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व्यक्तिगत गंदगी मक्खियों से खाद्यजनित बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की जांच

doi: 10.3791/52372 Published: February 13, 2015

Introduction

वे भोजन या खाद्य संपर्क सतहों और बर्तन करने के लिए 1 रोगज़नक़ों फैल सकता है क्योंकि कीड़े भोजन से संबंधित रोगों के संचरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कीड़ों के अलावा, मक्खियों, तिलचट्टे, और चींटियों खाद्य जनित रोगजनकों के प्रसार के पक्ष में है कि व्यवहार दिखा रहे हैं। इन कार्यों मना और मल, endophily (प्रवेश करने इमारतों), और synanthropy (मनुष्यों के साथ cohabiting), खस्ताहाल बात के साथ एक संघ में शामिल दो। ।। इस तरह के साल्मोनेला एसपीपी के रूप में खाद्य जनित रोगजनकों, लिस्टेरिया monocytogenes, कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी, Escherichia कोलाई O157: H7, और जीनस Cronobacter (पूर्व Enterobacter sakazakii) के सदस्यों के कीड़ों को 3-5 से प्रेषित किए जाने की सूचना दी गई है। Synanthropic गंदगी यंत्रवत् उनके दूषित शरीर सतहों से रोगजनकों स्थानांतरित द्वारा खाद्य जनित बैक्टीरिया फैल मक्खियों। हालांकि, मक्खियों की आहार नली में खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति में तीन गुना तक हो सकता हैउनके शरीर सतहों (शरीर, सिर, पैर, और पंख) 5 पर मनाया है कि अधिक से अधिक से अधिक। खाद्य जनित रोगजनकों भी शरीर की सतह 6,7 पर की तुलना में और कुछ मामलों में समय का एक बड़ा लंबाई के लिए उड़ान भरने की आहार नली में रह सकते हैं, वे मक्खी के पाचन तंत्र 4,8,9 बस्तियां, गुणा करने के लिए सक्षम हैं। वे आगे शौच और ऊर्ध्वनिक्षेप 10,11 के माध्यम से खाद्य जनित रोगजनकों फैल सकता है क्योंकि यह मक्खियों के वेक्टर क्षमता बढ़ जाती है।

आजकल, अधिक तेजी से खाद्य जनित बीमारी के प्रकोप का पता लगाने में सक्षम हैं कि निगरानी प्रणाली वहाँ सुधार कर रहे हैं। खाद्य जनित प्रकोप जांच के प्रदर्शन, वहीं सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों संक्रमण का स्रोत (ओं) या वाहन (ओं) हो सकता है कि भोजन के लिए देखो। जांचकर्ता भी भोजन दूषित हो गया था कि कैसे पता लगाने के लिए शामिल सुविधा (या सुविधाओं) के एक पर्यावरण आकलन प्रदर्शन कर सकते हैं और जांच 12 के भाग के रूप में नमूने एकत्र कर सकते हैं। सैरवैज्ञानिक साहित्य, खाद्य जनित रोगजनकों के वाहक के रूप में कीड़ों के विषय में एक विशेष खाद्य जनित बीमारी फैलने चुनौतीपूर्ण हो गया है के कारण रोगज़नक़ के वैक्टर के रूप में कीड़ों को जोड़ने की विशाल राशि ite। कीड़े aseptically खाद्य जनित प्रकोप जांच के दौरान पर्यावरण नमूना कार्यक्रमों के भाग के रूप में एकत्र किया जा रहा नहीं कर रहे हैं, क्योंकि यह मुख्य रूप से है। कीड़े, एक पर्यावरण नमूना प्रक्रिया, एक ही कीट जगह में होने की जरूरत से खाद्य जनित रोगजनकों पता लगाने के लिए एक, मानकीकृत तेजी से, संवेदनशील और विश्वसनीय प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में, खाद्य जनित रोगजनकों के प्रसार के पक्ष में है कि व्यवहार प्रदर्शित है कि विशेष रूप से उन लोगों में शामिल करने के लिए।

कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए पारंपरिक चढ़ाना तकनीक श्रमसाध्य हैं और कीट की जन्मजात खानेवाला microbiota का तेजी से विकास पर काबू पाने के लिए अलग-अलग संस्कृति मीडिया में लक्ष्य बैक्टीरिया की प्रतिस्पर्धात्मक विकास पर निर्भर करते हैं। बीए के साथ कीड़े संबद्ध कर दिया है कि अध्ययन के अधिकांशcterial रोगज़नक़ों एक साथ कई कीड़े पूलिंग के बजाय व्यक्तिगत आधार प्रति एक पर रोगाणुओं की उपस्थिति की पहचान के द्वारा विधि की संवेदनशीलता बढ़ गई हैं। इस प्रकार, उन अध्ययनों रोगज़नक़ों 13-18 पाए गए जहां कीट के शरीर के अंग को अलग नहीं किया था। इस महामारी विज्ञान के निहितार्थ हो सकते हैं और विभिन्न शमन रणनीतियों को जन्म दे सकती रूप में खाद्य जनित रोगजनकों शरीर की सतह पर या एक व्यक्ति कीट की आहार नली में स्थित हैं कि क्या पहचान करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। मैकेनिकल वैक्टर के रूप में, केवल संक्रमण के संभावित उच्च स्तर पर स्थानांतरित करने के रोगाणुओं की संभावना में वृद्धि बहना उन है कि मक्खियों, जबकि उनके शरीर की सतह से बैक्टीरिया के निम्न स्तर के हस्तांतरण और भोजन पर ख़ारिज हो सकता है थोड़े समय के लिए भोजन पर कि भूमि मक्खियों। नतीजतन, यह एक व्यक्ति कीट प्रति एक खाद्य जनित रोगज़नक़ की व्यापकता का अनुमान लगाने के लिए और है कि कीट जहां बैक्टीरिया पी के शरीर के अंग को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है athogen स्थित है।

खाद्य जनित रोगजनकों पता लगाने के लिए संस्कृति स्वतंत्र विधियों का उपयोग तेजी से कार्यान्वित किया जा रहा है, भले ही वे व्यावसायिक रूप से एक भी कीट से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है। वर्तमान में, व्यावसायिक रूप से उद्योग और नियामक एजेंसियों द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा है कि खाद्य पदार्थों से खाद्य जनित रोगजनकों का तेजी से पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं कि आणविक प्रोटोकॉल वहाँ पुष्टि कर रहे हैं। इन विधियों खाद्य पदार्थों के नमूनों की एक किस्म में रोगजनकों का पता लगाने के लिए डीएनए आधारित सिस्टम शामिल हैं। आणविक प्रोटोकॉल पारंपरिक चढ़ाना तरीकों की तुलना में तेजी से कर रहे हैं, नमूना के संवर्धन अभी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) में जरूरत बैक्टीरियल रोगज़नक़ के 10 2 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) आधारित विधियों 19 की संवेदनशीलता का स्तर प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, पीसीआर सकारात्मक नमूनों से शुद्ध बैक्टीरियल कालोनियों के अलगाव के उचित तरीकों का उपयोग कर रोगज़नक़ पुष्टि करने के लिए आवश्यक है।

सामग्री "> इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य शरीर की सतह से खाद्य जनित बैक्टीरिया का पता लगाने और एक भी मक्खी की आहार नली के लिए भोजन और पर्यावरण के नमूनों से रोगज़नक़ों पता लगाने के लिए और आगे उन अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर आधारित प्रणाली का मानकीकरण करने के लिए है यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का samples.The संवेदनशीलता से रोगजनकों पहले प्रयोगात्मक प्रत्येक बैक्टीरियल रोगज़नक़ के धारावाहिक dilutions के साथ खिलाया गया कि प्रयोगशाला-पाला वयस्क घर मक्खियों (Musca domestica) के साथ calibrated किया गया था। मानकीकृत प्रोटोकॉल बाद में सर्वेक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था 100 जंगली पकड़ा उनके शरीर सतहों और / या पाचन नहरों से खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए मक्खियों। यह मानकीकृत प्रोटोकॉल सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं खाद्य जनित जब प्रदर्शन पर्यावरण नमूना कार्यक्रम के हिस्से के रूप में उन्हें इकट्ठा करने की संभावना के लिए अनुमति देता है, कीड़ों से उत्पन्न स्वास्थ्य खतरों का पता लगाने के लिए अनुमति देगा प्रकोप जांच।

Protocol

मक्खियों के 1. संग्रह

  1. बाँझ कीट विज्ञानी झाडू जाल का उपयोग कर व्यक्ति मक्खियों लीजिए। एक कूलर में जाल डाल दिया है और प्रयोगशाला को हस्तांतरण।

मक्खियों के 2. विच्छेदन

  1. 7 मिनट - 5 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के द्वारा aseptically एकत्र मक्खियों स्थिर।
  2. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) बफर peptone पानी (BPW) के 1 मिलीलीटर युक्त एक बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ संदंश जगह एक मक्खी का उपयोग करना। 2 मिनट के लिए उलटा द्वारा धीरे ट्यूब मिलाएं। यह मक्खी के शरीर की सतह (एस) पर उपस्थित microbiota BPW (BPW-एस) को हस्तांतरित किया जाएगा तो यह है कि मक्खी के पूरे शरीर को मीडिया के साथ संपर्क में होने आवश्यक है। मक्खी की एक संख्या है और शरीर के अंग (यानी, 1S) के साथ ट्यूब लेबल।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित सामग्री और अभिकर्मकों के विस्तृत विवरण के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों / उपकरण की तालिका देखें।
  3. बाँझ संदंश का प्रयोग BPW-एस मीडिया और हस्तांतरण से मक्खी को दूरएक खाली और साफ 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए यह मक्खी कीटाणुरहित सतह के लिए। कीटाणुशोधन और विच्छेदन प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर BPW-एस मीडिया युक्त ट्यूब सेते हैं।
    1. हौसले से तैयार 0.05% (वी / वी) ब्लीच समाधान के 1 मिलीलीटर में डुबो से पहले बाँझ आसुत जल के साथ एक कुल्ला द्वारा पीछा 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर, में डुबो कर मक्खी भूतल-कीटाणुरहित। बाँझ आसुत जल के साथ तीन बार कुल्ला। एक autoclaved 2 मिलीलीटर ट्यूब को पिछले कुल्ला से जल अंतरण।
      नोट: एक हज़ार μl micropipette का उपयोग करके या, ट्यूब inverting मक्खी ट्यूब के अंदर रहता है सुनिश्चित करने के द्वारा तरल हर बार त्यागें। सतह-कीटाणुशोधन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण पर उलटा द्वारा धीरे मिलाएं।
    2. कीटाणुशोधन प्रक्रिया की प्रभावशीलता का मूल्यांकन एक trypticase सोया अगर (टीएसए) थाली करने के लिए पिछले कुल्ला से पानी की 100 μl हस्तांतरण और एक बाँझ एल के आकार डिस्पोजेबल स्प्रेडर का उपयोग करते हुए प्रसार करने के लिए। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। बाद मेंcubation, किसी भी जीवाणु कॉलोनियों की उपस्थिति रजिस्टर।
      नोट: टीएसए प्लेटों पर जीवाणु कॉलोनियों की उपस्थिति एक अक्षम सतह कीटाणुशोधन प्रक्रिया इंगित करता है। यदि ऐसा होता है शरीर की सतह और आहार नली के बीच पार संदूषण की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता है, क्योंकि खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति केवल मक्खी के शरीर की सतह पर सूचित किया जाना चाहिए।
  4. मक्खी सतह disinfecting के बाद, एक बाँझ 60 मिमी डिस्पोजेबल पेट्री डिश के लिए तो अतिरिक्त पानी और निकालने के लिए autoclaved कागज तौलिया का एक टुकड़ा को हस्तांतरण।
  5. एक विदारक गुंजाइश के तहत पेट्री डिश प्लेस और dipteran परिवारों 20,21 के लिए दिचोतोमोउस कुंजियों का उपयोग प्रजातियों स्तर के लिए उड़ान भरने की पहचान।
  6. धीरे aseptically मक्खी के बाहर गुदा और पूरे आहार नली (ए) खींचने के लिए और autoclaved ठीक टिप संदंश का प्रयोग 0.5 मिमी zirconia / सिलिका के साथ पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) BPW के 1 मिलीलीटर युक्त एक और बाँझ 2 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण मोती (BPW-ए)। लेबल वेंव्यक्तिगत मक्खी और मक्खी (यानी, 1 ए) के शरीर के अंग के लिए चयनित एक ही नंबर के साथ ई ट्यूब।
  7. एक सेल Disruptor का उपयोग कर 10 मिनट - 5 के लिए अच्छी तरह से BPW-ए युक्त ट्यूब मिलाएं। प्रोटोकॉल के बाकी प्रदर्शन करते हुए 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  8. वाउचर और / या लंबी अवधि के लिए नमूना दुकान, एक स्वच्छ 2 मिलीलीटर ट्यूब में मक्खी के शेष रखें और 1 जोड़ने के लिए - 95% इथेनॉल के 2 मिलीलीटर।

3. प्राथमिक और माध्यमिक संवर्धन

  1. नमूना संख्या और मक्खी के शरीर के अंग के अनुसार मीडिया वाले सभी प्राथमिक और माध्यमिक संवर्धन ट्यूबों लेबल।
  2. एक बाँझ हुड के तहत, निम्न मीडिया वाले 2 मिलीलीटर ट्यूब बाँझ को BPW-एस (सतह) के 300 μl स्थानांतरण:
    1. साल्मोनेला के लिए, पूर्व गर्म (42 डिग्री सेल्सियस) BPW के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। 24 घंटा - 22 के लिए 42.5 डिग्री सेल्सियस पर एक recirculating पानी के स्नान में सेते हैं। माध्यमिक संवर्धन के लिए, 400 & # करने के लिए समृद्ध BPW के 100 μl हस्तांतरण181; पहले से बाँझ क्लस्टर ट्यूबों में रखा पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मस्तिष्क दिल अर्क (भी) शोरबा के एल। तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. Cronobacter के लिए, novobiocin साथ पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) BPW के 1 मिलीलीटर (; वालेस, एम, व्यक्तिगत संचार 10 मिलीग्राम / एल) का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, प्राथमिक संवर्धन के रूप में पूरक (vancomycin और cefsulodin) के साथ आर एंड एफ Enterobacter sakazakii संवर्धन शोरबा के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। 26 घंटा - 22 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। माध्यमिक संवर्धन के लिए, पहले से बाँझ क्लस्टर ट्यूबों में रखा पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) BHI शोरबा के 400 μl को novobiocin साथ समृद्ध BPW के 100 μl हस्तांतरण। तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. एल के लिए monocytogenes, चयनात्मक पूरक के साथ हौसले से तैयार आर टी 24 लिस्टेरिया संवर्धन शोरबा (24 Leb) के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। 44 ± 5 ​​घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। कोई माध्यमिक संवर्धन एल का पता लगाने के लिए आवश्यक है monocytogenes। BPW-ए के रूप में चिह्नित ट्यूब का उपयोग करके उपरोक्त 3.2.3 - दोहराएँ 3.2.1 कदम।

लक्ष्य खाद्यजनित पैथोजन के प्रवर्धन और पता लगाने के लिए पीसीआर आधारित प्रणाली 4. तैयारी

4-8 साल्मोनेला (साल्मोनेला 2 मानक परख किट), Cronobacter प्रजातियों (ई sakazakii मानक परख किट), और लिस्टेरिया monocytogenes के लिए स्क्रीन के लिए एक वाणिज्यिक पीसीआर cycler / डिटेक्टर सिस्टम, एक कंप्यूटर कार्य केंद्र, और तैयार करने के लिए उपयोग किट का उपयोग कदम (एल 24E परख किट monocytogenes)। स्टैंडर्ड assays के पीसीआर अंत बिंदु का पता लगाने का उपयोग करें। प्रत्येक किट डबल असहाय डीएनए के लिए बाध्य है, जब एक प्रतिदीप्ति संकेत उत्सर्जन करता है कि एक intercalating डाई के साथ पीसीआर तैयार की गोलियां शामिल हैं। संकेत सकारात्मक या नकारात्मक रूप में सॉफ्टवेयर के द्वारा व्याख्या की है कि एक पिघलने वक्र पैदा करने, पीसीआर प्रणाली कार्यक्रम का पता लगाने के चरण के दौरान कब्जा कर लिया है।

  1. Manufactu के द्वारा निर्दिष्ट के रूप में अभिकर्मकों और उपकरण तैयारप्रत्येक लक्ष्य खाद्य जनित रोगज़नक़ प्रति RER प्रोटोकॉल।
    नोट: साल्मोनेला और Cronobacter का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल एल का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल जबकि एक एक कदम सेल प्रक्रिया की आवश्यकता होती है monocytogenes एक दो कदम सेल प्रक्रिया (क्रमश: 5 वर्गों और 6 देखें) की आवश्यकता है।
  2. लक्ष्य रोगज़नक़ के लिए विशेष कार्यक्रम का चयन स्वचालित हीटिंग ब्लॉक चालू करें। (- 6.2 कदम देखने एल सेल के भाग 2 monocytogenes के लिए) और हीटिंग ब्लॉकों का मार्गदर्शन कर रहे हैं अगर वैकल्पिक रूप से, (। साल्मोनेला के लिए, Cronobacter एसपीपी, और एल monocytogenes) 37 डिग्री सेल्सियस या 55 ± 2 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट 95 ± 3 डिग्री सेल्सियस।
  3. कम से कम दो घंटे के लिए 8 डिग्री सेल्सियस - अन्यथा 2 पर उन्हें ठंडा ठंडा ब्लॉक हे / एन प्रशीतित किया गया है कि सुनिश्चित करें।
  4. पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली के कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, निर्माता के निर्देशों का पालन एक रैक फ़ाइल बनाएँ।
  5. लेबल और क्लस्टर की व्यवस्थाट्यूब रैक फ़ाइल के अनुसार, रैक में सेल अभिकर्मक युक्त।
  6. पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली साधन इनिशियलाइज़।

5. साल्मोनेला और Cronobacter की जांच के लिए Lysis सम्पन्न

  1. Lysis बफर में से एक 12 मिलीलीटर की बोतल के लिए प्रोटीज के 150 μl जोड़कर सेल अभिकर्मक तैयार करें।
  2. पहले से लेबल किया क्लस्टर ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए सेल अभिकर्मक के 200 μl स्थानांतरण।
    नोट: - 2 सप्ताह के लिए 8 डिग्री सेल्सियस सेल अभिकर्मक युक्त क्लस्टर ट्यूबों 2 पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. माध्यमिक समृद्ध नमूने के 20 μl, लंबे पिपेट सुझावों हस्तांतरण का उपयोग सेल अभिकर्मक के 200 μl युक्त क्लस्टर ट्यूबों इसी के लिए (चरणों 3.2.1 और 3.2.2 देखें)। प्रत्येक नमूने के लिए नए पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
    नोट: पीसीआर सकारात्मक / नकारात्मक नमूनों की आगे की पुष्टि के विश्लेषण के लिए आर टी (Cronobacter) रेफ्रिजरेटर (साल्मोनेला) में या कम से प्राथमिक और माध्यमिक संवर्धन से ट्यूबों रखें। सेल अभिकर्मक के 200 μl युक्त क्लस्टर ट्यूबों के लिए बाँझ BHI मीडिया के 20 μl जोड़कर नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें।
  4. सेल अभिकर्मक के 200 μl युक्त क्लस्टर ट्यूबों के लिए किसी भी ज्ञात साल्मोनेला या Cronobacter तनाव की (BHI में उगाई) हे / एन बैक्टीरियल संस्कृतियों के 20 μl जोड़कर सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें।
  5. कैप क्लस्टर ट्यूबों कसकर कैपिंग उपकरण का उपयोग करने के लिए सुरक्षित और।
  6. लक्ष्य रोगज़नक़ के लिए विशेष कार्यक्रम का चयन करने के बाद स्वचालित हीटिंग ब्लॉक में क्लस्टर ट्यूबों के रैक रखें। वैकल्पिक रूप से, 10 मिनट के लिए 95 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा पीछा 20 मिनट के लिए 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस, पर क्लस्टर ट्यूबों सेते हैं। 5 मिनट के लिए - (8 डिग्री सेल्सियस 2) अंत में, ब्लॉक ठंडा करने के लिए क्लस्टर ट्यूबों हस्तांतरण।
    नोट: lysate युक्त क्लस्टर ट्यूबों को दो सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।

6. एल की जांच के लिए Lysis सम्पन्न monocytogenes

  1. के हिस्से के एक सम्पन्नइस प्रकार के रूप lysis:
    1. पूरी तरह thawed lysing एजेंट एक की बोतल के लिए बाँझ विआयनीकृत पानी की 1.8 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: स्टोर 2 पर एजेंट एक lysing - उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक 8 डिग्री सेल्सियस। अप करने के लिए 6 महीने के लिए - (30 डिग्री सेल्सियस 20) आरटी पर खोलने और गिराए, स्टोर करने के बाद।
    2. 1 अनुपात (पतला lysing एजेंट 1 के 40 μl और प्रत्येक नमूना प्रति एजेंट दो lysing के 10 μl): एक 4 में एजेंटों के एक और दो lysing जुडा है। संयुक्त lysing एजेंटों के स्थानांतरण 50 μl ट्यूब क्लस्टर के लिए। 4 घंटे के भीतर मिश्रण का प्रयोग करें।
    3. प्राथमिक समृद्ध नमूना के 500 μl जोड़ें संयुक्त lysing एजेंटों के 50 μl युक्त क्लस्टर ट्यूब (कदम 3.2.3 देखें)।
    4. संयुक्त lysing एजेंटों के 50 μl बाँझ 24 Leb के 500 μl जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें।
    5. / एन एल ओ के 500 μl जोड़कर एक सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें monocytogenes संस्कृति संयुक्त lysing एजेंटों के 50 μl के लिए 24 Leb में हो।
    6. क्लस्टर ट्यूब टोपी धीरे और जगह मिश्रण30 मिनट के लिए 37 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग ब्लॉक में।
      नोट: पीसीआर सकारात्मक / नकारात्मक नमूनों की आगे की पुष्टि के विश्लेषण के लिए फ्रिज में प्राथमिक संवर्धन से ट्यूबों रखें।
  2. इस प्रकार के रूप सेल के भाग 2 का पालन:
    1. चरणों 5.1 और 5.2 में निर्देश के रूप में सेल अभिकर्मक तैयार करें।
    2. का प्रयोग लंबे पिपेट सुझावों सेल अभिकर्मक के 200 μl युक्त क्लस्टर ट्यूबों के लिए भाग एक lysate के 20 μl हस्तांतरण। प्रत्येक नमूने के लिए नए पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
    3. कैप क्लस्टर ट्यूबों कसकर कैपिंग उपकरण का उपयोग करने के लिए सुरक्षित और।
    4. एल के लिए विशेष कार्यक्रम का चयन स्वचालित हीटिंग ब्लॉक में जगह क्लस्टर ट्यूबों monocytogenes। वैकल्पिक रूप से, 10 मिनट के लिए 95 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा पीछा 30 मिनट के लिए 55 ± 2 डिग्री सेल्सियस, पर क्लस्टर ट्यूबों सेते हैं। 5 मिनट के लिए - (8 डिग्री सेल्सियस 2) अंत में, ब्लॉक ठंडा करने के लिए क्लस्टर ट्यूबों हस्तांतरण।
      नोट: lysate युक्त क्लस्टर ट्यूबों को दो सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।

7. हाइड्रेट पीसीआर-तैयार गोलियाँ

  1. एक ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) पीसीआर ठंडा ब्लॉक का चयन करें और डालने पर एक पीसीआर ट्यूब रैक जगह है।
  2. रैक फ़ाइल के अनुसार, धारक में लक्ष्य खाद्य जनित रोगज़नक़ के लिए (प्रत्येक किट के साथ शामिल है) पीसीआर तैयार गोलियाँ युक्त पीसीआर ट्यूब इसी रखें।
  3. Decapping उपकरण का उपयोग, ध्यान से पीसीआर-ट्यूब से टोपी को हटा दें। टोपियां त्यागें और प्रत्येक ट्यूब एक गोली जिसमें सत्यापित करें।
  4. स्थानांतरण (साल्मोनेला और Cronobacter के लिए) 50 μl या विशिष्ट पीसीआर ट्यूबों के लिए lysate के (एल monocytogenes के लिए) 30 μl। नई ऑप्टिकल टोपी का प्रयोग करें और कैपिंग उपकरण का उपयोग पीसीआर ट्यूब पर कसकर सुरक्षित।
    नोट: - पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली में लोड तक 8 डिग्री सेल्सियस पीसीआर तैयार गोलियों से lysate जोड़ने के बाद, नमूने 2 पर ठंडा रहना चाहिए। पीसीआर ट्यूबों पूरी मात्रा नीचे टी में है विश्वास दिलाता हूं कि कुछ सेकंड के लिए 2500 XG पर centrifuged किया जा सकता हैवह ट्यूब।
  5. साधन दराज खोलकर पीसीआर cycler / पहचान प्रणाली साधन में पीसीआर ट्यूब लोड करें।
  6. दराज में कुओं में पीसीआर ट्यूबों के रैक प्लेस और ट्यूबों सही ढंग से बैठे हैं कि जाँच करें।
  7. दराज बंद करो और निर्माता प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित के रूप में कार्यक्रम आरंभ करें।
    नोट: पीसीआर आधारित साधन प्रत्येक खाद्य जनित रोगज़नक़ के लिए साइकिल चालन के मापदंडों के पूर्व निर्धारित किया गया है।
  8. पीसीआर साइकिल स्थिति पट्टी कार्यक्रम का प्रवर्धन भाग चल रहा है यह दर्शाता है कि एक नीले रंग की पट्टी प्रदर्शित करता है कि जाँच करें।
    नोट: - पूरा करने के लिए 3.5 घंटा मानक पीसीआर assays के लिए, पूरे कार्यक्रम (प्रवर्धन और पहचान) के प्रसंस्करण समय लगभग 3 लेता है।

8. समीक्षा परिणाम

  1. प्रसंस्करण के बाद पूरा हो गया है, स्क्रीन के नमूने और समीक्षा के परिणामों को दूर करने के लिए पीसीआर आधारित प्रणाली साधन से संकेतों का पालन करें।
  2. लक्ष्य खाद्य जनित रोगज़नक़ (या तो नमूने में मौजूद है, तोसतह या मक्खी की आहार नली) अच्छी तरह से एक 'प्लस' चिह्न (सकारात्मक) के साथ लाल है। रोगज़नक़ अनुपस्थित है, तो अच्छी तरह से एक 'शून्य' चिह्न (नकारात्मक) के साथ हरे रंग की है।
  3. अच्छी तरह से केंद्र में एक लाल रंग की पट्टी के साथ पीले रंग की है, तो यह एक संकेत त्रुटि इंगित करता है।

पीसीआर सकारात्मक परिणाम से बैक्टीरियल रोगज़नक़ों 9. अलगाव

  1. (एल monocytogenes के लिए) प्राथमिक या माध्यमिक से पीसीआर पॉजिटिव थे कि उन नमूनों के संवर्धन (साल्मोनेला और Cronobacter के लिए) का चयन ट्यूबों। इस प्रकार है: पीसीआर नकारात्मक रहे थे कि नमूने के 5% और आगे बढ़ना - इसके अलावा, बेतरतीब ढंग से 3 का चयन
  2. साल्मोनेला के लिए:
    1. 10 Rappaport-Vassiliadis (आर वी) मध्यम मिलीलीटर और tetrathionate के 1 एमएल (टीटी) शोरबा के लिए माध्यमिक संवर्धन मीडिया के 100 μl जोड़ें। 24 घंटा - 22 के लिए एक रीसर्क्युलेटिंग नहाने के पानी में 42.5 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
    2. प्रत्येक, आर.वी. एक की ऊष्मायन, लकीर एक 3 मिमी loopful (10 μl) के बादविस्मुट sulfite (बी एस) अग्रवाल, सिलोज़ लाइसिन desoxycholate (XLD) अगर पर डी टीटी मीडिया, और Hektoen आंतों (एचई) अगर। 24 घंटा - 22 के लिए 35 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    3. ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक मीडिया पर ठेठ साल्मोनेला कालोनियों की उपस्थिति के लिए प्लेटों की जांच। कोई अलग कालोनियों कई उप-संवर्धन कदम के बाद प्राप्त किया जा सकता है, तो नकारात्मक रूप में नमूना पर विचार और पीसीआर आधारित प्रणाली के लिए एक झूठी सकारात्मक रूप में रिपोर्ट करें।
      नोट: विशिष्ट साल्मोनेला कालोनियों के लिए विशिष्ट मीडिया 22 देखने पर। पांच प्रकल्पित ठेठ साल्मोनेला कालोनियों का चयन करें और बी एस, XLD पर उन्हें उपसंस्कृति, या वह पृथक / एकल कालोनियों का शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त कर रहे हैं जब तक।
    4. एक शुद्ध कॉलोनी का चयन करें और, इस तरह के VITEK दो पहचान कार्ड या एपीआई जैव रासायनिक पहचान प्रणाली के रूप में जैव रासायनिक वाणिज्यिक परीक्षण का उपयोग निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्रकल्पित साल्मोनेला की पहचान।
  3. Cronobacter के लिए: <राजभाषा>
  4. स्ट्रीक ऐसे आर एंड एफ Enterobacter sakazakii (Cronobacter) वर्णजनीय चढ़ाना मध्यम, और / या ChromID Sakazakii अग्रवाल के रूप में वर्णजनीय संस्कृति मीडिया की दो प्लेटों पर माध्यमिक संवर्धन मीडिया के एक 3 मिमी loopful (10 μl)। 24 घंटा - 22 के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
  5. ऊष्मायन के बाद, (नीले ग्रे नीले रंग-काला) ठेठ Cronobacter कालोनियों की उपस्थिति के लिए प्लेटों की जांच। 5 प्रकल्पित Cronobacter कालोनियों का चयन करें और पृथक / एकल कालोनियों का शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त कर रहे हैं जब तक आर एंड एफ Enterobacter sakazakii (Cronobacter) वर्णजनीय चढ़ाना मध्यम, ChromID Sakazakii अग्रवाल, या टीएसए पर उन्हें उपसंस्कृति।
    नोट: कोई अलग कालोनियों कई उप-संवर्धन कदम के बाद प्राप्त किया जा सकता है, तो नकारात्मक रूप में नमूना पर विचार और पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली के लिए एक झूठी सकारात्मक रूप में रिपोर्ट करें।
  6. एक शुद्ध कॉलोनी का चयन करें और जैव रासायनिक व्यावसायिकता का उपयोग करके प्रकल्पित Cronobacter की पहचाननिर्माता के निर्देशों का पालन ऐसी VITEK दो पहचान कार्ड या एपीआई 20E जैव रासायनिक पहचान प्रणाली के रूप में सामाजिक परीक्षण,।
  • एल के लिए monocytogenes:
    1. स्ट्रीक दीप्ति लिस्टेरिया अगर की दो प्लेटों (BLA) पर प्राथमिक संवर्धन मीडिया के एक 3 मिमी loopful (10 μl)। 26 घंटा - 22 के लिए 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
    2. ऊष्मायन के बाद, प्रकल्पित एल की उपस्थिति के लिए प्लेटों की जांच monocytogenes (नीले-हरे रंग का) कालोनियों। का चयन 5 प्रकल्पित एल monocytogenes कालोनियों और पृथक / एकल कालोनियों का शुद्ध संस्कृतियों प्राप्त करने तक BLA पर उन्हें उपसंस्कृति। 26 घंटा - एक अतिरिक्त 22 के लिए 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर नकारात्मक प्लेटें-सेते पुन।
    3. एक शुद्ध कॉलोनी का चयन करें और प्रकल्पित एल की पहचान निर्माता की मैं निम्नलिखित, ऐसे VITEK दो पहचान कार्ड या एपीआई लिस्टेरिया जैव रासायनिक पहचान प्रणाली के रूप में वाणिज्यिक जैव रासायनिक परीक्षण का उपयोग करके monocytogenesnstructions।
  • कीड़ों से अलग प्रकल्पित खाद्य जनित रोगजनकों आगे की पुष्टि की और एक संदर्भ प्रयोगशाला में serotyped किया जाना चाहिए।
  • Representative Results

    सी - यह प्रोटोकॉल पहले प्रयोगात्मक तरल मक्खी भोजन (2% पाउडर दूध) युक्त धारावाहिक dilutions (10 8 CFU / एमएल 10 2) के साथ 24 घंटे के लिए तंग आ गया कि प्रयोगशाला-पाला घर मक्खियों का एक सेट पर calibrated किया गया था sakazakii, एस enterica, एल monocytogenes, या सी जेजुनी (एन = 21 प्रत्येक बैक्टीरियल रोगज़नक़ के लिए)। पीसीआर आधारित प्रणाली शरीर की सतह और प्रयोगात्मक तंग आ गया एक भी की आहार नली से बैक्टीरिया के निम्नतम स्तर (10 2 CFU / एमएल) का पता लगाने में सक्षम था जब तक संवर्धन मीडिया के साथ-साथ ऊष्मायन समय और तापमान प्रत्येक खाद्य जनित रोगज़नक़ के लिए समायोजित किया गया मक्खी। प्रोटोकॉल खंड में वर्णित संवर्धन मीडिया और शर्तों का उपयोग, पीसीआर आधारित प्रणाली सी का पता चला sakazakii, एस enterica, और एल बैक्टीरियल inocula> 10 3 CFU / एमएल (चित्रा 1 ए) के साथ खिलाया मक्खियों की 100% के शरीर की सतह से monocytogenes। मक्खियों 10 से तंग आ चुके थे जब2 CFU / एमएल, सी का पता लगाने का प्रतिशत sakazakii, एस enterica, और एल उनके शरीर की सतह से monocytogenes 100%, 66%, और 33%, क्रमशः (चित्रा 1 ए) था। पीसीआर आधारित प्रणाली को भी प्रतिशत ≥33% (चित्रा 1 बी) में सभी जीवाणु सांद्रता के साथ खिलाया मक्खियों की आहार नली से इन तीनों खाद्य जनित रोगजनकों का पता चला। हालांकि, सी का पता लगाने के प्रयोगशाला-पाला मक्खियों प्रयोगात्मक तरल खाद्य उच्चतम बैक्टीरियल inoculum (10 8 CFU / एमएल) को रोकने के साथ खिलाया गया जब जेजुनी ही हासिल की थी। इसलिए, सी जेजुनी इस पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली का उपयोग करते हुए मक्खियों व्यक्ति synanthropic गंदगी से परीक्षण किया जा सकता है कि खाद्य जनित रोगजनकों के समूह से बाहर रखा गया था।

    इस मानकीकृत प्रोटोकॉल के साथ, हम Cronobacter एसपीपी की व्यापकता का निर्धारण करने में सक्षम थे। एस enterica, और एल शरीर की सतह और / या वें से monocytogenesव्यक्तिगत रूप से और aseptically थे एम सहित कम से कम छह प्रजातियों के प्रतिनिधि थे 5 एकत्र गंदगी मक्खियों वाशिंगटन, डीसी के महानगरीय क्षेत्र में स्थित दस शहरी रेस्तरां के कचरे के डिब्बे क्षेत्र से पकड़ा है कि 100 जंगली मक्खियों के ई भोजनप्रणाली domestica (47%), Lucilia cuprina (33%), एल sericata (14%), Cochliomyia macellaria (2%), Sarcophaga haemorrhoidalis (2%), और Ophyra leucostoma (1%)। एक मक्खी ही परिवार के स्तर के लिए पहचान की गई थी (Anthomyiidae, 1%)। सतह-कीटाणुशोधन प्रोटोकॉल कोई बैक्टीरिया विकास के लिए प्रत्येक व्यक्ति के लिए उड़ान भरने के अंतिम कीटाणुशोधन कुल्ला से पानी के लिए टीएसए प्लेटों पर मनाया गया, क्योंकि मक्खी के शरीर के अंगों के बीच पार संदूषण से बचने में प्रभावी था। इस प्रकार, एक भेद प्रत्येक मक्खी के शरीर के अंगों पर मौजूद खाद्य जनित बैक्टीरिया के बीच किया जा सकता है।

    कोई झूठी सकारात्मक शरीर की सतह के नमूने और की आहार नली से पता चला रहे थेव्यक्तिगत मक्खियों एस का पता लगाने के लिए इस वाणिज्यिक पीसीआर आधारित प्रणाली का उपयोग करते समय enterica और एल monocytogenes, और अगर प्लेटों पर व्यवहार्य रोगाणुओं की पुष्टि पीसीआर सकारात्मक परिणामों के साथ समझौते में था। हालांकि, यह Cronobacter एसपीपी का शुद्ध संस्कृतियों को अलग-थलग करने के लिए संभव नहीं था। सभी पीसीआर सकारात्मक नमूने से। इसलिए, द्वारा इस रोगज़नक़ का पता लगाने पीसीआर आधारित (; 9/18 50%) और आहार नली (48%; 16/33) एकल जंगली पकड़ा मक्खियों की प्रणाली शरीर की सतह से झूठी सकारात्मक दिखाया। विशिष्ट मीडिया पर चढ़ाया गया है कि बेतरतीब ढंग से चुनी पीसीआर नकारात्मक नमूने, खाद्य जनित रोगजनकों के अभाव की पुष्टि की। Cronobacter एसपीपी का पता लगाने के लिए इस वाणिज्यिक पीसीआर आधारित प्रणाली का उपयोग इसलिए, जब कोई झूठी नकारात्मक नमूनों में से किसी से पता चला रहे थे।, एस enterica, या एल monocytogenes।

    केवल रोगज़नक़ अलग है और इस बात की पुष्टि की गई थी जहां उन पीसीआर सकारात्मक नमूने सकारात्मक विचार किया गयाऔर सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए भी शामिल है। जंगली पकड़ा गंदगी मक्खियों की आहार नली में खाद्य जनित रोगजनकों के समग्र उपस्थिति (DF = 1, पी = 0.0087 χ 2 = 6.8772) शरीर की सतह पर की तुलना में काफी अधिक था। पाचन नहरों का 22% और एकत्र जंगली मक्खियों के शरीर सतहों के 8% तीन खाद्य जनित रोगजनकों के कम से कम एक के लिए (चित्रा 2) सकारात्मक थे। कुल मिलाकर, Cronobacter एसपीपी के प्रसार। एस के प्रसार से, शरीर सतहों या एकत्र मक्खियों के पाचन नहरों पर या तो (फिशर सटीक परीक्षण पी = 0.0165 19%) सांख्यिकीय अधिक था enterica (7%) और एल monocytogenes (4%)। प्रत्येक बैक्टीरियल रोगज़नक़ (चित्रा 3 के लिए मक्खियों के शरीर के अंगों के बीच जोड़ो तुलना जब प्रदर्शन हालांकि, कोई सांख्यिकीय मतभेद मनाया गया; Cronobacter के लिए फिशर सटीक परीक्षण पी = 0.1464, पी = 0.1184 है, और पी = 0.6212एसपीपी।, एस enterica, और एल monocytogenes, क्रमशः)। मक्खियों से कोई नहीं का मूल्यांकन सभी तीन रोगजनकों के लिए सकारात्मक थे। हालांकि, मक्खियों (दो एल cuprina और एक एल sericata) किया साल्मोनेला एसपीपी के तीन। और मैं. सतह पर या भोजनप्रणाली में monocytogenes।

    चित्र 1
    (ए) के शरीर की सतह और (बी) के विभिन्न बैक्टीरियल inocula युक्त तरल भोजन से तंग आ चुके व्यक्ति प्रयोगशाला-पाला घर मक्खियों की आहार नली से Cronobacter sakazakii, सैल्मोनेला एन्ट्रिका, लिस्टेरिया monocytogenes, और कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी चित्रा 1. जांच स्तरों (एन = प्रत्येक बैक्टीरियल रोगज़नक़ के लिए 21, एन प्रत्येक बैक्टीरियल एकाग्रता प्रति = 3)।

    चित्र 2 शरीर सतहों और व्यक्तिगत मक्खियों के पाचन नहरों की चित्रा 2 प्रतिशत लक्ष्य खाद्य जनित रोगजनकों से किसी के लिए सकारात्मक पाया।

    चित्र तीन
    Cronobacter एसपीपी की चित्रा 3. प्रसार।, सैल्मोनेला एन्ट्रिका, और शरीर की सतह से लिस्टेरिया monocytogenes और synanthropic जंगली पकड़ा मक्खियों के भोजनप्रणाली। सूचना दी पी मूल्यों शरीर की सतह और प्रत्येक बैक्टीरियल रोगज़नक़ के लिए आहार नली के बीच जोड़ो में तुलना से कर रहे हैं (फिशर सटीक परीक्षण, पी मूल्य <0.05 सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है)। कॉपीराइट © अमेरिकी माइक्रोबायोलॉजी के लिए सोसायटी, एप्लाइड के जर्नल और पर्यावरण माइक्रोबायोलॉजी 78 (22): 7891-902, 2012 Doi: 10.1128 / AEM.02195-12।

    Discussion

    सही रूप में खाद्य पदार्थ या भोजन से संबंधित वातावरण 13,15 में एक भी मक्खी की उपस्थिति के भोजन से संबंधित जोखिम का आकलन करने के लिए आवश्यक जानकारी शामिल नहीं हो सकता है कि प्रोटोकॉल के एक महान विविधता का इस्तेमाल किया है जंगली कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता चला है कि पिछले अध्ययनों 23,24। यहाँ, हम इस मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग, यह पता लगाने के लिए और Cronobacter एसपीपी को अलग-थलग करने के लिए संभव है कि प्रदर्शन किया।, एस enterica, और एल शरीर की सतह और जंगली में पकड़ा एकल मक्खियों की आहार नली से monocytogenes। कीड़े लक्ष्य खाद्य जनित रोगज़नक़ की कम संख्या और अन्य स्वदेशी microbiota 25,26 की उच्च संख्या ले सकते हैं, क्योंकि यह प्रोटोकॉल लक्ष्य खाद्य जनित रोगज़नक़ का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए विशिष्ट संस्कृति मीडिया में नमूने के प्राथमिक (और कभी कभी माध्यमिक) संवर्धन की आवश्यकता है । पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली से परिणाम देते लिए (लगभग 30 घंटा के भीतर प्राप्त किया गयाCronobacter एसपीपी के ction है। और एस enterica) और शुरू में नमूने के प्रसंस्करण के बाद एल monocytogenes) का पता लगाने के लिए 48 घंटा (। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल विश्वसनीय के रूप में भी तेजी से और खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए एक एकल मक्खी स्क्रीन करने के लिए काफी संवेदनशील है।

    व्यवहार्य जीवाणुओं की पीसीआर सकारात्मक परिणाम की पुष्टि और अलगाव कई प्रयोगशालाओं के मानक संचालन प्रक्रिया का हिस्सा है। इसके अलावा, महामारी विज्ञान के प्रयोजनों के लिए, पीसीआर सकारात्मक नमूनों से शुद्ध बैक्टीरियल संस्कृतियों आगे की पुष्टि करें और जैव रासायनिक, प्रतिरक्षाविज्ञानी, या आनुवंशिक तरीकों का उपयोग खाद्य जनित रोगज़नक़ सीरोटाइप के लिए आवश्यक हैं। कोई झूठी सकारात्मक मनाया गया हालांकि एस का पता लगाने के लिए जब enterica और एल एकल जंगली पकड़ा मक्खियों के शरीर के अंगों से monocytogenes, इस प्रोटोकॉल का उपयोग, हम Cronobacter एसपीपी के लिए झूठी सकारात्मक की एक 50% की दर से ऊपर पाया। यह पता चलता है कि जीनस Cronobact के लिए पीसीआर आधारित पहचान प्रणालीएर मक्खियों द्वारा किए गए अत्यधिक जटिल microbiota के बीच मौजूद अन्य Enterobacteriaceae के साथ पार प्रतिक्रिया हो सकती है। इस प्रकार, अलगाव और पीसीआर सकारात्मक नमूनों से जीनस Cronobacter का शुद्ध कालोनियों की शुद्धि का मूल्यांकन अन्य रोगज़नक़ों की तुलना में अधिक चयनात्मक चढ़ाना की आवश्यकता होती है।

    इस प्रोटोकॉल में मुख्य रूप से Cronobacter एसपीपी की उपस्थिति के लिए व्यक्तिगत जंगली पकड़ा मक्खियों स्क्रीन करने के लिए मानकीकृत किया गया है।, एस enterica, और एल एक वाणिज्यिक पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली का उपयोग करते हुए monocytogenes। H7 (या तो ई कोलाई O157 का उपयोग करते हुए: H7 सांसद मानक परख किट या ई कोलाई हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी आसानी से इस तरह enterohemorrhagic ई कोलाई O157 के रूप में अन्य खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए एकल मक्खियों के शरीर के अंगों स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया गया था O157: वास्तविक समय परख किट H7) और Shiga-toxigenic अप्रकाशित कोली (एसटीईसी) समूह (वास्तविक समय एसटीईसी सुइट का उपयोग), प्राप्त संवेदनशीलता> 80% (एड डेटा)। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल संभावित रोगों (तिलचट्टे और चींटियों) वैक्टर में जाना जाता है कि अन्य कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन इस क्षेत्र में और अधिक शोध की जरूरत है।

    खाद्य जनित बीमारी फैलने जांच बहुत गतिशील हैं और विशिष्ट स्थिति जा रहा है और स्थानीय पर्यावरण 12,27 जांच के अनुसार भिन्न हो सकते हैं कि एक बहु कदम प्रक्रिया शामिल है। वे भविष्य बीमारियों को रोकने के द्वारा तत्काल सार्वजनिक स्वास्थ्य सुरक्षा प्रदान करते हैं, क्योंकि इन जांच के लिए महत्वपूर्ण हैं। साथ ही, इन जांच खाद्य जनित सूक्ष्मजीवों का प्रसार कर रहे हैं जिसके द्वारा नए तंत्र को स्पष्ट, और अनुसंधान के 28 के लिए नए क्षेत्रों के लिए नेतृत्व कि महत्वपूर्ण सवाल उठा सकते हैं। खोजी तकनीक के साथ-साथ, मानकीकृत तेजी से, और संवेदनशील प्रोटोकॉल व्यक्ति कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए जरूरी हैं। इस मानकीकृत प्रोटोकॉल डब्ल्यू, aseptically मक्खियों की तरह कीड़े इकट्ठा करने का अवसर खोलता हैhich एक पर्यावरण नमूना कार्यक्रम के हिस्से के रूप में, खाद्य जनित बैक्टीरियल रोगज़नक़ वेक्टर कर सकते हैं। इस से प्राप्त किया जा सकता है कि महामारी विज्ञान की जानकारी कीड़ों द्वारा खाद्य जनित रोगजनकों के संचरण के तंत्र की एक सही तस्वीर के निर्माण में उपयोग की होगी (यानी, जोखिम समय की लंबाई:, लैंडिंग मक्खियों बनाम लैंडिंग defecating, और regurgitating द्वारा एक मक्खी)।

    कोई केवल उपयुक्त प्रणाली का मतलब द्वारा अंत में, यहाँ वर्णित वाणिज्यिक पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक है और पीसीआर प्रवर्धन और एक जीनस-स्तर amplicon के दृश्य को सरल है, भले ही यह है। समृद्ध नमूने से lysate वैकल्पिक रूप से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रजाति विशिष्ट प्राइमर जोड़े का उपयोग करके खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए उनके उपयोग करने से पहले प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Bismuth sulfite (BS) agar Fisher Scientific R452402 *Multiple suppliers.
    Brain heart infusion (BHI) broth Becton, Dickson and Company 299070 *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers.
    Brilliance Listeria agar (BLA) Fisher Scientific CM1080B *Multiple suppliers.
    Buffered peptone water (BPW) Becton, Dickson and Company 212367 *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers.
    Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) Fisher Scientific CM1055B *Multiple suppliers.
    chromID Sakazakii Agar bioMérieux 43741 *Call for information: 800.682.2666
    R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium R & F Laboratories Various *Call for information: +1.630.969.530
    R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement R & F Laboratories Various *Call for information: +1.630.969.530
    Hektoen enteric (HE) agar Fisher Scientific OXCM0419B *Multiple suppliers.
    24 Listeria enrichment broth (24LEB) Oxoid CM1107 *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers.
    Listeria selective enrichment supplement Oxoid SR0243 *Multiple suppliers.
    Novobiocin Fisher Scientific OXSR0181E *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C
    Vancomycin hydrochloride hydrate Sigma Aldrich 861987 Store at 2-8 °C
    Cefsulodin sodium salt hydrate Sigma Aldrich C8145 Store at 2-8 °C
    Rappaport-Vassiliadis (RV) medium Fisher Scientific CM0669B *Multiple suppliers.
    Tetrathionate (TT) Broth Becton, Dickson and Company 249120 *Multiple suppliers.
    Trypticase soy agar (TSA) Becton, Dickson and Company 236930 *Multiple suppliers.
    Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar Becton, Dickson and Company 221284 *Multiple suppliers.
    API Biochemical identification system bioMérieux Various *Call for information: +1.800.682.2666
    VITEK 2: Product Safety bioMérieux Various *Call for information: +1.800.682.2667
    BAX System Q7 DuPont
    BAX E. sakazakii Standard assay kit DuPont D11801836
    BAX L. monocytogenes 24E assay kit DuPont D13608125
    BAX Salmonella 2 Standard assay kit DuPont D14368501
    Capping tool DuPont D11677028
    Decapping tool DuPont D11134095
    PCR tube rack/holder DuPont D12701663
    Featherweight forceps, wide tip BioQuip 4750 Sterilize before use. Multiple suppliers.
    Fine point, straight tip forceps BioQuip 4731 Sterilize before use. Multiple suppliers.
    Zirconia/silica beads, 0.5 mm Bio Spec Products, Inc. 11079105z Multiple suppliers.
    Petri dishes - 60X15mm Fisher Scientific 08-772B Multiple suppliers.
    Disposable inoculating loops, 10µL Fisher Scientific 22-363-606 Multiple suppliers.
    L-shaped cell spreaders Fisher Scientific 14-665-230 Multiple suppliers.
    Microcentrifuge tubes, 2 ml Fisher Scientific Various Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers.
    Cluster tubes Fisher Scientific 05-500-13
    Cluster tubes caps Fisher Scientific 05-500-23
    Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers.
    Sterile deionized water Multiple suppliers.
    Sterile distilled water Multiple suppliers.
    Ethyl alcohol 190 proof *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers.
    Genie cell disruptor, 120V - for 1.5ml and 2.0ml microtubes Scientific Industries, Inc. SI-D238 Multiple suppliers.
    Heating block Multiple suppliers.
    Cooling block Multiple suppliers.
    Recirculating water bath Multiple suppliers.
    Stereo microscope Multiple suppliers.
    Centrifuge Multiple suppliers.
    Incubator Multiple suppliers.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    व्यक्तिगत गंदगी मक्खियों से खाद्यजनित बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की जांच
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    Pava-Ripoll, M., Pearson, R. E. G., Miller, A. K., Ziobro, G. C. Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies. J. Vis. Exp. (96), e52372, doi:10.3791/52372 (2015).More

    Pava-Ripoll, M., Pearson, R. E. G., Miller, A. K., Ziobro, G. C. Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies. J. Vis. Exp. (96), e52372, doi:10.3791/52372 (2015).

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