A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.
There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.
वे भोजन या खाद्य संपर्क सतहों और बर्तन करने के लिए 1 रोगज़नक़ों फैल सकता है क्योंकि कीड़े भोजन से संबंधित रोगों के संचरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कीड़ों के अलावा, मक्खियों, तिलचट्टे, और चींटियों खाद्य जनित रोगजनकों के प्रसार के पक्ष में है कि व्यवहार दिखा रहे हैं। इन कार्यों मना और मल, endophily (प्रवेश करने इमारतों), और synanthropy (मनुष्यों के साथ cohabiting), खस्ताहाल बात के साथ एक संघ में शामिल दो। ।। इस तरह के साल्मोनेला एसपीपी के रूप में खाद्य जनित रोगजनकों, लिस्टेरिया monocytogenes, कैम्पिलोबैक्टर एसपीपी, Escherichia कोलाई O157: H7, और जीनस Cronobacter (पूर्व Enterobacter sakazakii) के सदस्यों के कीड़ों को 3-5 से प्रेषित किए जाने की सूचना दी गई है। Synanthropic गंदगी यंत्रवत् उनके दूषित शरीर सतहों से रोगजनकों स्थानांतरित द्वारा खाद्य जनित बैक्टीरिया फैल मक्खियों। हालांकि, मक्खियों की आहार नली में खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति में तीन गुना तक हो सकता हैउनके शरीर सतहों (शरीर, सिर, पैर, और पंख) 5 पर मनाया है कि अधिक से अधिक से अधिक। खाद्य जनित रोगजनकों भी शरीर की सतह 6,7 पर की तुलना में और कुछ मामलों में समय का एक बड़ा लंबाई के लिए उड़ान भरने की आहार नली में रह सकते हैं, वे मक्खी के पाचन तंत्र 4,8,9 बस्तियां, गुणा करने के लिए सक्षम हैं। वे आगे शौच और ऊर्ध्वनिक्षेप 10,11 के माध्यम से खाद्य जनित रोगजनकों फैल सकता है क्योंकि यह मक्खियों के वेक्टर क्षमता बढ़ जाती है।
आजकल, अधिक तेजी से खाद्य जनित बीमारी के प्रकोप का पता लगाने में सक्षम हैं कि निगरानी प्रणाली वहाँ सुधार कर रहे हैं। खाद्य जनित प्रकोप जांच के प्रदर्शन, वहीं सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों संक्रमण का स्रोत (ओं) या वाहन (ओं) हो सकता है कि भोजन के लिए देखो। जांचकर्ता भी भोजन दूषित हो गया था कि कैसे पता लगाने के लिए शामिल सुविधा (या सुविधाओं) के एक पर्यावरण आकलन प्रदर्शन कर सकते हैं और जांच 12 के भाग के रूप में नमूने एकत्र कर सकते हैं। सैरवैज्ञानिक साहित्य, खाद्य जनित रोगजनकों के वाहक के रूप में कीड़ों के विषय में एक विशेष खाद्य जनित बीमारी फैलने चुनौतीपूर्ण हो गया है के कारण रोगज़नक़ के वैक्टर के रूप में कीड़ों को जोड़ने की विशाल राशि ite। कीड़े aseptically खाद्य जनित प्रकोप जांच के दौरान पर्यावरण नमूना कार्यक्रमों के भाग के रूप में एकत्र किया जा रहा नहीं कर रहे हैं, क्योंकि यह मुख्य रूप से है। कीड़े, एक पर्यावरण नमूना प्रक्रिया, एक ही कीट जगह में होने की जरूरत से खाद्य जनित रोगजनकों पता लगाने के लिए एक, मानकीकृत तेजी से, संवेदनशील और विश्वसनीय प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में, खाद्य जनित रोगजनकों के प्रसार के पक्ष में है कि व्यवहार प्रदर्शित है कि विशेष रूप से उन लोगों में शामिल करने के लिए।
कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए पारंपरिक चढ़ाना तकनीक श्रमसाध्य हैं और कीट की जन्मजात खानेवाला microbiota का तेजी से विकास पर काबू पाने के लिए अलग-अलग संस्कृति मीडिया में लक्ष्य बैक्टीरिया की प्रतिस्पर्धात्मक विकास पर निर्भर करते हैं। बीए के साथ कीड़े संबद्ध कर दिया है कि अध्ययन के अधिकांशcterial रोगज़नक़ों एक साथ कई कीड़े पूलिंग के बजाय व्यक्तिगत आधार प्रति एक पर रोगाणुओं की उपस्थिति की पहचान के द्वारा विधि की संवेदनशीलता बढ़ गई हैं। इस प्रकार, उन अध्ययनों रोगज़नक़ों 13-18 पाए गए जहां कीट के शरीर के अंग को अलग नहीं किया था। इस महामारी विज्ञान के निहितार्थ हो सकते हैं और विभिन्न शमन रणनीतियों को जन्म दे सकती रूप में खाद्य जनित रोगजनकों शरीर की सतह पर या एक व्यक्ति कीट की आहार नली में स्थित हैं कि क्या पहचान करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। मैकेनिकल वैक्टर के रूप में, केवल संक्रमण के संभावित उच्च स्तर पर स्थानांतरित करने के रोगाणुओं की संभावना में वृद्धि बहना उन है कि मक्खियों, जबकि उनके शरीर की सतह से बैक्टीरिया के निम्न स्तर के हस्तांतरण और भोजन पर ख़ारिज हो सकता है थोड़े समय के लिए भोजन पर कि भूमि मक्खियों। नतीजतन, यह एक व्यक्ति कीट प्रति एक खाद्य जनित रोगज़नक़ की व्यापकता का अनुमान लगाने के लिए और है कि कीट जहां बैक्टीरिया पी के शरीर के अंग को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है athogen स्थित है।
खाद्य जनित रोगजनकों पता लगाने के लिए संस्कृति स्वतंत्र विधियों का उपयोग तेजी से कार्यान्वित किया जा रहा है, भले ही वे व्यावसायिक रूप से एक भी कीट से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है। वर्तमान में, व्यावसायिक रूप से उद्योग और नियामक एजेंसियों द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा है कि खाद्य पदार्थों से खाद्य जनित रोगजनकों का तेजी से पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं कि आणविक प्रोटोकॉल वहाँ पुष्टि कर रहे हैं। इन विधियों खाद्य पदार्थों के नमूनों की एक किस्म में रोगजनकों का पता लगाने के लिए डीएनए आधारित सिस्टम शामिल हैं। आणविक प्रोटोकॉल पारंपरिक चढ़ाना तरीकों की तुलना में तेजी से कर रहे हैं, नमूना के संवर्धन अभी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) में जरूरत बैक्टीरियल रोगज़नक़ के 10 2 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) आधारित विधियों 19 की संवेदनशीलता का स्तर प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, पीसीआर सकारात्मक नमूनों से शुद्ध बैक्टीरियल कालोनियों के अलगाव के उचित तरीकों का उपयोग कर रोगज़नक़ पुष्टि करने के लिए आवश्यक है।
सामग्री "> इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य शरीर की सतह से खाद्य जनित बैक्टीरिया का पता लगाने और एक भी मक्खी की आहार नली के लिए भोजन और पर्यावरण के नमूनों से रोगज़नक़ों पता लगाने के लिए और आगे उन अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर आधारित प्रणाली का मानकीकरण करने के लिए है यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का samples.The संवेदनशीलता से रोगजनकों पहले प्रयोगात्मक प्रत्येक बैक्टीरियल रोगज़नक़ के धारावाहिक dilutions के साथ खिलाया गया कि प्रयोगशाला-पाला वयस्क घर मक्खियों (Musca domestica) के साथ calibrated किया गया था। मानकीकृत प्रोटोकॉल बाद में सर्वेक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था 100 जंगली पकड़ा उनके शरीर सतहों और / या पाचन नहरों से खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए मक्खियों। यह मानकीकृत प्रोटोकॉल सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं खाद्य जनित जब प्रदर्शन पर्यावरण नमूना कार्यक्रम के हिस्से के रूप में उन्हें इकट्ठा करने की संभावना के लिए अनुमति देता है, कीड़ों से उत्पन्न स्वास्थ्य खतरों का पता लगाने के लिए अनुमति देगा प्रकोप जांच।सही रूप में खाद्य पदार्थ या भोजन से संबंधित वातावरण 13,15 में एक भी मक्खी की उपस्थिति के भोजन से संबंधित जोखिम का आकलन करने के लिए आवश्यक जानकारी शामिल नहीं हो सकता है कि प्रोटोकॉल के एक महान विविधता का इस्तेमाल किया है जंगली कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता चला है कि पिछले अध्ययनों 23,24। यहाँ, हम इस मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग, यह पता लगाने के लिए और Cronobacter एसपीपी को अलग-थलग करने के लिए संभव है कि प्रदर्शन किया।, एस enterica, और एल शरीर की सतह और जंगली में पकड़ा एकल मक्खियों की आहार नली से monocytogenes। कीड़े लक्ष्य खाद्य जनित रोगज़नक़ की कम संख्या और अन्य स्वदेशी microbiota 25,26 की उच्च संख्या ले सकते हैं, क्योंकि यह प्रोटोकॉल लक्ष्य खाद्य जनित रोगज़नक़ का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए विशिष्ट संस्कृति मीडिया में नमूने के प्राथमिक (और कभी कभी माध्यमिक) संवर्धन की आवश्यकता है । पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली से परिणाम देते लिए (लगभग 30 घंटा के भीतर प्राप्त किया गयाCronobacter एसपीपी के ction है। और एस enterica) और शुरू में नमूने के प्रसंस्करण के बाद एल monocytogenes) का पता लगाने के लिए 48 घंटा (। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल विश्वसनीय के रूप में भी तेजी से और खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए एक एकल मक्खी स्क्रीन करने के लिए काफी संवेदनशील है।
व्यवहार्य जीवाणुओं की पीसीआर सकारात्मक परिणाम की पुष्टि और अलगाव कई प्रयोगशालाओं के मानक संचालन प्रक्रिया का हिस्सा है। इसके अलावा, महामारी विज्ञान के प्रयोजनों के लिए, पीसीआर सकारात्मक नमूनों से शुद्ध बैक्टीरियल संस्कृतियों आगे की पुष्टि करें और जैव रासायनिक, प्रतिरक्षाविज्ञानी, या आनुवंशिक तरीकों का उपयोग खाद्य जनित रोगज़नक़ सीरोटाइप के लिए आवश्यक हैं। कोई झूठी सकारात्मक मनाया गया हालांकि एस का पता लगाने के लिए जब enterica और एल एकल जंगली पकड़ा मक्खियों के शरीर के अंगों से monocytogenes, इस प्रोटोकॉल का उपयोग, हम Cronobacter एसपीपी के लिए झूठी सकारात्मक की एक 50% की दर से ऊपर पाया। यह पता चलता है कि जीनस Cronobact के लिए पीसीआर आधारित पहचान प्रणालीएर मक्खियों द्वारा किए गए अत्यधिक जटिल microbiota के बीच मौजूद अन्य Enterobacteriaceae के साथ पार प्रतिक्रिया हो सकती है। इस प्रकार, अलगाव और पीसीआर सकारात्मक नमूनों से जीनस Cronobacter का शुद्ध कालोनियों की शुद्धि का मूल्यांकन अन्य रोगज़नक़ों की तुलना में अधिक चयनात्मक चढ़ाना की आवश्यकता होती है।
इस प्रोटोकॉल में मुख्य रूप से Cronobacter एसपीपी की उपस्थिति के लिए व्यक्तिगत जंगली पकड़ा मक्खियों स्क्रीन करने के लिए मानकीकृत किया गया है।, एस enterica, और एल एक वाणिज्यिक पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली का उपयोग करते हुए monocytogenes। H7 (या तो ई कोलाई O157 का उपयोग करते हुए: H7 सांसद मानक परख किट या ई कोलाई हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी आसानी से इस तरह enterohemorrhagic ई कोलाई O157 के रूप में अन्य खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए एकल मक्खियों के शरीर के अंगों स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया गया था O157: वास्तविक समय परख किट H7) और Shiga-toxigenic ई अप्रकाशित कोली (एसटीईसी) समूह (वास्तविक समय एसटीईसी सुइट का उपयोग), प्राप्त संवेदनशीलता> 80% (एड डेटा)। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल संभावित रोगों (तिलचट्टे और चींटियों) वैक्टर में जाना जाता है कि अन्य कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन इस क्षेत्र में और अधिक शोध की जरूरत है।
खाद्य जनित बीमारी फैलने जांच बहुत गतिशील हैं और विशिष्ट स्थिति जा रहा है और स्थानीय पर्यावरण 12,27 जांच के अनुसार भिन्न हो सकते हैं कि एक बहु कदम प्रक्रिया शामिल है। वे भविष्य बीमारियों को रोकने के द्वारा तत्काल सार्वजनिक स्वास्थ्य सुरक्षा प्रदान करते हैं, क्योंकि इन जांच के लिए महत्वपूर्ण हैं। साथ ही, इन जांच खाद्य जनित सूक्ष्मजीवों का प्रसार कर रहे हैं जिसके द्वारा नए तंत्र को स्पष्ट, और अनुसंधान के 28 के लिए नए क्षेत्रों के लिए नेतृत्व कि महत्वपूर्ण सवाल उठा सकते हैं। खोजी तकनीक के साथ-साथ, मानकीकृत तेजी से, और संवेदनशील प्रोटोकॉल व्यक्ति कीड़ों से खाद्य जनित रोगजनकों का पता लगाने के लिए जरूरी हैं। इस मानकीकृत प्रोटोकॉल डब्ल्यू, aseptically मक्खियों की तरह कीड़े इकट्ठा करने का अवसर खोलता हैhich एक पर्यावरण नमूना कार्यक्रम के हिस्से के रूप में, खाद्य जनित बैक्टीरियल रोगज़नक़ वेक्टर कर सकते हैं। इस से प्राप्त किया जा सकता है कि महामारी विज्ञान की जानकारी कीड़ों द्वारा खाद्य जनित रोगजनकों के संचरण के तंत्र की एक सही तस्वीर के निर्माण में उपयोग की होगी (यानी, जोखिम समय की लंबाई:, लैंडिंग मक्खियों बनाम लैंडिंग defecating, और regurgitating द्वारा एक मक्खी)।
कोई केवल उपयुक्त प्रणाली का मतलब द्वारा अंत में, यहाँ वर्णित वाणिज्यिक पीसीआर आधारित पहचान प्रणाली का उपयोग करने के लिए व्यावहारिक है और पीसीआर प्रवर्धन और एक जीनस-स्तर amplicon के दृश्य को सरल है, भले ही यह है। समृद्ध नमूने से lysate वैकल्पिक रूप से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध प्रजाति विशिष्ट प्राइमर जोड़े का उपयोग करके खाद्य जनित रोगजनकों की उपस्थिति के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए उनके उपयोग करने से पहले प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.
Bismuth sulfite (BS) agar | Fisher Scientific | R452402 | *Multiple suppliers. |
Brain heart infusion (BHI) broth | Becton, Dickson and Company | 299070 | *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Listeria agar (BLA) | Fisher Scientific | CM1080B | *Multiple suppliers. |
Buffered peptone water (BPW) | Becton, Dickson and Company | 212367 | *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) | Fisher Scientific | CM1055B | *Multiple suppliers. |
chromID Sakazakii Agar | bioMérieux | 43741 | *Call for information: 800.682.2666 |
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
Hektoen enteric (HE) agar | Fisher Scientific | OXCM0419B | *Multiple suppliers. |
24 Listeria enrichment broth (24LEB) | Oxoid | CM1107 | *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers. |
Listeria selective enrichment supplement | Oxoid | SR0243 | *Multiple suppliers. |
Novobiocin | Fisher Scientific | OXSR0181E | *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C |
Vancomycin hydrochloride hydrate | Sigma Aldrich | 861987 | Store at 2-8 °C |
Cefsulodin sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | C8145 | Store at 2-8 °C |
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium | Fisher Scientific | CM0669B | *Multiple suppliers. |
Tetrathionate (TT) Broth | Becton, Dickson and Company | 249120 | *Multiple suppliers. |
Trypticase soy agar (TSA) | Becton, Dickson and Company | 236930 | *Multiple suppliers. |
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar | Becton, Dickson and Company | 221284 | *Multiple suppliers. |
API Biochemical identification system | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2666 |
VITEK 2: Product Safety | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2667 |
BAX System Q7 | DuPont | N/A | |
BAX E. sakazakii Standard assay kit | DuPont | D11801836 | * |
BAX L. monocytogenes 24E assay kit | DuPont | D13608125 | * |
BAX Salmonella 2 Standard assay kit | DuPont | D14368501 | * |
Capping tool | DuPont | D11677028 | |
Decapping tool | DuPont | D11134095 | |
PCR tube rack/holder | DuPont | D12701663 | |
Featherweight forceps, wide tip | BioQuip | 4750 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Fine point, straight tip forceps | BioQuip | 4731 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Zirconia/silica beads, 0.5 mm | Bio Spec Products, Inc. | 11079105z | Multiple suppliers. |
Petri dishes – 60X15mm | Fisher Scientific | 08-772B | Multiple suppliers. |
Disposable inoculating loops, 10µL | Fisher Scientific | 22-363-606 | Multiple suppliers. |
L-shaped cell spreaders | Fisher Scientific | 14-665-230 | Multiple suppliers. |
Microcentrifuge tubes, 2 ml | Fisher Scientific | Various | Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers. |
Cluster tubes | Fisher Scientific | 05-500-13 | |
Cluster tubes caps | Fisher Scientific | 05-500-23 | |
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) | N/A | N/A | *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers. |
Sterile deionized water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Sterile distilled water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Ethyl alcohol 190 proof | N/A | N/A | *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers. |
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes | Scientific Industries, Inc. | SI-D238 | Multiple suppliers. |
Heating block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Cooling block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Recirculating water bath | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Stereo microscope | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Centrifuge | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Incubator | N/A | N/A | Multiple suppliers. |