Şekil 1A ve 1B korunmuş hipokampal morfolojisi vurgulayın. Böyle kıvrımlarının (DG) gibi karakteristik özellikler, CA1 ve CA3 bölgeleri kolayca tanımlanabilir.
İkinci bir kriter ile ilgili olarak, Şekil 1C (üst panel) yenidoğan KEGM yeşil endojen nöronal işaretleyici doublekortin (DCX) ve dış timidin analogu, 5-Kloro-2'-deoksiüridin (CldU) eş ifade eden bir temsili örneği sağlar kırmızı. Bu nöronlar alt gr bulunurhipokampal Genel Müdürlüğü anular bölge. Nöronların doğru doğum kalma sağlamak amacıyla, DCX-ekspres birlikte CldU + çekirdekleri tanımlar. Mikroskopisi aday hücreleri hücre Z-ekseni boyunca ilgi işaretleyici işbirliği ifade etmeliyim, çünkü başarılı çift etiketli nöronlar tanımlamak için bu aşamada gereklidir. Örnek veriler, çift etiketleme verimle DCX ve CldU uygulamasından sonra 12 gün CaBP ifade CldU + hücrelerinin oranı% 35 olarak ifade CldU + hücreleri, yaklaşık% 17 oranında elde edilmiştir. CaBP değeri in vivo 26 'de elde edilen benzer şekil çok daha düşük ise DCX değeri çok benzer. Standart doku kültürü koşulları CaBP + hücrelerinin nispeten düşük bir oranda sorumlu olabilir.
Şekil 2A sağa (1-8) soldan devam diseksiyon adımları sunar: hayvan Dekapitasyon ile (2), beynin transfer buz gibi soğuk diseksiyon solüsyonu (3) beyin (1), kaldırma başlayan, teşrihHipokampüsün iyon sol ve disseke Hipokampuslardan sağ hemisfer (4), depolama buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisi içinde (5), Stoelting doku kıyıcı hem Hipokampuslardan transferi ve diseksiyon mikroskop altında bireysel dilim 400 mikron (6), seperasyonunda kesit Hücre kültürü ekler üzerinde (7) ve kaplama doku (8). Bu şekilde işlem yapılarak, kültür işlemi boyunca steril bir ortamın oluşturulmasına yardımcı olur.
Kalkınma zamanı ders hipokampal nöron önemli bir özelliği olduğundan Son olarak, biz tam 2 saat etiket DIV 3 sonra nöral kök hücrelerin bölünmesi için CldU ile kültür dilimleri inkübe seçti. CldU uygulama için dar bir zaman penceresi nöronlar homojen bir hücreler popülasyonu yaklaşık olarak aynı olgunlaşma aşamasına (Şekil 2) oluşturan etiketli olasılığını arttırmak için seçildi. CldU etiketleme ile ilgili olarak, hipokampus fonksiyonu nöron bir kritik özelliği gi de olduğunuven zaman çeşitli olgunlaşma aşamalarında 27,28 de dentat granül hücrelerinin heterojen bir nüfus var.
Şekil 1. Örnek floresan mikroskop fotoğrafları hipokampal morfolojisi korunmuş vurgulayarak. CldU (yeşil) ve CaBP (kırmızı), 20x hava kompozit görüntü için immunolabeled 12 gün sonrası diseksiyonu (A) Organotipik dilim (Ölçek çubuğu = 500 mikron) 21 gün dilim. (B) Numune mikrografıdır CldU için immunolabeled diseksiyonu (sonrası kırmızı) ve DCX (yeşil) Şekil 1A (zıt renk düzeni), 20x hava (Ölçek çubuğu = 100 mikron). (C) Üst panel. Hücrelerin Temsilcisi konfokal mikroskop fotoğraf birlikte ifade ClXdU ve endojen olgunlaşmamış nöronal işaretleyici, DCX. KEGM birlikte ifade DCX (yeşil) ve CldU (kırmızı) yenidoğan nöronlar olarak sayılır. Ok çift Labe gösterirgeliştirme, 40X yağ daldırma (Ölçek çubuğu = 10 mikron) erken aşamada hücre açtı. Karşılaştırılabilir hücreler in vivo 26 10 Al gün sonrası etiketleme gözlenmiştir. Alt paneli. Hücrelerin Örnek floresan görüntüler birlikte sentezleyen CldU (yeşil) ve CaBP (kırmızı). Ok çift etiketli hücre, 40X floresan mikrograf (Ölçek çubuğu = 10 mikron) gösterir. DG-dentat girus. GCL-granül hücre tabakası. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Laminer akımlı temiz tezgah hipokampal diseksiyon için sıralı adımlar Şekil 2. (A) İllüstrasyon. Noktalı çizgi diseksiyonu alan "steril olmayan" (sol) ve "steril" (sağ) bölgeleri gösterir. Organo için (B) TimelineP7 sıçan yavrularında (başlangıç) hazırlanan typic dilim kültürleri. Gösterimler timidin analog, CldU *, ve deneysel soruya uygun çeşitli farmakolojik ajanlar içerebilir "tedavi" uygulamasını göstermektedir. Kültürler CldU uygulaması (Kültürler Fix) istenen bekleme zamanlarda paraformaldehid ile sabitlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Reaktif / Ekipman Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar / Açıklama |
| 5-kloro-2'-deoksiüridin (CldU) | MP Biomedicals | 105.478 | Tehlikeli, Kanserojen |
| Hücre kültürü, 30 mm çap, 0.4 um, s eklercevher boyut | Bilimsel Termo | 140.660 | Bu ekler üzerinde Nuclon delta kaplama daha iyi doku yapışmasını sağlar ve dilim kalitesini artırır. |
| Konik Santrifüj tüpleri (steril) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Disektörü makas (yan açılı) | Güzel Bilim Araçları | 14082-09 | |
| En az temel ortam (MEM) | Gıbco | 11.095; sıvı | Mağaza 4 ° C |
| Eclipse Ni-U floresan mikroskop | Nikon | ||
| Doku yapıştırıcısı | Krazy Tutkal | KG585 | Tutkal maruz herhangi bir doku İHK için kullanılamaz olacak gibi yapışmasını sağlamak için tutkal az miktarda kullanın. |
| Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (500 mi) | Gıbco | 14025-092 | Mağaza 4 ° C |
| At Serumu Isı İnaktive (500 mi) | Gıbco | 16050-122 | -20 ° C'de 50 ml lik kısımlar halinde ve mağaza olun |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modifiye cam pipetler (Bunsen alev düzeltti Pasteur pipeti çıkarıldı ve kenar alt) | |||
| Petri kabının (100 mm x 15 mm) ve (60 mm x 15 mm) | Fisher Marka | FB0875712 ve FB0875713A | |
| Bisturi bıçakları 11. | Güzel Bilim Araçları | 10011-00 | |
| Neşter kolu # 3 | Güzel Bilim Araçları | 10003-12 | |
| Serolojik Pipetler | Sorfa Medikal Plastik A.Ş. | P8050 | |
| Standart Desen forseps | Güzel Bilim Araçları | 11000-12 | |
| Steril vakumlu filtre | Thermo-Bilimsel | 565-0020 | |
| Cerrahi makaslar | Güzel Bilim Araçları | 14054-13 | |
| Şırınga tahrik filtre ünitesi | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Hareketli evre Doku kıyıcı | Stoelting | 51.425 | |
| Ince uçlu fırça |
Tablo 1. Malzemeleri ve Reaktifler
| Çözüm | Malzemeler ve Talimatlar |
| Diseksiyon çözüm | Hank a) 500 ml# 39 a ait Dengelendirilmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) 2.2 gr, D-glikoz eklenmektedir. | |
| c) 0.5 gr Sukroz eklenir. | |
| d) 1,787 gr HEPES ekleyin. | |
| e) manyetik bir karıştırma plakası ile 30 dakika için karıştırın. | |
| çözelti sağlamak için F) pH metre 7.4 = nihai pH'a sahiptir. | |
| g) Nihai osmolalite = 320-330 mOsm sağlamak için osmometre kullanın. | |
| h) 0.2 um'lik bir filtreden vakumla süzme kullanılarak steril bir laminer akış başlığı içinde çözelti sterilize edin. | |
| Serum ihtiva eden kültür ortamı: 100 ml Minimum Esansiyel Medium (MEM) (Gibco 11095), 50 mi at serumu (Gibco 16050-122), 50 mL HBSS. | a) bir beher içinde, 50 ml HBSS aşağıdakileri ekleyin ve 37 ° C su banyosu içinde çözülür. Manyetik bir karıştırıcı ile karıştırın. |
| b) 1.3 gr, D-glikoz ihtiva eder. | |
| c) 36 mg MgSO 4. | |
| d) 17.6 mg Askorbik asit. | |
| e) 2M CaCl2 stok solüsyonu 5 ul. | |
| Gibco 15140-062) f) 50 ul Antibiyotik-Antimikotik (100x stok, steril ekleyin. | |
| g) / mL arasında insülin 1 ug. | |
| h) 0.2 um filtre içinden süzme ile, çözeltinin üzerindeki sterilize edin. | |
| i) Karışım süzüldü, 100 ml MEM ile çözeltisi ve laminar akış başlığı içinde 50 mi at serumu. | |
| j) steril konik santrifüj tüpleri içinde 50 ml lik kısımlar halinde olun (Fisher Scientific-14-432-22) ve 4 ° C'de saklayın. | |
| % 4 paraformaldehid sabitleme maddesi çözeltisi. | a) damıtılmış H2O 300 ml takip eden ve manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırılarak eklenmesi ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hazırlayın. |
| b) 2.7 g sodyum fosfat monobazik (NaH 2 PO 4) ekleyin. | |
| c) 11.5 g sodyum fosfat ekleE dibazik (NaHPO 4). | |
| d) 9.0 g sodyum klorür (NaCI) ekleyin. | |
| e) yakl ısıtın. 700 55 ° C distile H 2 O ml ve ısı kapatın. | |
| f) 40 gr paraformaldehid (PFA) ilave edildi ve manyetik bir karıştırma plakası kullanılarak 700 ml su ilave edin. | |
| g) PBS (a, b, c, d) birleştirin ve PFA (e, f) çözeltiler, 1,000 ml nihai hacme kadar 7.4 ve en fazla pH ayarlanır. | |
| % 0.1 Sodyum Azid Çözelti | a) PBS çözeltisi 1 L Toz haline getirilmiş sodyum azid ve 1 g (NaN3) ekleyin. |
| b) Mix 4 ° C'de manyetik karıştırıcı plaka ve mağaza kullanarak. |
Tablo 2. Çözümler ve Tarifler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CldU (veya BrdU) uygulamasını takiben, farmakolojik ajanların uygulama çizelgesi belirli bir gelişme pencereleri sırasında doğan KEGM hedef olarak seçilebilir. Örneğin, bir varsayımsal madde, GABA depolarize yerde bir gelişme aşamasında olgunlaşmamış nöronların yaşı denk önerilmiştir ikinci hafta sonra CldU enjeksiyon sırasında uygulanabilir. Bu protokolü kullanarak gelecekteki çalışmalar farmakolojik ajan ve "terzi" özel ilgi deneysel soruya yaklaşım maruz kalma penceresi adapte olabilir.
Bu dilim kültürleri doğum sonrası nöron araştırma için geçerli bir model olduğu belirlemek için önemli bir kriter hipokampus yenidoğan nöronlar leke ve ölçmek için yeteneğidir. Bu hipotezi destekleyen iki ana bulgular mikroskobik analiz CldU ve aynı nöronlar endojen protein belirteçlerinin için immünohistokimyasal tepki gösterdi ki vardı.Endojen nöronal işaretleri ile kombinasyon halinde kullanıldığında, bu BrdU ve CldU olarak timidin analogları nöron araştırma için güçlü araçlardır.
intraperitonal enjeksiyon ile örneğin BrdU olarak timidin analogları, uygulanmasına, genel olarak mitoz 29 S-fazı yapılan etiket nöronlara nöron araştırmalarda kullanılır. Benzer yaklaşımlar, bazı modifikasyonlarla organotipik kültürlerinin olarak kullanılabilecektir. Örneğin, önceki çalışmalarda (3 gün için 0.5 uM) ~ 14 DIV 18 sonra kültürleri dilim BrdU uygulanan. Bu çalışmada sunulan verilerin gözden metrik bazı nöron alanında, yani kullanılan standart teknikler, stereolojik miktarının 30 istihdam yok nörogenezi ölçülmesi için kullanılan olduğunu ortaya koymaktadır. BrdU ve nöronal-çekirdekler (NeuN) pozitif hücrelerinin ko-ifadesini rapor Örneğin, bu bilgi sağlamak için değil "kültür için" toplam hücre sayısını gösterirdoku alanı veya hacmi ile ilgili tirme.
Daha sonraki çalışmalar antikorlar daha kolay doku örnekleri 31 nüfuz sağlayarak görselleştirme ve immünohistokimyasal protokolleri geliştirilmiş bireysel 10 mikron bölümlerine kültür dilimleri kesit bu yöntemle geliştirilmiş. Ranza ve ark. 28 10 mikron Bölüm başına ko-işaretli hücrelerin sayısı olarak BrdU çift etiketleme (3 gün için 10 mM) bildirilmiş, ancak karşılaştırmalı alan veya belirli hipokampal bölgede okudu, yani CA1, CA3 veya hakkında bilgi vermedi DG. Ayrıca, konfokal ve floresan mikroskopi görüntüleri analizi inandırıcı hipokampal morfolojisi başarıyla devam edildi olduğunu göstermez.
Daha da önemlisi, her iki çalışma sakıncaları beraberinde getirir 3 gün BrdU maruz dönemi, kullanılan. BrdU etiketleme büyük ölçüde araştırmacılar va yeni bölünmüş hücreleri izlemek için izin vererek nöron çalışmaları destekli ettiçeşitli yapılar beyin bölgeleri. Bununla birlikte, BrdU toksisite, aynı zamanda, iyi karakterize edilmiştir. Kullanımı morfolojik ve davranışsal anormallikler 32,33 ve nöral kök hücrelerin 34-36 hücre döngüsü, farklılaşma, göç ve sağkalım üzerine olumsuz etkilere neden olduğu gösterilmiştir. Daha önce de belirtildiği çalışmalarda BrdU uzun süre idare hipokampal fizyolojisi değişmiş ve BrdU yönetiminden bazı yan etkileri kaçınılmaz olabilir, bizim deneysel protokol timidin analogları için birlikte dokuyu inkübe bu komplikasyonların bazıları sınırlamak için tasarlanmıştır karıştırıcı değişkenler tanıttı olabilir 2 saat. Kuluçka çözüm hazırlarken zaman BrdU daha iyi çözünürlüğe gösterdi çünkü Ayrıca, biz yerine BrdU CldU kullanmayı seçti. 3 günlük protokolden bazı deney tasarımları için, örneğin yararlı olabilir, çoğalan hücrelerin etiketlenmesi pekiştirmek, 2 saat protokol göreceli olarak küçük k nüfusu darbe-işaretli bir avantajıİstenilen sağkalım süreleri okudu olabilir hücrelerin yon (Şekil 2B bakınız).
Organotipik dilim kültürler 37 etiketleme teknikleri önemli bir katkı yaptı Namba ve ark. BrdU uygulaması, iki farklı yöntem aşağıdaki nöronal üretim düzeyini karşılaştırarak. 30 dakika anında doku eksplantasyonu aşağıdaki 1 uM BrdU içeren kültür ortamı almıştır, in vitro kültürler ile doğum sonrası gün 5 (P5) sıçanlarda BrdU (50 mg / kg) yazarları göre intraperitonal (İP) enjeksiyonu yapılmıştır. Onlar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark rapor in-vivo kültür dokusunda ve erken in vitro BrdU enjeksiyonu. Yazarlar hipokampal yapısını özetleyen net görüntüler sunmak yoktu ama onlar granül hücre tabakası toplam hücrelerin yüzdeleri olarak BrDU immünoreaktivite rapor. Onlar stereolojik saymayı istihdam ederken, alan veya hacim olarak bir ölçü sağlayan değerli olacaktır. Genel olarak, Tam bir nöron ve farmakolojik tedirginlikler çalışma için uygulamaları ile, doğum sonrası hipokampal dilim kültürlerin detaylandırma olarak anılan çalışmalar mevcut organotipik kültürler. Bu teknik kullanılarak, hipokampal dilimler nitro (DIV), en fazla 21 gün muhafaza edilebilir ve uyuşturucu nöron üzerindeki etkisini incelemek için kültür periyodu içinde herhangi bir noktada ortama ilave edilebilir.
Amacımız 2 saat CldU kısa 'darbe' uygulamasını sağlayarak KEGM bir ayrık, nispeten homojen nüfus etiket oldu. Nörogenezi eğitim için bir yaygın kullanılan strateji timidin analoğu ile çeşitli endojen belirteçler için immünohistokimyasal boyama yoluyla bir nöronun olgunlaşma evresinin belirlenmesini içerir. Konfokal ve floresan mikroskopi timidin analog CldU dahil ve bu nedenle aktif kültür döneminde mitoz geçiren çekirdeklerin varlığını doğruladı. Şekil 2 in-vivo doku analizi için kullanılan imünohistokimyasal protokoller dilim kültürlere adapte edilebileceğini kanıtlar sağlamaktadır.
Spesifik olarak, nöron araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir yöntem, tam olarak, aşağıdaki ifade ağırlıklı günde 3-21 ve olgun nöronal işaretleyici Kalbindin (CaBP) henüz olgunlaşmamış nöronlar olarak ifade edilir mikrotübül ilişkili protein, DCX, immünohistokimyasal boyama gerçekleştirmektir 28 gün sonrası mitoz. CldU + hücrelerinin fenotipi, bunlar endojen işaretlerini 26 kullanılarak belirlenmiştir.
Daha uzun süre dilim kültürleri korumak için geliştirilmiş yöntemler daha CldU + nöronlar olgun, CaBP + aşamaya ulaşmak için izin veren ek yarar olabilir. Şu anda, organotipik kültürü yaklaşımın bir sınırlama doku sürekli kültür süresi boyunca değişiyor olmasıdır. Örneğin, hemen dilimlerin hipokampal diseksiyon ve plakalanmasından sonra, Tissue yaklaşık 400 um arasında bir genişliğe sahiptir. Bununla birlikte, inkübasyon odasında 2-3 hafta sonra doku dilimleri 250-350 um arasında bir son genişliği ile sonuçlanan, ince başlayacaktır. Bu immünohistokimya için kullanılabilir ve bir proje için nasıl kullanılacağı birçok hayvan planlarken dikkate alınması gereken doku miktarını sınırlar. Ek deneyler in vitro meydana hipokampal fizyoloji fonksiyonel değişiklikler karakterize yardımcı olacaktır.
hipokampal dilim kesit ve boyama için protokol kültür döneminde gerçekleşen hücresel ve morfolojik değişiklikleri analiz için geliştirilmiştir. Dilim kültürleri hipokampal KEGM olgunlaşma sırasında farklı gelişim aşamalarında geçmek ve gelecekteki yetişkin nöron çalışmaları için değerli bir araç temsil gibi çeşitli farmakolojik ajanların etkisini test etmek için bir fırsat sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
