Abstract
På grund av den höga graden av heterogenitet och mutationer inneboende i human cancer, monoterapi terapier, eller kombinationsregimer som riktar sig mot samma väg, kommer sannolikt att misslyckas. Tonvikten måste läggas på hämningen av vägar som är ansvariga för inneboende och / eller adaptiv resistens mot terapi. En aktiv område som ska undersökas är utveckling och testning av DNA reparationshämmare som främjar verkan av, och förebygga resistens mot, som vanligen används kemoterapi och strålbehandling. Vi använde en roman protokoll för att utvärdera effektiviteten i BRCA2 inhibition som ett sätt att sensibilisera tumörceller till DNA skadande drog cisplatin. Tumörcellmetabolism (försurning och respiration) övervakades i realtid under en period av 72 timmar för att avgränsa behandlingseffekt på en minut för minut basis. I kombination, utförde vi en bedömning av metastaserad frekvens med en kyckling embryo korioallantoinmembranet (CAM) modell av extravasering och invasion. DettaProtokollet tar upp några av de svagheter som vanligen används in vitro och in vivo-metoder för att utvärdera nya cancerterapikurer. Den kan användas som tillägg till vanliga metoder såsom cellproliferationsanalyser, celldöd analyser och in vivo murina xenograft studier, att närmare diskriminera bland kandidat mål och agenter, och väljer bara de mest lovande kandidaterna för vidare utveckling.
Introduction
Förvärvad resistens till målinriktade och / eller cytotoxiska cancerbehandling är ett viktigt kliniskt problem som kan leda till behandlingssvikt, återfall, och ökad patientdödlighet 1. Med tanke på den höga nivån av heterogenitet i de flesta tumörer är det en matematisk säkerhet att en tumör i tillräckligt hög cellantal kommer att innehålla en delmängd av celler som är resistenta mot enstaka eller kombinerade terapier riktade molekylära vägar som dessa celler är beroende för sin överlevnad 2,3. Sådana tumörceller kan selekteras positivt för under behandlingen, vilket leder till sjukdomsåterfall. Utveckling av nya behandlingsmetoder som samtidigt riktar olika mekanismer cancercellöverlevnad, antingen före eller efter behandling medierad val, är alltså kliniskt viktiga.
En hög nivå av genomet instabilitet och mutation i tumör genomen är en grundläggande egenskap som skiljer cancerceller från icke-tumörvärdceller 4. Följaktligen en useful strategi att öka effektiviteten av DNA-skada kemoterapi och för att förhindra utveckling av resistens är att aktivt hämmar DNA-reparation i tumörceller 5. Detta är en aktiv undersökningsområde och en mängd nya DNA-reparations mål undersöks i en pre-klinisk miljö. Ett antal små molekyler eller antisense-baserade hämmare av dessa mål har utvecklats och genomgår testning 6-8. Målet är att identifiera de mest lovande prekliniska kandidater och utvärdera deras säkerhet och effekt i kliniska prövningar.
De höga kostnaderna för kliniska prövningar och risken för misslyckande (för en rad olika skäl, inklusive suboptimal preklinisk utvärdering) är enorma hinder för framsteg i utvecklingen av nya behandlingsmetoder 9. Användningen av lämpliga och rigorösa prekliniska modeller att adekvat bedöma nya terapeutiska mål och läkemedelskandidater kan minska den höga felfrekvensen av kliniska prövningar 10
Några ofta använda pre-kliniska metoder för att utvärdera effektiviteten av nya anti-cancer regimer är: a) mätning av kapaciteten för att minska tumörcellsproliferation in vitro (cellproliferationsanalyser), b) terapi-inducerade kapacitetsminskning av tumörceller till formulär vävnadsodlingskolonier (kolonibildning analyser), c) terapi-inducerad reduktion i tumörcell metabolisk aktivitet in vitro (redox-färgämne omvandling), d) terapi-inducerad induktion av in vitro-tumörcelldöd (apoptotiska, nekrotiska, autophagic, associerad med mitos och andra) 11, och e) in vivo terapi-inducerad reduktion av tillväxt eller ablation av mänskliga och mus xenotransplantat 12-14.
En stor svaghet i de listade in vitro-metoder är att ingen av dem ge kontinuerligt i realtid utvärdera effekten av kandidatterapier. Snarare ger de uppgifter endast på utvalda, allmänt åtskilda tidpunkterunder behandlingen. Sådana mätningar har minskat kapaciteten att korrekt återge storleken och tidpunkten för tumörcellsvar. In vivo mus xenograft modeller begränsas också av höga kostnader, tid att slutföra, och risken för suboptimal dosering och behandling timing (schemaläggning). Dessutom finns det bevis för att gnagare xenograft modeller är begränsade prediktorer för klinisk effekt hos människor, jämfört med in vitro bedömning av svaren från primära humana tumörceller och etablerade humana tumörcellslinjer till kandidat terapeutiska interventioner 15,16.
Vi utarbetat en ny kombination protokoll för att utvärdera nya läkemedelskombinationer prekliniskt, på ett sätt som tar upp de svagheter de vanligaste förfaranden som anges ovan. I stället för spridning, kolonibildning, eller redox-dye konverterings analyser, utnyttjade vi en ämnesomsättning mätenhet för att analysera celladhesion, andning, och försurning i realtidunder hela behandlingsperioden 17. Samtidigt som vi undersökte effekterna av behandlingskombination in vivo genom att använda en kyckling embryo korioallantoinmembranet (CAM) modell för invasion och metastas 18,19. Vi använde dessa metoder för att utvärdera förmågan hos en antisensoligonukleotid (ASO) inriktning BRCA2 att förstärka effektiviteten av de vanligaste kemoterapeutiska läkemedel cisplatin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBSERVERA: Följande protokoll utformat för användning med vidhäftande celler. Ändringar är skyldiga att tillämpa metoden för icke-vidhäftande celler odlade i suspension. Kammen experimenten som beskrivs i protokollet är utformade för användning med celler som uttrycker en fluorescerande markör (t.ex. GFP, RFP, etc). Nio dagar gamla kycklingembryon krävs på dag 2 av provprotokollet för CAM experiment.
1. Upprättande och Transfektion av tumörceller med antisenseoligonukleotider (ASOS)
- Sug medium från T75 kolv (ar) som innehåller celler av intresse, tvätta med 1XPBS, och tillsätt 2 ml 0,25% trypsin / EDTA. Tillsätt 10 ml komplett tillväxtmedium till varje kolv och överföra celler i lösning till en 50 ml tub. Räkna celler och justera volymen så att den slutliga koncentrationen är 1,0x10 5 celler per ml.
- Etikett två grupper av T25-kolvar: en grupp innehåller åtta kolvar, märkta 1-8, och kommer att vara used för realtids metabolism mätningsexperiment; och den andra gruppen kommer också att innehålla åtta kolvar och kommer att användas för kyckling embryot CAM experiment. Lägg 2 ml celler i lösning till varje kolv och placera i inkubatorn (37 ° C, 5% CO 2 O / N).
- Nästa morgon (dag 0, Tid 0), etikett tre 5 ml rör enligt följande: kontroll (icke-inriktning ASO eller siRNA), "mål av intresse" (dvs., inriktning ASO eller siRNA), och Lipofectamine 2000 (eller en liknande transfektionsreagens). Späd stam ASO lösningar till den lämpliga koncentrationen med serumfritt medium i lämpliga rör.
- Tillsätt erforderlig mängd transfektionsreagens till det lämpliga röret och inkubera i serumfritt medium under 5 minuter. Lägg transfektionen reagenslösningen till ASO rören och inkubera under 20 min.
- Lägg 250 l av kontroll ASO transfektionsreagens lösning till kolvarna 1-4 i varje grupp, samt 250l av "mål av intresse" ASO transfektionsreagens lösning till kolvarna 5-8 i varje grupp. Inkubera i 4 h (37 ᵒC, 5% CO2).
- Under inkubation, utför stegen som beskrivs i avsnitt 2.1. Efter inkubationen, tillsätt 3 ml komplett medium till varje kolv i CAM försöksgruppen och återgå till inkubatorn O / N (37 ᵒC, 5% CO2). Process metabolismen experimentet gruppen enligt beskrivningen i avsnitt 2.2. Process CAM experimentet in enligt beskrivningen i avsnitt 4.
2. Biosensor Chip Förberedelse och Cell Sådd
- I en steril miljö, noggrant tvätta sex biosensorchips med 400 l PBS. Sterilisera flisen med 400 | il av 70% etanol för 20 min. Tvätta tre gånger med 400 ul PBS.
- Placera marker inne steril vävnad culture rätter att förhindra kontaminering. Placera tre marker i en skål märkt "kontroll", och tre i en skål märkt "mål av intresse".
- Märk två 50 ml rör som "kontroll" och "mål av intresse". Tvätta cellerna med PBS och tillsätt en lämplig volym av 0,25% trypsin / EDTA. Vänta tills monolager lossnar och samla cellerna från varje kolv. Insättning lösningen i lämpliga rör.
- Räkna celler och justera volymen så att den slutliga koncentrationen är 6.0x10 5 celler / ml. Centrifugera och återsuspendera cellerna om den ursprungliga koncentrationen är för låg.
- Lägg 250 pl av cellösningen till varje biosensorchip i lämplig grupp (för totalt 1.25x10 5 celler per chip). Utför denna uppgift en grupp i taget för att minimera risken för förvirrande markerna. Placera sterila skålar innehållande flisen inuti en fuktkammare för att förhindra avdunstning, och placera fuktighets chamber i inkubatorn O / N (37 ᵒC, 5% CO2).
- Nästa morgon (dag 1), försiktigt aspirera mediet från varje chip och ersätta det med 250 | il av tillväxtmedium kompletterat med 0,2% fetalt bovint serum (FBS) och 1 x penicillin och streptomycin (P / S). Inkubera i 4 h (37 ᵒC, 5% CO2).
3. Metabolism Mätsystem Förberedelse och lösning Förberedelse
- Under inkubation, förbereda de nödvändiga läkemedelslösningar och system ämnesomsättningen mätningen för den kommande analysen.
OBS: Systemet Metabolismen mätning innehåller totalt sex moduler. Varje modul rymmer ett chip per experiment.- Dela upp analysen i följande experimentgrupper: en chip från var och en av "kontroll" och "mål av intresse" grupper för att ta emot fordon för varaktigheten av analysen; två marker från varje grupp att få läkemedelsbehandling för en definierad tidsperiod under assay, följt av fordonet under washout period.
- För läkemedels sensibilisering studier, ändra längden, timing och koncentration av läkemedelsbehandling för att passa den specifika drogen i fråga.
OBS: För cisplatin, var följande steg bestämmas empiriskt med A549-celler, och kan variera beroende på cellinje. Utför alla stadier med standardflödeshastighet av 4 ul / min.
6 h av tillväxtmedium + 0,2% FBS och 1 x P / S
24 tim på 6 iM cisplatin i medium + 0,2% FBS 1x P / S
24 h av tillväxtmedium + 0,2% FBS och 1 x P / S
18 h av tillväxtmedium + 0,2% FBS och 1 x P / S
4 h av 0,1% Triton-X
OBS: Avvikelser från dessa steg kommer att kräva beräkning för att bestämma erforderlig volym medium och läkemedelslösningar baserade på den önskade flödeshastigheten och varaktigheten av experimentet. Följande avsnitt baseras på de steg som beskrivs ovan.
- Etikett och fyll fjorton 50 ml rör med 50 ml odlingsmedium + 0,2% FBS end 1x P / S. Placera sex i en ämnesomsättning mätsystem provrörsställ, sex i en annan, och de återstående två i ett tredje provrörsställ som också innehåller tuber med cisplatin. Försegla de första två kuggstänger med ett luftgenomträngligt membran för att förhindra avdunstning.
- Bered en lösning av 6 iM cisplatin (av lämplig volym) i medium + 0,2% FBS med 1x P / S. Fördela erforderlig volym cisplatinlösningen till fyra märkta 50 ml rör.
- Placera rören i de återstående fyra spåren i den tredje ämnesomsättningen mätröret rack. Se till att rören är placerade i rätt hål som motsvarar de önskade bioModuler. Täta rören med ett luftgenomträngligt membran.
- Förbered och märka sex 50 ml rör och fylla dem med 20 ml vardera av 0,1% Triton-X lösning i medium. Triton-X-lösning kommer lysera eventuella återstående cellerna och ger en "noll" värde för varje chip. Placera rören i en fjärde ämnesomsättning mätenhet provrörsställ och försegla with en luft permable membran för att förhindra överdriven avdunstning.
- Ladda marker i bioModuler och inleda experimentet.
4. CAM Experiment missbruksbehandling och Injektion
OBS: Stegen och förfarande för framställning av kycklingembryon för en CAM experiment beskrivs på annan plats 19
- Börja bearbeta CAM experimentet 48 h efter transfektion (Dag 2). Dela upp den "kontroll" och "mål av intresse" grupper i två flaskor för fordon, och två för cisplatin. Sug mediet från kolvarna och fylla med antingen 3 ml färskt medium, eller 6 iM cisplatin. Inkubera under 6 h (37 ᵒC, 5% CO2).
- Aspirera mediet, sedan tvätta och trypsinize cellerna; samla trypsinerade cellerna i lösning i fyra lämpligt märkta 15 ml tuber.
- Centrifugera och tvätta cellerna tre gånger med PBS. Återsuspendera cellpelleten i 5 ml PBS ettd räkna cellerna.
- Justera volymen så att den slutliga cellkoncentrationen är 1,0x10 6 celler / ml. Överför cellen lösningen i märkta 5 ml rör för injektion, och placera på is. Vänd rören försiktigt före injektion för att säkerställa att cellerna är väl blandade.
- Avsätt totalt 24 kycklingembryon (9 dagar gamla) för injektion (6 per grupp). Utför injektion med användning av en glas nål fäst till en flexibel slang som är ansluten till en 1 ml spruta. Individen utför injektionen bör förblindas till behandlingsgruppen.
- Med hjälp av en stereomikroskop, injicera 1,0x10 5 celler i en volym på 100 l till den venösa cirkulationen av CAM. Använd en långsam, pulserande teknik för att injicera hela volymen av celler. Badda försiktigt injektionsstället med en mjuk duk för att hejda flödet av blod och absorbera spill. Märk varje embryo behållare lämpligt efter varje injektion.
- Bekräfta närvaron och distribubution av fluorescerande celler i vaskulaturen av CAM efter injektion genom att visualisera dem med användning av ett fluorescensmikroskop. Ta del av alla embryon där antalet tumörceller verkar lågt, eller distributionen är dålig.
- Placera kycklingembryon i en fuktighetskammare och lagra dem i en inkubator (37 ° C, 60% luftfuktighet). Vänta 7-9 dagar innan uppräkning metastashärdar.
5. Metastatic Focus Enumeration
- Under 7-9 dagars inkubationstid, övervaka embryon och kasta eventuella döda. Se till att fuktkammare förblir fuktig vid alla tidpunkter under inkubationstiden.
- Med hjälp av en fluorescerande stereomikroskop vid 20X förstoring, skanna hela övre ytan av embryot CAM i ett regelbundet, gallerliknande mönster.
- Räkna antalet metastashärdar i varje synfält, då stämmer numret för en slutlig total per embryo. Om du gör det för de sex embryon i varje grupp kommer att ge ett genomsnittligt antal of metastashärdar per behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat och siffror anpassats med tillstånd från publicerade arbeten 22.
BRCA2 hämning inducerar en minskning i andning i cisplatin behandlade tumörceller
Mänskliga A549 lungceller cancerpatienter behandlade med BRCA2-targeting ASO och cisplatin uppvisade en tidig och oåterkallelig minskning av andning, jämfört med celler som fick kontroll ASO och enbart cisplatin; efter 24 h av cisplatinbehandling skillnaden i andning mellan BRCA2 ASO och kontroll ASO behandlade celler var 39% (Figur 1A). Viktigt är denna minskning i andning startas innan en detekterbar minskning i celladhesion, vilket antyder att detta inträffade oberoende av förändringar i cellantal. Andning började sjunka ca 10 tim innan den första observer nedgången i vidhäftning, vilket tyder på att en nedgång i andning kan vara en formativ händelse som föregår celldöd (Figur 1B). Ingen skillnad i acidification observerades under 72 timmar experimentet tidsram, vilket tyder på att BRCA2 ASO och cisplatinbehandling har liten eller ingen effekt på glukosmetabolismen (Figur 1C).
BRCA2 hämning kombinerad med cisplatinbehandling minskar frekvensen av metastaser
Mänskliga A549 lungcancerceller behandlades med kontroll ASO eller BRCA2 ASO i närvaro eller frånvaro av cisplatin, och injiceras i den venösa cirkulationen av CAM (Figur 2A). Nio dagar efter injektion, celler behandlade med BRCA2 ASO och cisplatin uppvisade en 77% lägre frekvensen av metastatiska härdar i jämförelse med celler behandlade med kontroll ASO och cisplatin eller BRCA2 ASO ensamt (Figur 2B). Detta tyder på att BRCA2 ASO och cisplatinbehandling har potential att minska eller förhindra metastaser bördan hos patienter med solida tumörer.
Figur 1. Realtidsövervakning av tumörcells följsamhet, andning, och försurning. A549 celler transfekterades med BRCA2 ASO, klädd på biosensorchips, och behandlas med cisplatin för 24 timmar med hjälp av Bionas Discovery System. Mätningar av (A) andning, (B) vidhäftning, och (C) syrning utfördes varje 4 min under en period av 72 h. Rosa = styr ASO, blå = BRCA2 ASO, gröna = styr ASO + cisplatin, rött = BRCA2 ASO + cisplatin. Figur anpassad från publicerade arbetet med tillstånd 22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. räkna metastaser frevens använder ett kycklingembryo CAM-modellen. A549-celler transfekterade med BRCA2 ASO behandlades med cisplatin i 6 h, och sedan injiceras i den venösa cirkulationen av en 9 dagar gammalt kycklingembryo (A). Metastashärdar (B) (visualiserad med användning av ett konfokalt mikroskop med en 40x objektiv) räknades nio dagar efter injektion (C). Figur anpassad från publicerade arbetet med tillstånd 22. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av den inneboende kostnad och risk förknippad med kliniska prövningar, finns det ett behov av att utveckla bättre och mer rigorösa preklinisk testning metod för att på lämpligt sätt utvärdera nya anti-cancer behandlingsregimer. Aktuella ofta använda tekniker alla uppvisar svagheter som kan begränsa deras förmåga att skilja mellan potentiellt lovande terapeutiska mål / agenter, och de som kan vara mindre effektiva. Vi utarbetat ett protokoll för att utvärdera nya anti-cancer metoder som tar upp många av bristerna i traditionella metoder.
En särskilt viktig aspekt av den beskrivna protokollet är förmågan att mäta cellulära svar i realtid, och för att spåra förändringar i metabolism och vidhäftning minut för minut. Detta gör det möjligt att identifiera toppläkemedelseffekter, optimal dosering och en mer detaljerad förståelse för samspelet mellan komponenterna i läkemedelskombinationsbehandling. Samtidigt ger det en inblick i oavte metaboliska förändringar i cancerceller, vilket är information som inte tillhandahålls av cellräkning, apoptos, eller färgkonverterings analyser. En begränsning med denna analys är oförmågan att noggrant bestämma den typ av celldöd som sker under läkemedelsbehandling. Förändringar i lönsamheten kommer att återspeglas av förändringar i anslutning till biosensorchip, men det betyder inte ge information om det sätt på celldöd. Det är även möjligt att använda fluorescensmikroskopi och levande cell imaging tekniker för att bestämma liknande metaboliska data och detta kan användas i tillägg till de försök som beskrivs i detta protokoll 20,21.
Vidare att använda kycklingembryo CAM modell studera metastaser frekvens efter behandling är ett effektivt sätt att avgöra om ett nytt mål, drog eller läkemedel kombination minskar frekvensen av cancerceller som extravasera och / eller invadera omgivande vävnad. Detta är en särskilt relevant fråga från en clinisk synvinkel, eftersom metastatisk sjukdom orsakar en hög andel av dödligheten bland cancerpatienter. Ett potentiellt begränsande faktor är att den faktiska läkemedelsbehandling inte förekommer i nämnda CAM. Istället sker ex vivo och de förbehandlade cellerna injiceras sedan i CAM. Därför går denna analys inte ge information om läkemedelsupptag eller distribution in vivo. Dessutom de intravenösa CAM injektioner är tekniskt utmanande och kräver betydande praxis / erfarenhet.
Vi använde detta protokoll för att utvärdera förmågan hos en BRCA2-targeting ASO att sensibilisera tumörceller till DNA skadande drog cisplatin. Resultaten av våra experiment identifierade BRCA2 som en lovande mål för terapeutisk attack, och även motiven för vidare preklinisk utveckling av BRCA2 ASO som läkemedelskandidat. Vi föreställer oss detta protokoll som används för att identifiera nya mål för kombinationsbehandling, särskilt i den spirande området för DNEn reparation inhibition. Vi anser att detta protokoll kommer att bäst användas utöver de mer vanliga tekniker i cancerbiologi, i ett försök att strängare utvärdera nya anti-cancer metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Detta arbete har möjliggjorts genom bidrag till JK från Ontario spetsforsknings och Ontario forskningsfonden.
Vi vill tacka Siddika Pardhan och Dr Peter Ferguson för tekniskt stöd under inspelningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco - Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen - Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
- Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
- Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
- Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
- Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
- Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
- Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
- Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
- Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
- Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
- Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
- Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
- Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
- Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).
