Abstract
På grund af det høje niveau af heterogenitet og mutationer forbundet med humane cancere, terapier med enkelt middel eller en kombination regimer, der er målrettet mod den samme vej, er tilbøjelige til at svigte. Der skal lægges vægt på den hæmning af veje, der er ansvarlige for indre og / eller adaptive modstand mod behandling. En aktiv inden for efterforskning er udvikling og afprøvning af DNA reparation inhibitorer, der fremmer virkningen af, og forhindre modstand mod, almindeligt anvendte kemoterapi og strålebehandling. Vi anvendte en ny protokol til at vurdere effektiviteten af BRCA2 hæmning som et middel til at sensibilisere tumorceller for DNA-ødelæggende lægemiddel cisplatin. Tumor cellestofskiftet (forsuring og respiration) blev overvåget i realtid i en periode på 72 timer for at afgrænse behandling effektivitet på et minut for minut basis. I kombination, vi foretaget en vurdering af metastatisk frekvens ved hjælp af en kylling chorioallantoisk membran (CAM) model af ekstravasation og invasion. Detteprotokol omhandler nogle af de svagheder, der almindeligvis anvendes in vitro og in vivo-metoder til at vurdere nye cancer terapi regimer. Det kan bruges som supplement til de fælles metoder såsom celleproliferationsassays, celledødsassays, og in vivo-murine xenografundersøgelser, nærmere at diskriminere blandt kandidat mål og midler, og vælg kun de mest lovende kandidater til videreudvikling.
Introduction
Erhvervet resistens til målrettede og / eller cytotoksisk behandling af kræft er et vigtigt klinisk problem, der kan føre til behandlingssvigt, tilbagefald og øget patient dødelighed 1. På grund af den høje grad af heterogenitet i de fleste tumorer, er det en matematisk sikkerhed for, at en svulst af tilstrækkelig høj celle nummer vil indeholde en delmængde af celler resistente over for enkelte eller kombinerede terapier rettet mod molekylære veje, som disse celler er afhængige for at overleve 2,3. Sådanne tumorceller kan positivt udvalgt til under behandling, hvilket fører til sygdomstilbagefald. Udvikling af nye terapier, der samtidig er målrettet forskellige cancercelleoverlevelse mekanismer, enten før eller efter behandling-medieret udvælgelse, er derfor klinisk vigtig.
Et højt genom ustabilitet og mutation i tumor genomer er en grundlæggende egenskab, som adskiller cancerceller fra ikke-tumor værtsceller 4. Derfor er en useful strategi for at øge effektiviteten af DNA-skadelige kemoterapi og for at forhindre udvikling af resistens er aktivt at hæmme DNA-reparation i tumorceller 5. Dette er en aktiv inden for undersøgelse og en række af hidtil ukendte DNA-reparation mål undersøges i en præ-kliniske omgivelser. Der er udviklet en række lille molekyle eller antisense-baserede inhibitorer af disse mål og undergår tester 6-8. Målet er at identificere de mest lovende prækliniske kandidater og vurdere deres sikkerhed og effekt i kliniske forsøg.
Den høje pris på kliniske forsøg og risikoen for fiasko (for en række forskellige årsager, herunder suboptimal præklinisk evaluering) er formidable hindringer for fremskridt i udviklingen af nye behandlingsformer 9. Brugen af hensigtsmæssige og strenge prækliniske modeller i tilstrækkelig grad vurdere nye terapeutiske mål og kandidat lægemidler kan nedsætte den høje fejlrate af kliniske forsøg 10
Nogle almindeligt anvendte prækliniske metoder til at vurdere effektiviteten af nye anticancer-regimer er: a) måling af evne til at reducere tumorcelleproliferation in vitro (celleproliferationsassays), b) terapi-induceret kapacitetsreduktion af tumorceller til formular vævskultur kolonier (kolonidannelse assays), c) terapi-induceret reduktion i tumorcelle metaboliske aktivitet in vitro (redox-farvestof konvertering), d) terapi-induceret induktion af in vitro tumorcelledød (apoptotisk, nekrotisk, autophagic forbundet med mitose og andre) 11, og e) in vivo terapi-induceret reduktion af vækst eller ablation af menneskelige og mus xenotransplantater 12-14.
En væsentlig svaghed ved de anførte in vitro-metoder er, at ingen af dem giver kontinuerlig real-time evaluering af effekten af kandidat behandlinger. Tværtimod, de giver oplysninger kun på udvalgte, bredt adskilte tidspunkteri løbet af behandlingen. Sådanne målinger har mindsket evne til præcist afspejler størrelsen og timingen af tumor celle respons. In vivo mus xenograftmodeller er også begrænset af høje omkostninger, lang tid at gennemføre, og risiko for suboptimal dosering og behandling timing (planlægning). Desuden er der tegn på, at gnaver xenograftmodeller er begrænsede prædiktorer for klinisk effekt hos mennesker, sammenlignet med in vitro vurdering af svarene fra primære humane tumorceller og etablerede humane tumorcellelinier til kandidatlande terapeutiske interventioner 15,16.
Vi udtænkt en ny kombination protokol til at evaluere nye lægemiddelkombinationer præ-klinisk, på en måde, der behandler de svagheder ved de mere almindelige procedurer anført ovenfor. I stedet for spredning, kolonidannelse eller redox-dye konvertering assays, vi udnyttet en stofskifte måleenhed til at analysere celleadhæsion, respiration, og forsuring i realtidunder hele behandlingsperioden 17. Samtidig undersøgte vi effekten af behandling kombination in vivo ved hjælp af en kylling chorioallantoisk membran (CAM) model for invasion og metastase 18,19. Vi anvendte disse metoder til at vurdere evnen af et antisense-oligonukleotid (ASO) målretning BRCA2 at forstærke effektiviteten af de almindeligt anvendte kemoterapeutiske lægemiddel cisplatin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Følgende protokol blev udviklet til brug med adhærente celler. Ændringer skal anvende den metode, ikke-klæbende celler dyrket i suspension. CAM beskrevne eksperimenter i protokollen, er designet til brug med celler, der udtrykker en fluorescerende markør (f.eks GFP, RFP, etc.). Ni dage gamle kyllingefostre er påkrævet på dag 2 af forsøgsprotokollen for CAM eksperimenter.
1. Forberedelse og transfektion af tumorceller med antisenseoligonukleotider (Asos)
- Aspirer medium fra T75 kolbe (r), der indeholder celler af interesse, vask med 1XPBS, og der tilsættes 2 ml 0,25% trypsin / EDTA. Der tilsættes 10 ml komplet vækstmedium til hver kolbe og overføre cellerne i opløsning til en 50 ml rør. Tæl cellerne og justere lydstyrken, så den endelige koncentration er 1.0x10 5 celler pr.
- Label to grupper af T25-flasker: en gruppe vil indeholde otte kolber, mærket 1-8, og vil være used for real-time stofskifte måling eksperiment; og den anden gruppe vil også indeholde 8 kolber og vil blive anvendt til kylling embryo CAM eksperiment. Tilsæt 2 ml af celler i opløsning til hver kolbe og sted i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
- Næste morgen (dag 0, Time 0), label tre 5 ml rør som følger: kontrol (ikke-targeting ASO eller siRNA), 'mål af interesse "(dvs., rettet ASO eller siRNA), og Lipofectamine 2000 (eller et lignende transfektionsreagens). Fortynd stock ASO løsninger til den passende koncentration med serumfrit medium i passende rør.
- Tilsæt nødvendige mængde transfektionsreagens til passende rør og inkuberes i serumfrit medium i 5 min. Tilsæt transfektionsreagens løsning ASO rør og inkuberes i 20 min.
- Tilsæt 250 pi kontrol ASO transfektionsreagens opløsning til hver af kolberne 1-4 i hver gruppe, og 250pi af 'mål af interesse "ASO transfektionsreagens opløsning til hver af kolberne 5-8 i hver gruppe. Inkuberes i 4 timer (37 ᵒC, 5% CO 2).
- Under inkubation, udføre de trin, der er beskrevet i afsnit 2.1. Efter inkubationen tilsættes 3 ml komplet medium til hver kolbe i CAM forsøgsgruppen og vende tilbage til inkubatoren O / N (37 ᵒC, 5% CO 2). Proces stofskiftet eksperiment gruppen ifølge beskrivelsen i afsnit 2.2. Proces CAM eksperimentet indstilles i henhold til beskrivelsen i punkt 4.
2. biosensorchip Forberedelse og cellepodning
- I et sterilt miljø, omhyggeligt vaske seks biosensor chips med 400 pi PBS. Steriliser chips med 400 pi 70% ethanol i 20 min. Der vaskes tre gange med 400 pi PBS.
- Placer chips inde sterile væv culture retter til at forhindre forurening. Placer tre chips i en skål mærket »kontrol«, og tre i et fad mærket 'mål af interesse «.
- Mærk to 50 ml rør som "kontrol" og "mål af interesse«. Vask cellerne med PBS, og der tilsættes et passende volumen af 0,25% trypsin / EDTA. Vent enkeltlagskulturerne løsnes og indsamle celler fra hver kolbe. Depositum opløsningen i passende rør.
- Tæl celler og justere lydstyrken således at den endelige koncentration er 6.0x10 5 celler / ml. Centrifuger og resuspender cellerne, hvis den oprindelige koncentration er for lav.
- Tilsæt 250 pi af cellen opløsning til hver biosensor chip i den relevante gruppe (i alt 1.25x10 5 celler pr chip). Udfør denne opgave én gruppe ad gangen for at minimere risikoen for forvirrende chips. Placer sterile skåle indeholdende chips inde i et fugtigt kammer for at forhindre fordampning, og placere luftfugtighed chamber i inkubatoren O / N (37 ᵒC, 5% CO 2).
- Den næste morgen (dag 1), forsigtigt aspireres mediet fra hver chip og erstatte det med 250 pi vækstmedium suppleret med 0,2% føtalt bovint serum (FBS) og 1 x penicillin og streptomycin (P / S). Inkuberes i 4 timer (37 ᵒC, 5% CO 2).
3. Metabolisme målesystem Forberedelse og Solution Forberedelse
- Under inkubationen forberede de nødvendige drug løsninger og metabolisme målesystem til den kommende assay.
BEMÆRK: Systemet Metabolismen måling indeholder i alt seks moduler. Hvert modul har plads til en chip per eksperiment.- Opdel assayet i følgende forsøgsgrupper: en chip fra hver af "kontrol" og "mål af interesse" grupper til at modtage køretøj for varigheden af assayet; to chips fra hver gruppe til at modtage medicinsk behandling for en bestemt periode i løbet af enssay, efterfulgt af køretøjet under udvaskning periode.
- For narkotika sensibiliseringsreaktioner undersøgelser, ændre længden, timing og koncentration af lægemiddelbehandling, der passer det særlige lægemiddel pågældende.
BEMÆRK: cisplatin, blev de følgende trin bestemmes empirisk med A549-celler, og kan variere afhængigt af cellelinjen. Udfør alle trin med standard flowhastighed på 4 pl / min.
6 timer vækstmedium + 0,2% FBS og 1 x P / S
24 timer på 6 uM cisplatin i medium + 0,2% FBS 1x P / S
24 timer vækstmedium + 0,2% FBS og 1 x P / S
18 timer vækstmedium + 0,2% FBS og 1 x P / S
4 timer af 0,1% Triton-X
BEMÆRK: Afvigelser fra disse skridt vil kræve beregning at bestemme den nødvendige mængde mellem- og narkotika løsninger baseret på den ønskede flowhastighed og varighed af eksperimentet. De følgende afsnit er baseret på de ovenfor beskrevne trin.
- Label og fyld fjorten 50 ml rør med 50 ml vækstmedium + 0,2% FBS end 1x P / S. Placer seks i en stofskifte målesystem rør rack, seks i en anden, og de resterende to i et tredje rør rack, der også indeholder rør med cisplatin. Forsegl første to stativer med en luftgennemtrængelig membran for at forhindre fordampning.
- Forbered en opløsning af 6 uM cisplatin (af det passende volumen) i medium + 0,2% FBS med 1x P / S. Dispenser den nødvendige mængde cisplatin løsning i fire mærkede 50 ml rør.
- Placer rørene i de resterende fire pladser i tredje stofskifte måling rør rack. Sørg for, at rørene er placeret i de relevante slots, der svarer til de ønskede biomodules. Forsegl rør med en luftgennemtrængelig membran.
- Forbered og mærke seks 50 ml rør og fylde dem med 20 ml af hver af 0,1% Triton-X løsning i medium. Triton-X løsning vil lysere de resterende celler og giver en »nul« for hver chip. Placer rørene i en fjerde stofskifte måleenhed rør rack og forsegle with en luft permable membran for at forhindre overdreven fordampning.
- Læg chips ind i biomodules og initiere eksperimentet.
4. CAM Experiment Drug Treatment og Injection
BEMÆRK: Trinene og proceduren for at forberede kylling embryoner til en CAM eksperiment er beskrevet andetsteds 19
- Begynd behandlingen af CAM eksperiment 48 timer efter transfektion (dag 2). Sub-opdele "kontrol" og "mål af interesse 'grupper i to kolber til køretøj og to for cisplatin. Aspirer mediet fra kolberne og genopbygge med enten 3 ml frisk medium, eller 6 uM cisplatin. Inkuber i 6 timer (37 ᵒC, 5% CO 2).
- Aspirer mediet, vask derefter og Trypsinisér cellerne; indsamle de trypsiniserede celler i opløsning i fire passende mærkede 15 ml rør.
- Centrifuger og vask cellerne tre gange med PBS. Resuspender cellepelleten i 5 ml PBS end tælle cellerne.
- Juster lydstyrken, så koncentrationen endelige celle er 1.0x10 6 celler / ml. Overfør cellen opløsningen i mærkede 5 ml rør til injektion, og placer på is. Vend rørene forsigtigt før injektion for at sikre, at cellerne er godt blandet.
- Afsæt i alt 24 kyllingeembryoner (9 dage gammel) til injektion (6 per gruppe). Udfør injektion under anvendelse af et glas nål fastgjort til et fleksibelt rør forbundet til en 1 ml sprøjte. Den enkelte udfører injektion bør blindet for behandlingsgruppen.
- Ved hjælp af en stereomikroskop, injicere 1.0x10 5-celler i et volumen på 100 ul i den venøse cirkulation af CAM. Brug en langsom, pulserende teknik at injicere den fulde mængde af celler. Ising forsigtigt injektionsstedet med en blød tørre at dæmme op for strømmen af blod og absorbere spild. Mærk hver embryo beholder passende efter hver injektion.
- Bekræfte tilstedeværelsen og distriling af fluorescerende celler i vaskulaturen af CAM efter injektion ved at visualisere dem ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Vær opmærksom på eventuelle embryoner, hvor antallet af tumorceller synes lav, eller distribution er dårlig.
- Placer kyllingeembryoner i et fugtigt kammer og gemme dem i en inkubator (37 ° C, 60% luftfugtighed). Vent 7-9 dage før optælling metastatiske foci.
5. metastatisk Focus Tælling
- I løbet af 7-9 dages inkubationstid, overvåge embryoner og kassere døde. Sørg for at fugt kammer forbliver fugtigt på alle tidspunkter i løbet af inkubationsperioden.
- Ved hjælp af en fluorescerende stereomikroskop ved 20X forstørrelse, scanne hele øvre overflade af embryo CAM i en regelmæssig, grid-lignende mønster.
- Tæl antallet af metastatiske foci i hvert synsfelt, så overensstemmelse mellem nummeret til et endeligt beløb pr embryo. Hvis du gør det for de seks embryoner i hver gruppe vil give et gennemsnitligt antal of metastatiske foci per behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultater og tal tilpasset med tilladelse fra offentliggjorte arbejde 22.
BRCA2 inhibering inducerer et fald i respiration i cisplatin behandlede tumorceller
A549 lungecancerceller Menneskelige behandlet med BRCA2-targeting ASO og cisplatin udviste en tidlig og irreversibel nedgang i respiration, sammenlignet med celler, som kun fik kontrol ASO og cisplatin; Efter 24 timer af cisplatin behandling forskellen i åndedræt mellem BRCA2 ASO og kontrol ASO-behandlede celler var 39% (figur 1A). Vigtigere er det, dette fald i respiration påbegyndt før en påviselig fald i celleadhæsion, hvilket tyder på, at dette skete uafhængigt af ændringer i celle nummer. Respiration begyndte at falde ca. 10 timer før den første observerbare fald i adhæsion, tyder på, at et fald i respiration kan være en formative begivenhed, der går forud for celledød (figur 1B). Ingen forskel i acidification blev observeret under 72 hr eksperiment tidsramme, hvilket tyder på, at BRCA2 ASO og cisplatin behandling har lidt at ingen effekt på glukose metabolisme (figur 1C).
BRCA2 hæmning kombineret med cisplatin behandling nedsætter hyppigheden af metastaser
Menneskelige A549 lungecancerceller blev behandlet med kontrol ASO eller BRCA2 ASO i nærvær eller fravær af cisplatin, og injiceret i den venøse cirkulation af CAM (figur 2A). Ni dage efter injektion, celler behandlet med BRCA2 ASO og cisplatin, udviste en 77% lavere frekvens af metastatiske foci sammenlignet med celler behandlet med kontrol ASO og cisplatin eller BRCA2 ASO alene (figur 2B). Dette antyder, at BRCA2 ASO og cisplatin behandling har potentiale til at mindske eller forebygge metastatisk byrde hos patienter med solide tumorer.
Figur 1. Realtidsovervågning tumor cellevedhæftning, respiration og forsuring. A549-celler blev transficeret med BRCA2 ASO, udpladet på biosensor chips og behandlet med cisplatin i 24 timer ved hjælp af Bionas Discovery System. Målinger af (A) respiration, (B) tilslutning, og (C) forsuring blev udført hver 4 min over en periode på 72 timer. Pink = styre ASO, blå = BRCA2 ASO, grøn = styrer ASO + cisplatin, rød = BRCA2 ASO + cisplatin. Figur tilpasset fra offentliggjorte arbejde med tilladelse 22. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. optælle metastatisk FREkvens ved hjælp af en kylling embryo CAM model. A549-celler transficeret med BRCA2 ASO blev behandlet med cisplatin i 6 timer, og derefter sprøjtet ind i venøse cirkulation af en 9 dage gammel kylling embryo (A). Metastatiske foci (B) (visualiseret under anvendelse af et konfokalt mikroskop med en 40x objektiv) blev talt ni dage efter injektion (C). Figur tilpasset fra offentliggjorte arbejde med tilladelse 22. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af den iboende omkostninger og risiko forbundet med kliniske forsøg, er der et behov for at udvikle bedre og mere stringent præklinisk testmetoder i tilstrækkelig grad vurdere nye antikræftmidler behandlingsregimer. Aktuelle almindeligt anvendte teknikker alle udviser svagheder, som kan begrænse deres evne til at skelne mellem potentielt lovende terapeutiske mål / agenter, og de, der kan være mindre effektiv. Vi udtænkt en protokol til at evaluere nye anti-cancer tilgange, som behandler mange af manglerne ved traditionelle metoder.
Et særligt vigtigt træk ved den beskrevne protokol er evnen til at måle cellulære responser i realtid, og at spore ændringer i metabolisme og vedhæftning minut for minut. Dette giver mulighed for identifikation af peak lægemiddelvirkninger, optimal dosering og en mere detaljeret forståelse af vekselvirkningen mellem komponenterne af lægemiddel kombinationsbehandling. Det giver samtidig indblik i discrete metaboliske ændringer i kræftceller, hvilket er oplysninger, der ikke leveres af celletælling, apoptose, eller dye-konvertering assays. En begrænsning af dette assay er den manglende evne til nøjagtigt at fastslå, hvilken type af celledød, der forekommer under lægemiddelbehandling. Ændringer i rentabiliteten vil blive afspejlet ved ændringer i tilslutning til biosensorchip, men det betyder ikke give oplysninger om den måde, celledød. Det er også muligt at anvende fluorescensmikroskopi og levende celler billeddannende teknikker til at bestemme lignende metaboliske data, og dette kan anvendes i tillæg til de eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol 20,21.
Desuden skal brug af kylling embryo CAM model studere metastatisk frekvens efter behandling er en effektiv måde at afgøre, om et nyt mål, narkotika eller medicin kombination nedsætter hyppigheden af kræftceller, der ekstravasere og / eller invadere omkringliggende væv. Dette er en særlig relevant spørgsmål fra en clinisk synspunkt, fordi metastatisk sygdom forårsager en høj andel af dødeligheden blandt cancerpatienter. En potentiel begrænsende faktor er, at den faktiske lægemiddelbehandling ikke forekommer i CAM. Det forekommer stedet ex vivo og de forbehandlede celler injiceres derefter i CAM. Derfor er denne analyse ikke give oplysninger om narkotika optagelse eller distribution in vivo. Desuden intravenøse CAM injektioner er teknisk udfordrende og kræver betydelig praksis / erfaring.
Vi anvendte denne protokol til at vurdere evnen af en BRCA2 målretning ASO at sensibilisere tumorceller for DNA-ødelæggende lægemiddel cisplatin. Resultaterne af vores eksperimenter identificeret BRCA2 som et lovende mål for terapeutisk angreb, og også begrundelse for yderligere præklinisk udvikling af BRCA2 ASO som kandidat lægemiddel. Vi forestiller denne protokol anvendes til at identificere hidtil ukendte mål for kombinationsbehandling, især i den spirende område DNEn reparation hæmning. Vi føler, at dette protokol vil være bedst brugt som supplement til de mere almindelige teknikker i cancer biologi, i et forsøg på at strengere evaluere nye anti-cancer tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev muliggjort af tilskud til JK fra Ontario Centres of Excellence og Ontario Research Fund.
Vi vil gerne takke Siddika Pardhan og Dr. Peter Ferguson til teknisk bistand under optagelserne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
