A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.
There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.
Insekter spelar en viktig roll i överföringen av kostrelaterade sjukdomar eftersom de kan sprida patogener till livsmedel eller matkontaktytor och redskap en. Bland insekter, flugor, kackerlackor och myror uppvisar beteenden som gynnar spridningen av livsmedelsburna patogener. Dessa beteenden inkluderar en förening med ruttnande materia, avfall och avföring, endophily (in byggnader), och synanthropy (sambo med människor) 2. .. Foodborne patogener såsom Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Escherichia coli O157: H7, och medlemmar av släktet Cronobacter (tidigare Enterobacter sakazakii) har rapporterats som skall överföras via insekter 3-5. Synanthropic filth flugor mekaniskt sprida livsmedelsburna bakterier genom att överföra patogener från sina förorenade huden. Emellertid kan närvaron av livsmedelsburna patogener i matsmältningskanalen av flugor vara upp till tre gångerstörre än den som observerades på deras kroppsytor (kropp, huvud, ben och vingar) 5. Foodborne patogener kan också stanna kvar i flugans matsmältningskanalen för en större tid än på kroppsytan 6,7 och i vissa fall, kan de föröka sig, kolonisera flugans tarmkanalen 4,8,9. Detta ökar vektorpotentialen av flugor, eftersom de kan spridas vidare livsmedelsburna patogener genom avföring och uppstötningar 10,11.
Numera är det förbättrade övervakningssystem som är i stånd att detektera foodborne sjukdomsutbrott snabbare. När de utför livsmedelsburna undersökningar av sjukdomsutbrott folkhälsotjänstemän leta efter mat som kan vara källan (er) eller fordon (s) för infektion. Utredarna kan också utföra en miljöbedömning av anläggningen (eller anläggningar) inblandade att ta reda på hur maten var förorenad och kan samla in prover som en del av utredningen 12. Despite den stora mängd vetenskaplig litteratur om de insekter som bärare av livsmedelsburna patogener, länka insekter som vektorer för patogenen orsakar en viss livsmedelsburna sjukdomar utbrott har varit utmanande. Detta beror främst på insekter inte blir aseptiskt samlas in som en del av miljöprovtagningsprogram under livsmedelsburna undersökningar av sjukdomsutbrott. Om du vill inkludera insekter, särskilt de som uppvisar beteenden som gynnar spridningen av livsmedelsburna patogener, som en del av ett provtagningsförfarande miljö, ett standardiserat, snabb, känslig och tillförlitlig protokoll för att upptäcka livsmedelsburna patogener från en enda insekt måste vara på plats.
Traditionella plätering tekniker för detektion av livsmedelsburna patogener från insekter är arbetskrävande och beror på konkurrens tillväxt målbakterien i olika odlingsmedier för att övervinna den snabba tillväxten av den medfödda kommensala floran i insekten. De flesta av de studier som har associerade insekter med bacterial patogener har ökat känsligheten av metoden genom att samla ihop flera insekter snarare än att identifiera närvaron av patogener på en per individuell basis. Således gjorde dessa studier inte differentiera kroppsdel av insekten där patogener påträffades 13-18. Förmågan att identifiera huruvida livsmedelsburna patogener är placerade på kroppsytan eller i matsmältningskanalen hos en individ insekt är viktigt eftersom detta kan ha epidemiologiska implikationer och kan leda till olika begränsningsstrategier. Som mekaniska vektorer, flugor att landa på mat för en kort tid får endast överföra låga nivåer av bakterier från sin kroppsyta, medan de flugor som spy och bajsa på maten öka sannolikheten för överföring patogener på potentiellt högre infektion. Följaktligen är det viktigt att uppskatta förekomsten av en livsmedelsburen patogen per individuell insekt och differentiera kroppsdelen av denna insekt där den bakteriella p athogen ligger.
Även om användningen av kulturoberoende metoder för att upptäcka livsmedelsburna patogener alltmer genomförs, de har inte använts kommersiellt för att upptäcka livsmedelsburna patogener från en enda insekt. För närvarande finns det validerade molekylära protokoll som är kommersiellt tillgängliga för snabb detektion av livsmedelsburna patogener från livsmedel som används av industrin och tillsynsmyndigheter. Dessa metoder innefattar DNA-baserade system för detektion av patogener i en mängd olika livsmedelsprover. Även molekylära protokoll är snabbare än traditionella plating metoder, är anrikning av provet fortfarande krävs för att erhålla känslighetsnivån 10 2 kolonibildande enheter (CFU) av bakteriell patogen behövs polymerase chain reaction (PCR) -baserade metoder 19. Dessutom behövs isolering av rena bakteriekolonier från PCR-positiva prov för att bekräfta patogenen med lämpliga metoder.
innehåll "> Syftet med detta protokoll är att standardisera en kommersiellt tillgänglig PCR-baserat system som används för att upptäcka patogener från livsmedels- och miljöprover för upptäckt av livsmedelsburna bakterier från kroppsytan och matsmältningskanalen av en enda fluga och att ytterligare isolera dem patogener från samples.The känslighet av protokollet som beskrivs här var kalibreras först med lab-uppfödda vuxen husflugor (Musca domestica) som var experimentellt utfodrats med seriespädningar av varje bakteriell patogen. Det standardiserade protokoll användes därefter för att kartlägga 100 vildfångad flugor för förekomst av livsmedelsburna patogener från sina kroppsytor och / eller matsmältnings kanaler. Denna standardiserat protokoll tillåter folkhälso laboratorier för att upptäcka hälsorisker förknippade med insekter, vilket gör det möjligt att samla in dem som en del av miljöprovtagningsprogram när du utför livsmedelsburna undersökningar av sjukdomsutbrott.Tidigare studier som har upptäckts livsmedelsburna patogener från vilda insekter har använt en stor variation av protokoll som inte kan innehålla den information som behövs för att korrekt bedöma maten relaterad risk för förekomst av en enda fluga i livsmedel eller livsmedelsrelaterade miljöer 13,15, 23,24. Här visade vi att användningen av denna standardiserade protokollet, är det möjligt att detektera och isolera Cronobacter spp., S. enterica, och L. monocytogenes från kroppsytan och matsmältningskanalen av enstaka flugor som fångats i vilt. Eftersom insekter kan bära lågt antal av målet livsmedelsburna patogener och ett stort antal andra inhemska mikroorganismer 25,26, kräver detta protokoll primära (och ibland sekundär) anrikning av proverna i specifika odlingsmedier för att öka känsligheten för upptäckt av målet livsmedelsburna patogener . Resultat från PCR-baserade system för upptäckt erhölls inom ca 30 tim (för DETEInsatser av Cronobacter spp. och S. enterica) och 48 h (för detektion av L. monocytogenes) efter initialt bearbeta prover. Således är detta protokoll tillförlitlig samt snabb och känslig nog för att screena en enda fluga för förekomst av livsmedelsburna patogener.
Bekräftelse av PCR-positiva resultat och isolering av livsdugliga bakterier är en del av det standardförfarande för många laboratorier. Dessutom, för epidemiologiska ändamål, är rena bakteriekulturer från PCR-positiva prov som krävs för att ytterligare bekräfta och serotyp av livsmedelsburna patogener använder biokemiska, immunologiska eller genetiska metoder. Även om inga falska positiva observerades vid detektering S. enterica och L. monocytogenes från kroppsdelar av enstaka vildfångade flugor, med hjälp av detta protokoll, fann vi upp till en 50% av antalet falska positiva för Cronobacter spp. Detta antyder att det PCR-baserade systemet för släktet Cronobact detekteringser kan korsreagera med andra Enterobacteriaceae närvarande bland de mycket komplexa floran bärs av flugor. Således, isolering och rening av rena kolonier av släktet Cronobacter från PCR-positiva prover kräver mer selektiv plätering än de andra patogener utvärderades.
Detta protokoll har främst standardiserats för att screena individuella vildfångade flugor för förekomst av Cronobacter spp., S. enterica, och L. monocytogenes använder en kommersiell PCR-baserade system för upptäckt. Dock var detta protokoll också enkelt anpassas till skärmen kroppsdelar av enstaka flugor för förekomst av andra livsmedelsburna patogener som enterohemorragisk E. coli O157: H7 (antingen med E. coli O157: H7 MP standardanalys kit eller E. coli O157: H7 realtidsanalys kit) och shiga toxinbildande E. coli (STEC) grupp (med användning av realtids STEC suite), erhålla känslig> 80% (Avpubliceraed uppgifter). Dessutom kan detta protokoll potentiellt anpassas för att upptäcka livsmedelsburna patogener från andra insekter som är kända vektorer sjukdomar (kackerlackor och myror), men det behövs mer forskning på området.
Foodborne utredningar sjukdom utbrotts är mycket dynamisk och omfattar en flerstegsprocess som kan variera beroende på den specifika situationen och den lokala miljön utreds 12,27. Dessa undersökningar är viktiga eftersom de ger omedelbart skydd för folkhälsan genom att förebygga framtida sjukdomar. Dessutom kan dessa undersökningar klarlägga nya mekanismer genom vilka livsmedelsburna mikroorganismer sprids, och väcker viktiga frågor som leder till nya områden för forskning 28. Utredningsteknik samt standardiserade, snabba och känsliga protokoll är nödvändiga för att upptäcka livsmedelsburna patogener från enskilda insekter. Denna standardiserat protokoll öppnar möjligheten att aseptiskt samla insekter som flugor, which kan vektor den livsmedelsburen bakteriell patogen, som en del av en miljöprovtagningsprogram. Den epidemiologiska information som kan vinna på detta skulle vara till nytta för att konstruera en korrekt bild av mekanismerna för överföring av livsmedelsburna patogener av insekter (dvs, längd exponeringstid: en fluga genom att landa kontra flugor landning, avföring, och regurgitating).
Slutligen, trots att den kommersiella PCR-baserade system för upptäckt som beskrivs här är praktiskt att använda och förenklar PCR-amplifiering och visualisering av ett släkte-nivå amplikon, är det ingalunda den enda lämpliga systemet. Lysatet från anrikade prover skulle alternativt kunna användas för att screena för närvaron av livsmedelsburna patogener genom att använda allmänt tillgängliga artspecifika primerpar. Dock bör detektionskänsligheten påvisas innan de används.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.
Bismuth sulfite (BS) agar | Fisher Scientific | R452402 | *Multiple suppliers. |
Brain heart infusion (BHI) broth | Becton, Dickson and Company | 299070 | *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Listeria agar (BLA) | Fisher Scientific | CM1080B | *Multiple suppliers. |
Buffered peptone water (BPW) | Becton, Dickson and Company | 212367 | *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) | Fisher Scientific | CM1055B | *Multiple suppliers. |
chromID Sakazakii Agar | bioMérieux | 43741 | *Call for information: 800.682.2666 |
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
Hektoen enteric (HE) agar | Fisher Scientific | OXCM0419B | *Multiple suppliers. |
24 Listeria enrichment broth (24LEB) | Oxoid | CM1107 | *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers. |
Listeria selective enrichment supplement | Oxoid | SR0243 | *Multiple suppliers. |
Novobiocin | Fisher Scientific | OXSR0181E | *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C |
Vancomycin hydrochloride hydrate | Sigma Aldrich | 861987 | Store at 2-8 °C |
Cefsulodin sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | C8145 | Store at 2-8 °C |
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium | Fisher Scientific | CM0669B | *Multiple suppliers. |
Tetrathionate (TT) Broth | Becton, Dickson and Company | 249120 | *Multiple suppliers. |
Trypticase soy agar (TSA) | Becton, Dickson and Company | 236930 | *Multiple suppliers. |
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar | Becton, Dickson and Company | 221284 | *Multiple suppliers. |
API Biochemical identification system | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2666 |
VITEK 2: Product Safety | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2667 |
BAX System Q7 | DuPont | N/A | |
BAX E. sakazakii Standard assay kit | DuPont | D11801836 | * |
BAX L. monocytogenes 24E assay kit | DuPont | D13608125 | * |
BAX Salmonella 2 Standard assay kit | DuPont | D14368501 | * |
Capping tool | DuPont | D11677028 | |
Decapping tool | DuPont | D11134095 | |
PCR tube rack/holder | DuPont | D12701663 | |
Featherweight forceps, wide tip | BioQuip | 4750 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Fine point, straight tip forceps | BioQuip | 4731 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Zirconia/silica beads, 0.5 mm | Bio Spec Products, Inc. | 11079105z | Multiple suppliers. |
Petri dishes – 60X15mm | Fisher Scientific | 08-772B | Multiple suppliers. |
Disposable inoculating loops, 10µL | Fisher Scientific | 22-363-606 | Multiple suppliers. |
L-shaped cell spreaders | Fisher Scientific | 14-665-230 | Multiple suppliers. |
Microcentrifuge tubes, 2 ml | Fisher Scientific | Various | Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers. |
Cluster tubes | Fisher Scientific | 05-500-13 | |
Cluster tubes caps | Fisher Scientific | 05-500-23 | |
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) | N/A | N/A | *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers. |
Sterile deionized water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Sterile distilled water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Ethyl alcohol 190 proof | N/A | N/A | *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers. |
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes | Scientific Industries, Inc. | SI-D238 | Multiple suppliers. |
Heating block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Cooling block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Recirculating water bath | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Stereo microscope | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Centrifuge | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Incubator | N/A | N/A | Multiple suppliers. |