A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.
There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.
Insekter spiller en vigtig rolle i transmissionen af fødevarerelaterede sygdomme, fordi de kan sprede patogener til fødevarer eller kontakt med fødevarer overflader og redskaber 1. Blandt insekter, fluer, kakerlakker og myrer udviser adfærd, der fremmer udbredelsen af fødevarebårne patogener. Disse adfærdsmønstre omfatter en forening med rådnende sag, nægter og afføring, endophily (ind bygninger), og synanthropy (samlevende med mennesker) 2. .. Fødevarebårne patogener, såsom Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Escherichia coli O157: H7, og medlemmer af slægten Cronobacter (tidligere Enterobacter sakazakii) er blevet rapporteret, at indberette insekter 3-5. Synanthropic skidtfluer mekanisk spredt fødevarebårne bakterier ved at overføre patogener fra deres forurenede kropsoverflader. Tilstedeværelsen af fødevarebårne patogener i fordøjelseskanalen af fluer kan imidlertid være op til tre gangestørre end den observeret på deres krop overflader (krop, hoved, ben og vinger) 5. Fødevarebårne patogener kan også forblive i flue fordøjelseskanalen for en større længde af tid end på kropsoverfladen 6,7 og i nogle tilfælde er de i stand til at formere sig, kolonisere flue fordøjelseskanalen 4,8,9. Dette øger vektor potentiale fluer, fordi de yderligere kan sprede fødevarebårne patogener gennem afføring og opstød 10,11.
I dag er der bedre overvågningssystemer, der kan hurtigere at opdage fødevarebårne sygdomme udbrud. Under udførelsen fødevarebårne udbrud undersøgelser, den offentlige sundhed embedsmænd kigge efter de fødevarer, der kan være den kilde (r) eller køretøj (er) for infektion. Efterforskere kan også udføre en miljøvurdering af anlægget (eller anlæg), der deltager for at finde ud af, hvordan maden var forurenet, og kan indsamle prøver som led i undersøgelsen 12. DespITE den store mængde af videnskabelig litteratur vedrørende insekter som bærere af fødevarebårne patogener, der forbinder insekter som vektorer af patogenet forårsager en bestemt fødevarebårne sygdomme udbrud har været udfordrende. Det er primært fordi insekter ikke bliver aseptisk indsamlet som led i miljø- prøveudtagning programmer i fødevarebårne udbrud undersøgelser. Hvis du vil medtage insekter, især dem, der udviser adfærd, der fremmer udbredelsen af fødevarebårne patogener, som led i en procedure miljøprøver, en standardiseret, hurtig, følsom og pålidelig protokol til at påvise fødevarebårne patogener fra en enkelt insekt skal være på plads.
Traditionelle plating teknikker til påvisning af fødevarebårne patogener fra insekter er besværlige og afhænger af konkurrencedygtig vækst af de målrettede bakterier i forskellige dyrkningsmedier til at overvinde den hurtige vækst i den medfødte kommensale mikrobiota af insektet. De fleste af de undersøgelser, der er forbundet insekter med bacterial patogener har øget følsomhed af fremgangsmåden ved at samle flere insekter stedet for at identificere tilstedeværelsen af patogener på en per individuel basis. Således har disse undersøgelser ikke skelner kroppen del af insekt, hvor patogener blev fundet 13-18. Evnen til at identificere, om fødevarebårne patogener er placeret på kroppens overflade eller i fordøjelseskanalen af en individuel insekt er vigtig, da dette kan have epidemiologiske konsekvenser, og kan føre til forskellige afbødningsstrategier. Som mekaniske vektorer, fluer, der lander på mad for en kort tid, kan kun overføre lave niveauer af bakterier fra deres krop overflade, disse fluer, gylpe og defecate på fødevarer øge sandsynligheden for overførsel patogener på potentielt højere niveauer af infektion. Derfor er det vigtigt at vurdere forekomsten af fødevarebårne patogener per individuel insekt- og at differentiere kropsdel at insekt hvor det bakterielle p athogen er placeret.
Selvom brugen af kultur-uafhængige metoder til påvisning af fødevarebårne patogener i stigende grad ved at blive gennemført, er de ikke blevet kommercielt anvendt til at påvise fødevarebårne patogener fra en enkelt insekt. I øjeblikket er der valideret molekylære protokoller, der er kommercielt til rådighed for hurtig påvisning af fødevarebårne patogener fra fødevarer, der bliver brugt af industrien og reguleringsorganer. Disse metoder omfatter DNA-baserede systemer til detektion af patogener i en række fødevarer prøver. Selv molekylære protokoller er hurtigere end traditionelle plating metoder, er der stadig behov berigelse af prøven for at opnå følsomheden af 10 2 kolonidannende enheder (CFU) af den bakterielle patogen nødvendig polymerasekædereaktion (PCR) -baserede metoder 19. Derudover er isolation af rene bakteriekolonier fra PCR-positive prøver, der kræves for at bekræfte patogenet ved anvendelse af passende metoder.
indhold "> Formålet med denne protokol er at standardisere en kommercielt tilgængelig PCR-baseret system, der anvendes til at detektere patogener fra fødevarer og miljøprøver til påvisning af fødevarebårne bakterier fra kroppens overflade og fordøjelseskanalen af en enkelt flue og yderligere isolere de patogener fra samples.The følsomhed af protokollen beskrevet her blev først kalibreret med lab-opdrættet voksen hus fluer (Musca domestica), der blev eksperimentelt fodret med serielle fortyndinger af hver bakterielt patogen. Den standardiserede protokol blev efterfølgende anvendt til at undersøge 100 indfanget flyver for tilstedeværelsen af fødevarebårne patogener fra deres krop overflader og / eller fordøjelseskanal. vil denne standardiseret protokol tillade folkesundheden laboratorier til påvisning af sundhedsmæssige trusler fra insekter, der giver mulighed for muligheden for at indsamle dem som en del af miljøprogram prøveudtagning, når du udfører fødevarebårne undersøgelser af udbrud.Tidligere undersøgelser, der har påvist fødevarebårne patogener fra vilde insekter har brugt mange forskellige protokoller, der måske ikke indeholde de nødvendige oplysninger til præcist at vurdere den fødevarerelaterede risiko for forekomst af en enkelt flue i fødevarer eller fødevarerelaterede miljøer 13,15, 23,24. Her har vi vist, at ved hjælp af denne standardiserede protokol, er det muligt at detektere og isolere Cronobacter spp., S. enterica og L. monocytogenes fra kroppens overflade og fordøjelseskanalen af enkelte fluer fanget i naturen. Fordi insekter kan bære lave antal af målet fødevarebårne patogen og høje antal andre indfødte mikrobiota 25,26, protokollen kræver primære (og til tider sekundær) berigelse af prøverne i bestemte dyrkningsmedier for at øge følsomheden af påvisning af målet fødevarebåren patogen . Resultaterne fra PCR-baseret påvisningssystem blev opnået inden for cirka 30 timer (for detektion af Cronobacter spp. og S. enterica) og 48 timer (til påvisning af Listeria monocytogenes) efter oprindeligt behandling af prøverne. Således er denne protokol er pålidelig samt hurtig og følsom nok til at screene et enkelt flue for tilstedeværelsen af fødevarebårne patogener.
Bekræftelse af PCR-positive resultater og isolering af levedygtige bakterier er en del af standardprocedure, af mange laboratorier. Desuden for Epidemiologi formål, rene bakteriekulturer fra PCR-positive prøver skal yderligere bekræfte og serotype af fødevarebåren patogen hjælp biokemiske, immunologiske eller genetiske metoder. Selv om der ikke falske positiver blev observeret, når påvisning S. enterica og L. monocytogenes fra kropsdele af enkelt vild fanget fluer, ved hjælp af denne protokol, fandt vi op til 50% på falske positiver for Cronobacter spp. Dette antyder, at PCR-baseret påvisningssystem for slægten CronobactER kan krydsreagere med andre Enterobacteriaceae stede blandt de meget komplekse mikroflora bæres af fluer. Således, isolering og oprensning af rene kolonier af slægten Cronobacter fra PCR-positive prøver kræver mere selektiv udpladning end de andre patogener evalueret.
Denne protokol er primært blevet standardiseret til at screene individuelle vilde-fanget fluer for tilstedeværelsen af Cronobacter spp., S. enterica og L. monocytogenes anvender et kommercielt PCR-baseret påvisningssystem. Men denne protokol også nemt tilpasses til at screene kropsdele af enkelte fluer for tilstedeværelsen af andre fødevarebårne patogener, såsom enterohæmoragisk E. coli O157: H7 (under anvendelse af enten E. coli O157: H7 MP standard assay kit eller E. coli O157: H7 realtid assay kit) og shiga-toksigene E. coli (STEC) gruppe (ved hjælp af real-time STEC suite), opnåelse følsomheder> 80% (Afpublicered data). Desuden kan denne protokol potentielt indrettet til at detektere fødevarebårne patogener fra andre insekter, der er kendt vektorer af sygdomme (kakerlakker og myrer), men der er behov for mere forskning på dette område.
Fødevarebårne sygdomme undersøgelser af udbrud er meget dynamisk og omfatter en multi-trins proces, der kan variere alt efter den konkrete situation og det lokale miljø, som undersøges 12,27. Disse undersøgelser er vigtige, fordi de giver øjeblikkelig beskyttelse ved at forhindre fremtidige sygdomme folkesundheden. Derudover kan disse undersøgelser belyse nye mekanismer, hvormed fødevarebårne mikroorganismer spredes, og rejser vigtige spørgsmål, der fører til nye områder for forskning 28. Efterforskningsteknikker samt standardiserede, hurtige og følsomme protokoller er nødvendige til påvisning af fødevarebårne patogener fra de enkelte insekter. Denne standardiserede protokol åbner mulighed for aseptisk samle insekter som fluer, which kan vektor den fødevarebårne bakterielle patogen, som en del af et miljøprogram prøveudtagning. De epidemiologiske oplysninger, der kan opnås fra dette ville være nyttige i at konstruere et præcist billede af de mekanismer for overførsel af fødevarebårne patogener af insekter (dvs. længden af eksponeringstid: en flue ved at lande versus fluer landing, afføring, og regurgitating).
Endelig, selv om den kommercielle PCR-baseret påvisning her beskrevne system er praktisk at anvende og forenkler PCR-amplifikation og visualisering af en slægt-niveau amplicon, er det på ingen måde den eneste passende system. Af lysatet fra berigede prøver kunne alternativt anvendes til at screene for tilstedeværelsen af fødevarebårne patogener ved hjælp af offentligt tilgængelige artsspecifikke primerpar. Imidlertid bør detektionsfølsomheden påvises forud for deres anvendelse.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.
Bismuth sulfite (BS) agar | Fisher Scientific | R452402 | *Multiple suppliers. |
Brain heart infusion (BHI) broth | Becton, Dickson and Company | 299070 | *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Listeria agar (BLA) | Fisher Scientific | CM1080B | *Multiple suppliers. |
Buffered peptone water (BPW) | Becton, Dickson and Company | 212367 | *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) | Fisher Scientific | CM1055B | *Multiple suppliers. |
chromID Sakazakii Agar | bioMérieux | 43741 | *Call for information: 800.682.2666 |
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
Hektoen enteric (HE) agar | Fisher Scientific | OXCM0419B | *Multiple suppliers. |
24 Listeria enrichment broth (24LEB) | Oxoid | CM1107 | *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers. |
Listeria selective enrichment supplement | Oxoid | SR0243 | *Multiple suppliers. |
Novobiocin | Fisher Scientific | OXSR0181E | *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C |
Vancomycin hydrochloride hydrate | Sigma Aldrich | 861987 | Store at 2-8 °C |
Cefsulodin sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | C8145 | Store at 2-8 °C |
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium | Fisher Scientific | CM0669B | *Multiple suppliers. |
Tetrathionate (TT) Broth | Becton, Dickson and Company | 249120 | *Multiple suppliers. |
Trypticase soy agar (TSA) | Becton, Dickson and Company | 236930 | *Multiple suppliers. |
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar | Becton, Dickson and Company | 221284 | *Multiple suppliers. |
API Biochemical identification system | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2666 |
VITEK 2: Product Safety | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2667 |
BAX System Q7 | DuPont | N/A | |
BAX E. sakazakii Standard assay kit | DuPont | D11801836 | * |
BAX L. monocytogenes 24E assay kit | DuPont | D13608125 | * |
BAX Salmonella 2 Standard assay kit | DuPont | D14368501 | * |
Capping tool | DuPont | D11677028 | |
Decapping tool | DuPont | D11134095 | |
PCR tube rack/holder | DuPont | D12701663 | |
Featherweight forceps, wide tip | BioQuip | 4750 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Fine point, straight tip forceps | BioQuip | 4731 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Zirconia/silica beads, 0.5 mm | Bio Spec Products, Inc. | 11079105z | Multiple suppliers. |
Petri dishes – 60X15mm | Fisher Scientific | 08-772B | Multiple suppliers. |
Disposable inoculating loops, 10µL | Fisher Scientific | 22-363-606 | Multiple suppliers. |
L-shaped cell spreaders | Fisher Scientific | 14-665-230 | Multiple suppliers. |
Microcentrifuge tubes, 2 ml | Fisher Scientific | Various | Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers. |
Cluster tubes | Fisher Scientific | 05-500-13 | |
Cluster tubes caps | Fisher Scientific | 05-500-23 | |
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) | N/A | N/A | *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers. |
Sterile deionized water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Sterile distilled water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Ethyl alcohol 190 proof | N/A | N/A | *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers. |
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes | Scientific Industries, Inc. | SI-D238 | Multiple suppliers. |
Heating block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Cooling block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Recirculating water bath | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Stereo microscope | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Centrifuge | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Incubator | N/A | N/A | Multiple suppliers. |