A PCR-based protocol was adapted to detect Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes from body surfaces and alimentary canals of individual wild-caught flies. The goal of this protocol is to detect and isolate bacterial pathogens from individual insects collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations.
There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a particular foodborne illness outbreak has been challenging. This is because insects are not being aseptically collected as part of an environmental sampling program during foodborne outbreak investigations and because there is not a standardized method to detect foodborne bacteria from individual insects. To take a step towards solving this problem, we adapted a protocol from a commercially available PCR-based system that detects foodborne pathogens from food and environmental samples, to detect foodborne pathogens from individual flies.Using this standardized protocol, we surveyed 100 wild-caught flies for the presence of Cronobacter spp., Salmonella enterica, and Listeria monocytogenes and demonstrated that it was possible to detect and further isolate these pathogens from the body surface and the alimentary canal of a single fly. Twenty-two percent of the alimentary canals and 8% of the body surfaces from collected wild flies were positive for at least one of the three foodborne pathogens. The prevalence of Cronobacter spp. on either body part of the flies was statistically higher (19%) than the prevalence of S. enterica (7%) and L.monocytogenes (4%). No false positives were observed when detecting S. enterica and L. monocytogenes using this PCR-based system because pure bacterial cultures were obtained from all PCR-positive results. However, pure Cronobacter colonies were not obtained from about 50% of PCR-positive samples, suggesting that the PCR-based detection system for this pathogen cross-reacts with other Enterobacteriaceae present among the highly complex microbiota carried by wild flies. The standardized protocol presented here will allow laboratories to detect bacterial foodborne pathogens from aseptically collected insects, thereby giving public health officials another line of evidence to find out how the food was contaminated when performing foodborne outbreak investigations.
Insekter spiller en viktig rolle ved overføring av mat-relaterte sykdommer, fordi de kan spre patogener til næringsmidler eller næringsmiddelkontaktflater og redskaper 1. Blant insekter, fluer, kakerlakker, og maur utvise atferd som favoriserer spredning av matbårne patogener. Disse atferd inkluderer en forening med råtnende saken, nekter og avføring, endophily (inn bygninger), og synanthropy (samboer med mennesker) 2. .. Matbårne patogener som Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Escherichia coli O157: H7, og medlemmer av slekten Cronobacter (tidligere Enterobacter sakazakii) har blitt rapportert å bli sendt av insekter 3-5. Synanthropic skitt fluer mekanisk spre matbårne bakterier ved å overføre patogener fra sine forurensede kroppsoverflater. Imidlertid kan tilstedeværelsen av matbårne patogene i fordøyelseskanalen av fluer være opptil tre gangerstørre enn det som ble observert på sine kroppsoverflater (kropp, hode, ben og vinger) 5. Matbårne patogener kan også forbli i flua fordøyelsessystemet kanalen for et større tidsrom enn på kroppsoverflaten 6,7 og i noen tilfeller, er de i stand til å formere seg, kolonisere flua fordøyelseskanalen 4,8,9. Dette øker vektorpotensialet av fluer fordi de kan ytterligere spre matbårne patogener gjennom avføring og oppstøt 10,11.
I dag er det bedre overvåkningssystemer som er i stand til å oppdage matbårne sykdomsutbrudd raskere. Mens du utfører matbårne utbrudd undersøkelser, offentlige helsemyndigheter se etter mat som kan være kilden (e) eller kjøretøy (er) for infeksjon. Etterforskerne kan også utføre en miljøvurdering av anlegget (eller anlegg) som er involvert for å finne ut hvordan maten var forurenset og kan samle inn prøver som en del av etterforskningen 12. Despite den enorme mengden av vitenskapelig litteratur om insekter som bærere av matbårne patogener, linking insekter som vektorer av patogenet som forårsaker en bestemt matbåren sykdom utbrudd har vært utfordrende. Dette er hovedsakelig fordi insekter ikke blir aseptisk samlet som en del av miljø prøvetaking programmer under matbårne utbrudd undersøkelser. Å inkludere insekter, spesielt de som utviser atferd som favoriserer spredning av matbårne patogener, som en del av en miljøprøvetaking prosedyre, en standardisert, rask, følsom og pålitelig protokoll for å oppdage matbårne patogener fra en enkelt insekt må være på plass.
Tradisjonelle plette teknikker for påvisning av matbårne patogene fra insekter er arbeidskrevende og avhengig av den konkurrerende vekst av mål-bakterier i forskjellige dyrkningsmedier for å overvinne den raske veksten av det medfødte kommensal bakterieflora av insekt. De fleste av studiene som har forbundet insekter med bacterial patogener har øket følsomheten for fremgangsmåten ved å blande sammen flere insekter i stedet for identifisering av nærværet av patogener i en per individ basis. Således har disse studier ikke skille hoveddelen av insekt hvor patogener ble funnet 13-18. Evnen til å identifisere om matbårne patogener er plassert på kroppsoverflaten eller i fordøyelseskanalen til et individ insekt er viktig da dette kan ha epidemiologiske implikasjoner og kan føre til ulike løsningsstrategier. Som mekaniske vektorer, fluer som landet på mat for en kort tid kan bare overføre lave nivåer av bakterier fra sin kroppsoverflate, mens de fluer som regurgitate og defekt på mat øke sannsynligheten for overføring av patogener ved potensielt høyere nivåer av infeksjon. Følgelig er det viktig å estimere forekomsten av matbårne patogene per en individuell insekt og å skille hoveddelen av at insekt hvor den bakterielle p athogen ligger.
Selv om bruken av kultur-uavhengige metoder for å detektere matbårne patogene i økende grad blir gjennomført, har de ikke vært kommersielt anvendt for å detektere matbårne patogener fra en enkelt insekt. Foreløpig er det validert molekylære protokoller som er kommersielt tilgjengelig for rask påvisning av matbårne patogener fra matvarer som blir brukt av industri og offentlige instanser. Disse metodene omfatter DNA-baserte systemer for påvisning av patogener i en rekke matvareprøver. Selv om molekyl protokoller er raskere enn tradisjonelle metoder kontaktflate, er anriking av prøven fremdeles nødvendig for å oppnå følsomhetsnivået for 10 to kolonidannende enheter (CFU) av det bakterielle patogenet nødvendig i polymerase kjedereaksjon (PCR) -baserte Metode 19. Dessuten er isolering av rene bakteriekolonier fra PCR-positive prøvene er nødvendig for å bekrefte patogenet ved hjelp av egnede metoder.
innhold "> Formålet med denne protokollen er å standardisere en kommersielt tilgjengelig PCR-basert system som brukes til å detektere patogener fra mat og miljøprøver for deteksjon av matbårne bakterier fra kroppen overflate og fordøyelseskanalen av et enkelt fly, og å isolere dem videre patogener fra samples.The følsomhet av protokollen beskrevet her ble først kalibrert med lab-oppdratt voksen husfluer (Musca domestica) som ble eksperimentelt matet med serielle fortynninger av hver bakteriell patogen. Den standardiserte protokollen ble senere brukt til å kartlegge 100 villfanget flyr for tilstedeværelsen av matbårne patogener fra sine kroppsoverflater og / eller fordøyelses kanalene. Dette vil standardiserte protokollen tillater folkehelse laboratorier for å oppdage helse truslene fra insekter, noe som åpner for muligheten for å samle dem som en del av miljøprøvetakingsprogram når du utfører matbåren utbrudds undersøkelser.Tidligere studier som har påvist matbårne patogener fra ville insekter har brukt et stort utvalg av protokoller som kanskje ikke har den nødvendige informasjonen til å nøyaktig vurdere næringsmiddelrelatert risiko for tilstedeværelsen av en enkel flue i matvarer eller mat-relaterte miljøer 13,15, 23,24. Her viste vi at ved hjelp av denne standardiserte protokollen, er det mulig å påvise og isolere Cronobacter spp., S. ente, og L. monocytogenes fra kroppsoverflaten og fordøyelseskanalen av enkle fluer fanget i naturen. Fordi insekter kan bære lavt antall målet matbåren patogen og høyt antall andre urfolk microbiota 25,26, denne protokollen krever primære (og noen ganger sekundær) berikelse av prøvene i spesifikke kultur media for å øke sensitiviteten for påvisning av målet matbåren patogen . Resultater fra PCR-basert gjenkjenning system ble oppnådd i løpet av ca 30 timer (for DeteDette skjer av Cronobacter spp. og S. ente) og 48 timer (for påvisning av L. monocytogenes) etter først å behandle prøvene. Dermed er denne protokollen pålitelig samt rask og følsom nok til å screene et enkelt fly for tilstedeværelse av matbårne patogene.
Bekreftelse av PCR-positive resultater, og isolering av levedyktige bakterier er en del av standard prosedyre for mange laboratorier. I tillegg, for epidemiologi formål er rene bakteriekulturer fra PCR-positive prøver som kreves for ytterligere å bekrefte og serotype av matbårne patogene ved hjelp av biokjemiske, immunologiske eller genetiske metoder. Selv om ingen falske positiver ble observert når det oppdages S. ente og L. monocytogenes fra kroppsdeler fra enkle villfanget fluer, ved hjelp av denne protokollen, fant vi opp til en 50% rente av falske positive for Cronobacter spp. Dette tyder på at PCR-basert gjenkjenning system for slekten Cronobacteh kan kryssreagere med andre Enterobacteriaceae tilstede blant de svært komplekse microbiota båret av fluer. Således, isolering og rensing av rene kolonier av slekten Cronobacter fra PCR-positive prøvene krever mer selektiv plettering enn evaluert de andre patogener.
Denne protokollen har primært blitt standardisert for å skjerme enkeltvillfanget fluer for tilstedeværelsen av Cronobacter spp., S. ente, og L. monocytogenes ved hjelp av en kommersiell PCR-basert gjenkjenning system. Imidlertid ble denne protokollen også lett tilpasses for å screene kroppsdeler av enkelt fluer for tilstedeværelsen av andre matbårne patogener som enterohemorrhagiske E. coli O157: H7 (enten ved hjelp av E. coli O157: H7 MP standard assay kit eller E. coli O157: H7 i sanntid analysen kit) og Shiga-toxigenic E. coli (STEC) gruppe (ved hjelp av real-time STEC suite), innhenting av følsomhet> 80% (avpublisered data). Dessuten kan denne protokoll potensielt være innrettet til å detektere matbårne patogener fra andre insekter som er kjent vektorer av sykdommer (kakerlakker og maur), men mer forskning på dette området er nødvendig.
Matbåren sykdom utbrudd undersøkelser er svært dynamisk og består av en multi-stegs prosess som kan variere i forhold til den konkrete situasjonen og det lokale miljøet blir undersøkt 12,27. Disse undersøkelser er viktige fordi de gir umiddelbar offentlig helsevern ved å hindre fremtidige sykdommer. I tillegg kan disse undersøkelsene belyse nye mekanismer som matbårne mikroorganismer er spredt, og ta opp viktige spørsmål som fører til nye områder for forskning 28. Etterforskningsmetoder, samt standardiserte, raske, og sensitive protokoller er nødvendige for å påvise matbårne patogener fra enkelte insekter. Denne standardiserte protokollen åpner muligheten til aseptisk samle insekter som fluer, which kan vektor den matbåren bakteriell patogen, som en del av en miljøprøveprogram. Den epidemiologiske opplysninger som kan oppnås av dette ville være til nytte i å konstruere et riktig bilde av mekanismene for overføring av matbårne patogener av insekter (dvs. lengden på eksponeringstiden: et fly ved landing versus fluer landing, avføring, og gulpet opp).
Til slutt, selv om den kommersielle PCR-basert deteksjonssystem som er beskrevet her er praktisk å bruke, og forenkler PCR-amplifisering og visualisering av en genus-nivå amplikon, er det på ingen måte den eneste passende system. Lysatet fra anrikede prøver kan alternativt brukes til å screene med hensyn til nærvær av matbårne patogener ved hjelp av offentlig tilgjengelige artsspesifikk primer-parene. Imidlertid bør deteksjonsfølsomhet påvises før deres bruk.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Ben D. Tall, Yi Chen, and Thomas Hammak from the U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) for critically reviewing the manuscript. The authors also thank Hannah Lee (research internship program, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) for laboratory assistance and David Weingaertner (FDA, CFSAN) for preparing the figure of the schematic overview shown in the video.
Bismuth sulfite (BS) agar | Fisher Scientific | R452402 | *Multiple suppliers. |
Brain heart infusion (BHI) broth | Becton, Dickson and Company | 299070 | *Pre-warmed to 37°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Listeria agar (BLA) | Fisher Scientific | CM1080B | *Multiple suppliers. |
Buffered peptone water (BPW) | Becton, Dickson and Company | 212367 | *Pre-warmed to 37°C or 42°C. Multiple suppliers. |
Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI) | Fisher Scientific | CM1055B | *Multiple suppliers. |
chromID Sakazakii Agar | bioMérieux | 43741 | *Call for information: 800.682.2666 |
R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Chromogenic Plating Medium | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
R & F Enterobacter sakazakiii Enrichment Broth and supplement | R & F Laboratories | Various | *Call for information: +1.630.969.530 |
Hektoen enteric (HE) agar | Fisher Scientific | OXCM0419B | *Multiple suppliers. |
24 Listeria enrichment broth (24LEB) | Oxoid | CM1107 | *Freshly prepared at room-temperature. Multiple suppliers. |
Listeria selective enrichment supplement | Oxoid | SR0243 | *Multiple suppliers. |
Novobiocin | Fisher Scientific | OXSR0181E | *Multiple suppliers. Store at 2-8 °C |
Vancomycin hydrochloride hydrate | Sigma Aldrich | 861987 | Store at 2-8 °C |
Cefsulodin sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | C8145 | Store at 2-8 °C |
Rappaport-Vassiliadis (RV) medium | Fisher Scientific | CM0669B | *Multiple suppliers. |
Tetrathionate (TT) Broth | Becton, Dickson and Company | 249120 | *Multiple suppliers. |
Trypticase soy agar (TSA) | Becton, Dickson and Company | 236930 | *Multiple suppliers. |
Xylose lysine desoxycholate (XLD) agar | Becton, Dickson and Company | 221284 | *Multiple suppliers. |
API Biochemical identification system | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2666 |
VITEK 2: Product Safety | bioMérieux | Various | *Call for information: +1.800.682.2667 |
BAX System Q7 | DuPont | N/A | |
BAX E. sakazakii Standard assay kit | DuPont | D11801836 | * |
BAX L. monocytogenes 24E assay kit | DuPont | D13608125 | * |
BAX Salmonella 2 Standard assay kit | DuPont | D14368501 | * |
Capping tool | DuPont | D11677028 | |
Decapping tool | DuPont | D11134095 | |
PCR tube rack/holder | DuPont | D12701663 | |
Featherweight forceps, wide tip | BioQuip | 4750 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Fine point, straight tip forceps | BioQuip | 4731 | Sterilize before use. Multiple suppliers. |
Zirconia/silica beads, 0.5 mm | Bio Spec Products, Inc. | 11079105z | Multiple suppliers. |
Petri dishes – 60X15mm | Fisher Scientific | 08-772B | Multiple suppliers. |
Disposable inoculating loops, 10µL | Fisher Scientific | 22-363-606 | Multiple suppliers. |
L-shaped cell spreaders | Fisher Scientific | 14-665-230 | Multiple suppliers. |
Microcentrifuge tubes, 2 ml | Fisher Scientific | Various | Sterilize before use when needed. Secure lid is preferred. Multiple suppliers. |
Cluster tubes | Fisher Scientific | 05-500-13 | |
Cluster tubes caps | Fisher Scientific | 05-500-23 | |
Sodium hypochlorite (Liquid chlorine bleach) | N/A | N/A | *Dilute to 0.05% with water. Multiple suppliers. |
Sterile deionized water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Sterile distilled water | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Ethyl alcohol 190 proof | N/A | N/A | *Dilute to 70% with water when needed. Multiple suppliers. |
Genie cell disruptor, 120V – for 1.5ml and 2.0ml microtubes | Scientific Industries, Inc. | SI-D238 | Multiple suppliers. |
Heating block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Cooling block | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Recirculating water bath | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Stereo microscope | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Centrifuge | N/A | N/A | Multiple suppliers. |
Incubator | N/A | N/A | Multiple suppliers. |