Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av CAR T-celler för adoptiv terapi som led i Glioblastoma Standard of Care

Published: February 16, 2015 doi: 10.3791/52397
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

Introduction

Glioblastom (GBM) är den vanligaste primära maligna hjärntumör och är alltid dödlig. Kirurgisk resektion i kombination med icke-specifik standardbehandling kemoterapi och strålbehandling misslyckas att helt eliminera maligna celler, vilket resulterar i en dyster prognos av mindre än 15 månader hos patienter med denna sjukdom en. Däremot erbjuder immunoterapi en exakt metod för att specifikt rikta tumörceller, och därmed har potential att fungera som en mycket effektiv behandling plattform med minskad risk för säkerheter toxicitet 2-4. T-celler konstruerade ex vivo för att uttrycka chimära antigenreceptorer (personbilar) erbjuder en mångsidig strategi för tumörimmunterapi. CARs genereras genom att smälta den extracellulära variabla regionen av en antikropp med en eller flera intracellulär T-cell signalmolekyl (s), i stället för en fullängds huvudhistokompatibilitetskomplex (MHC) -restricted T-cellsreceptor 5. Detta läge av antikroppsliknande antigen erkännande och utmärkelsepå möjliggör reaktiva antigenspecifika T-celler att känna igen och svara på tumörantigener i frånvaro av MHC och kan anpassas för en nästan oändlig antigenrepertoar.

CAR-T-celler manipulerade mot en mängd olika tumörantigener har visat effekt i djurstudier och enastående löfte i kliniken 6-9. Specifikt inom ramen för GBM, en CAR T-cell-plattform riktar epidermal tillväxtfaktorreceptor variant III (EGFRvIII), en tumörspecifik mutation uttrycks på cellytan 10, visade sig förlänga överlevnaden i gliom bärande möss 11. Trots sin mångsidighet dock den kliniska nyttan av CAR adoptiv terapi har inte fullt ut, delvis beroende på tumörassocierad immunsuppression och immun skatteflykt 12-16 samt utmaningar i att etablera och upprätthålla antigenspecifika T-celler in vivo. Utnyttja standardbehandling (SOC) med immunterapi kan potentiellt övervinna flera av dessa limitationer, vilket resulterar i förbättrad effektivitet i både preklinisk och klinisk miljö.

SOC för post-resektion GBM består av högdos temozolomid (TMZ), ett DNA-alkyleringsmedel 17, och hela hjärnan bestrålning (WBI) 1. Dessa behandlingar antas samverka med tumörvacciner via uppreglering av tumör MHC uttryck 18-20 och avgivande av antigener från döda tumörceller 17,19,21,22. Faktum tillägg av TMZ 20,23 eller WBI 18,24 leder till förbättrad antitumör effekten av immunbaserade behandlingar i preklinisk miljö. Vidare, i likhet med många icke-specifika cytotoxiska kemoterapeutika, TMZ känt för att orsaka systemisk lymfopeni 25,26, som kan utnyttjas som ett sätt att värd-konditionering för adoptiv terapi plattformar 27-29. TMZ-medierad lymphodepletion har visats öka frekvensen och funktion av antigenspecifika T-celler, vilket leder till ökad effektivitet hos en adoptiva terapi plattform mot intrakraniella tumörer 30. I samband med CAR terapi, tjänar lymphodepletion som ett sätt att värdkonditione både minska antalet endogena suppressor T-celler 31, och förmå homeostatiska proliferation 32 via minskad konkurrens om cytokiner 33, och därmed stärka antitumöraktivitet 11,34. Med tanke på den synergistiska förhållandet mellan GBM SOC och immunterapi plattformar, utvärdera nya adoptivföräldrar terapier och vaccinplattformar inom ramen för SOC är avgörande för att dra meningsfulla slutsatser om effekten.

I detta protokoll vi beskriva en metod för generering och intravenös administrering av murina EGFRvIII specifika CAR T-celler vid sidan TMZ och WBI i möss med EGFRvIII-positiva intrakraniella tumörer (se figur 1 för behandling tidslinje). I korthet är CAR T-celler görs ex vivo genom retroviral transduktion. Humana embryonala njur (HEK) 293T-celler transfekteras med användning av en DNA / lipidkomplex (innehållande CAR vektorn och PCL-Eco-plasmider) för att producera virus, som sedan används för att transducera aktiverade murina splenocyter som skördas och odlade parallellt. Under CAR generation, är murina värdar bär EGFRvIII-positiva intrakraniella tumörer administrerade fraktion hela hjärnan röntgenstrålning och systemisk TMZ behandling vid doser jämförbara med den kliniska SOC. CAR T-celler levereras sedan intravenöst till lymphodepleted värdar.

Följande procedur beskrivs i sju separata faser: (1) Administration av Temozolomide till tumörbärande möss, (2) Hela Brain Bestrålning av tumörbärande möss, (3) Transfektion, (4) Splenektomi och T-cell Förberedelse, (5 ) Transduktion, (6) CAR T-cell kultur och skörd, och (7) celladministrerings CAR T till tumörbärande möss. Dessa faser består av flera steg som spänner 6-7 dagar och utförs samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll är baserad på en experimentell design där 10 möss behandlas med 10 7 CAR T-celler vardera. Detta betyder att 10 8 CAR T-celler kommer att behövas; avkastningen bör överskattas med 5 x 10 7 -1 x 10 8 till kontot för förlust av lönsamheten. Följande protokoll är skalad att alstra cirka 200 x 10 6 celler. Cellerna sedan administreras intravenöst till kvinnliga C57BL / 6 möss med 9 dagars etablerade syngena EGFRvIII-positiva intrakraniella tumörer, som utvecklats från de befintliga KR158B astrocytom eller B16 melanom cellinjer. Samtidigt med BIL T-cellgenerering, är tumörbärande möss administreras kliniskt relevanta doser av lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) och WBI (16,5 Gy).

Möss underhålls och hålls under patogenfria förhållanden vid Duke University Medical Center (DUMC). Alla djurförsök utfördes enligt protokoll som godkänts av Duke University Institutional Djurvård och användning kommittén (IACUC).

1. Administration av Temozolomide till tumörbärande möss

Dagar 0 till 4:

  1. Beräkna det totala antalet möss som ska injiceras och multiplicera detta med 0,5 för att fastställa omfattningen av TMZ-lösning som behövs (t.ex. 30 möss x 0,5 ml = 15 ml TMZ) och tillsätt 1,5 ml till denna volym till svars för spillover (16,5 ml TMZ ).
  2. Multiplicera denna totala volym med 3 mg / ml för att bestämma vikten av lyofiliserat TMZ behövs (t.ex., 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Väg detta in i en 50 ml konisk.
    VARNING: TMZ är giftigt vid inandning, förtäring och kontakt med ögon, hud och slemhinnor. Rådgör med institutionens arbetarskydd och / eller miljörelaterad hälsa och wellness avdelning för rekommendationer för att minska risken för exponering.
  3. Multiplicera den totala volymen med 0,15 för att bestämma volymen av dimetylsulfoxid (DMSO) behövs (t.ex. 16.5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filtersterilisera denna volym av DMSO (plus ytterligare 2 ml för att redovisa spillover) genom ett 0,2 pm filter in i ett sterilt rör. Lägg 2,475 ml sterilt DMSO till TMZ pulvret.
  4. Placera TMZ / DMSO-lösningen i en bägare med vatten över en värmeplatta vid 65 ° C under 10-15 min. När TMZ är helt upplöst, bör lösningen blir blekgul färg; Om lösningen blir rosa, då TMZ bryts ned, och en ny lösning bör vara beredd med en färsk massa TMZ.
  5. Beräkna lämplig volym av steril saltlösning som behövs genom att multiplicera 0,85 med den totala volymen (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml saltlösning). Tillsätt 15 ml steril koksaltlösning till en 50 ml konisk. Medan TMZ upplösning i DMSO, värme saltlösning till 65 ° C.
  6. Vortex TMZ / DMSO-lösningen för att säkerställa att TMZ pulvret är fullständigt upplöst och tillsätt långsamt värmas saltlösning till TMZ / DMSO-lösningen.
  7. Omedelbart efter beredning, fullt ladda 15 x 1 ml tuber Syringes med TMZ lösning för administration till 4 dagars etablerade tumörbärande möss.
  8. Upprepa denna procedur på dag 1 till 4 för totalt fem TMZ förvaltningar.

2. Hela Brain Bestrålning av tumörbärande möss

Dagar 2 till 4:

  1. Slå på röntgenbestrålare och låt den värmas upp till full spänning. Se till att lämpligt filter är på plats och mata in rätt spänning och aktuella inställningar (Figur 2A).
    OBS: dosimetri av bestrålningsanordningen bör fastställas i förväg för att bestämma lämplig spänningsinställningar och galler layout (Figur 2A, B).
  2. Beräkna den tid som är nödvändig för att resultera i 5,5 Gy röntgenbestrålning. Om exempelvis röntgenstrålar levereras vid en hastighet av 2 Gy / min, därefter 2,75 min är nödvändig för att leverera sammanlagt 5,5 Gy. Mata in lämplig tid varaktighet.
    OBS: Tabell 2 ger musen WBI doser ennd deras kliniska motsvarigheter hos människor. I samband med höggradig gliom, 60 Gy fraktion WBI (2 Gy fraktioner, 5 dagar / vecka i 6 veckor) är den kliniska vårdstandard, och murina motsvarighet används här är 16,5 Gy (5,5 Gy x 3).
  3. Bered en färsk lösning av ketamin / xylazin för systemisk anestesi genom tillsats 2 ml ketamin och en ml xylazin till 17 ml koksaltlösning så att den slutliga lösningen är 10 mg / ml ketamin och ett mg / ml xylazin.
  4. Väg möss och administrera 10 | il av ketamin / xylazin intraperitonealt per gram kroppsvikt, så att djuren får en dos av ketamin på 100 mg / kg och 10 mg / kg xylazin. Möss bör vara helt nedsövd och tydligt andas inom 2 min av ketamin / xylazin administration.
  5. För att upprätthålla ögon fukt i sederade djur, gnid försiktigt en liten mängd artificiella tårar salva på varje öga.
  6. Placera sederade möss på gallret så att huvudena är placerade i området som får högsta röntgen hosSPÄNNING (figur 2B, C). Shield organ från nacken ner med lämplig storlek bly slang för att blockera systemiska röntgen leverans (figur 2D).
  7. Placera placerade möss under röntgenstråle så att laser betecknar den brännpunkt röntgenstråle är vid koordinaten (0,0) på rasterlayout. Begin röntgen leverans.
  8. När röntgen leveransen är klar tar djur från bestrålningsanordningen och placera på en värmedyna. Inte hus sederade djur med medvetna djur förrän djuren har återfått tillräckligt medvetandet för att upprätthålla sternala bakåtlutad kroppsställning. När djuren kan behålla sternala bakåtlutad kroppsställning, placera medvetna djur tillbaka i sina respektive burar.
  9. Upprepa denna procedur på dagarna 3 och 4 för totalt tre fraktione stråldoser.

3. Transfektion

Dag -1:

  1. Förbered D10 medier genom att tillsätta 50 ml fetalt bovint serum (FBS) till 500 ml av Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).
  2. Förbered T-cellmedium (TCM) genom att tillsätta 5,5 ml L-glutamin, 5,5 ml natriumpyruvat, 5,5 ml icke-essentiella aminosyror, och 5,5 ml penicillin / streptomycin (pen / strep) till 500 ml RPMI-1640 medium. Lägg sedan 550 pl 2-merkaptoetanol och 550 pl gentamicin. Slutligen, tillsätt 50 ml FBS.
  3. Harvest in vitro odlade HEK293T celler och ta med till en koncentration av 7,5 x 10 6 celler / ml i D10 media.
  4. Plate 10 ml D10 medier och tillsätt 1 ml HEK293T cellsuspensionen i var och en av 16 x 10 cm poly-D-lysin (PDL) belagda plattor.
  5. Inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2.

Dag 0:

  1. Ersätt media med 10 ml färsk D10 minst 30 min innan transfektera celler.
  2. Bestäm mängden vektorplasmiden, PCL-Eco vektorn och liposomalt transfektionsreagens krävs för transfektion genom att multiplicera det totala antalet plattor + 1 (16 + 1 = 17) med 14,1 | igvektorplasmid (14,1 x 17 = 239,7 mikrogram), 9,9 mikrogram PCL-Eco vektorn (9,9 x 17 = 168,3 mikrogram), och 60 pl liposomalt transfektionsreagens (60 x 17 = 1020 l). Alla reagens bör vara rumstempererade innan framställning av lösningar.
  3. Märk två rören A och B. I rör A, tillsätt 239,7 ug vektorplasmid och 168,3 ng pCl-Eco vektorn till (1,5 x 17) ml som reducerad-serum modifierat Eagles medium (RS-MEM). I röret B, till 1020 l liposomalt transfektionsreagens till (1,5 x 17) ml RS-MEM.
  4. Inkubera A och B separat för 5 min vid rumstemperatur.
  5. Blanda A och B tillsammans försiktigt (vortex för 1-2 sek eller invertera flera gånger) och inkubera under 20 minuter vid rumstemperatur för att bilda lipid / DNA-komplex.
  6. Lägg lipid / DNA-komplex droppvis till HEK293T celler i 10 cm skål.
  7. Inkubera vid 37 ° C under 6-8 h eller över natten (överskrid inte 24 h).
  8. Efter 6-8 timmars inkubation, byt medium med 12 ml färsk TCM för viral produktion. Detta pläterade medierkommer att användas på dag 2 som viral supernatant för T-cell-transduktion.

4. Splenektomi och T Cell Förberedelse

Dag 0:

  1. Häll 10 ml TCM i en 50 ml konisk och plats på is i mjälten samling.
  2. Offer lämpligt antal djur genom CO 2 kvävning och sekundär dekapitation: Placera djur i en bur mottagande CO2 vid en flödeshastighet av volym / minut 10-30% bur, per American Veterinary Medical Association riktlinjer (inte mer än 5 djur kan vara offrade samtidigt) tills andnings upphör och i två minuter därefter. Ta djur från CO2 kammaren och halshugga.
    OBS: En mjälte av en 6-12 veckor gamla kvinnliga C57BL / 6-mus kommer att ge cirka 4,5-5 x 10 7 splenocyter. Här kommer fyra mjältar skördas för cirka 200 x 10 6 celler.
  3. Lägg musen så att dess högra sida är vänd uppåt, ochspray med 70% etanol. Med pincett, ta ett tunt hudveck under den vänstra bröstkorgen och skär en liten snitt med saxen. Dra av huden, försiktigt ta ett tunt veck av bukhinnan med pincett, och skär ett litet hålrum.
  4. Mjälten är en liten, avlång, mörkröd organ som liknar en tillplattad böna; försiktigt greppa mjälten med pincett och punktskatter genom att skära bort den omgivande bindväven. Placera de utskurna mjältarna in i den koniska innehållande 10 ml av TCM på is.
  5. Häll mjältar över en 70 ^ m maskcellfilter och disaggregera genom mäskning med den trubbiga änden av insidan av en 5 ml spruta för att generera en enkelcellsuspension. Högst två mjälte bör delas upp per nät sil.
  6. Använd en liten volym av TCM att noggrant tvätta silen efter uppdelning att samla eventuella kvar splenocyter. Pool alla uppdelade mjälte i en encelliga suspension. Ta slutliga volymen till 50 ml med TCM för en tvätt end snurra vid 300 xg under 10 min.
  7. Bered en lösning av 1x lysbuffert genom tillsats av 5 ml 10x lysbuffert till 45 ml sterilt vatten. För att eliminera röda blodkroppar, återsuspendera pelleten i 5 ml 1X lysbuffert per mjälte i ett 50 ml koniskt, blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ned. Om mer än 5 mjälte, använd en 250 ml centrifugrör. Placera konisk eller centrifugrör i en 37 ° C vattenbad i 5 min.
  8. Avlägsna lys reaktionen från vattenbadet och till TCM vid ett 1: 1-förhållande med lysbuffert för att neutralisera reaktions. Tvätta genom spinning vid 300 xg under 10 min.
  9. Aspirera supernatanten och helt återsuspendera pelleten i TCM (2 ml / mjälte, 8 ml totalt för 4 mjältar) genom att pipettera upp och ned.
  10. Räkna celler genom att tillsätta 10 pl av cellsuspension till 190 l trypan blå (1:20 utspädning). Multiplicera antalet erhållas i en av de fyra rutnät rutor med 20 x 10 4 x total volym (8 ml) för att erhålla den totala cellnummer (t.ex. 125 celler x 20 x 10 4 6 splenocyter).
  11. Späd cellerna till en koncentration av 2 x 10 6 celler / ml i TCM, kompletterad med 2 | ig / ml konkanavalin A (ConA) och 50 lU / ml rekombinant humant interleukin-2 (rhIL-2). Således, för 200 x 10 6 splenocyter, till 92 ml media till 8 ml celler, 200 mikrogram ConA och 5000 IE rhlL-2.
  12. Lägg 2 ml celler till varje brunn i 24-brunnars vävnadsodlingsbehandlade plattor, så att 4 x 10 6 celler är i varje brunn (t.ex. 100 ml celler kräver ca 4 plattor).
  13. Inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2.

5. Transduktion

Dag 1:

  1. Beräkna antalet icke-vävnadsodling behandlade 24-hålsplattor som behövs för transduktion genom att multiplicera antalet mjältar skördas av 2 (8 plattor behövs för 4 mjälte).
  2. Därefter beräknar den erforderliga volymen av rekombinant humant fibronektin-fragment (RHFF) lösningbehövs för att belägga plåtar genom att multiplicera (totalt antal brunnar + 3) x 0,5 ml (8 plattor x 24 brunnar = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml.
  3. Förbered 97,5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande RHFF vid en koncentration av 25 | ig / ml genom att multiplicera den totala volymen av 25 ^ g (97,5 x 25 = 2437,5 pg). Lägg denna mängd RHFF till 97,5 ml PBS.
  4. Coat icke-vävnadsodlingsbehandlade 24-brunnars plattor genom att tillsätta 0,5 ml PBS / RHFF lösning per brunn.
  5. Inkubera över natten vid 4 ° C.

Dag 2:

  1. Dump PBS / RHFF lösning från icke-vävnadsodlingsbehandlade 24-brunnars plattor.
  2. Tillsätt 1 ml / brunn 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS och inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
  3. Ta BSA med ordentligt upending platta. Tvätta genom att lägga till 2 ml PBS.
  4. Samla virala supernatanten genom att överföra media från varje HEK293T PDL platta in i en 250 ml centrifugrör och centrifugera 10 min vid 500 x g.
  5. Försiktigt överföra viralt supernatant in i en fräsch 250 ml centrifugrör, vara säker på att inte störa cellpelleten som kan ha bildats.
  6. Lägg färsk TCM till virusvätskan så att den slutliga volymen är 3 ml mer än den mängd som behövs för RHFF-belagda brunnar. Till exempel, för 192 RHFF-belagda brunnar, ta volymen av viral supernatant till 192 + 3 ml = 195 ml.
  7. Ta odlade splenocyter från inkubatorn och resuspendera genom att försiktigt pipettera upp och ned 2-3 gånger i varje brunn. Överför till en 250 ml konisk. Om du använder en multikanalpipett, med en steril behållare före överföringen hjälper påskynda detta steg. Räkna såsom tidigare beskrivits och centrifugera vid 300 xg under 10 min.
  8. Lägg rhIL-2 till viral supernatant vid en koncentration av 50 IU / ml. Till exempel lägga 50 x 195 = 9750 IE rhIL-2-195 ml viral supernatant.
  9. Resuspendera splenocyter i viral supernatanten vid 1 x 10 6 celler / ml
  10. Lägg 1 ml / brunn av splenocyt suspension till RHFF-belagda 24-brunnars plattor.
  11. Spin 90 min enligt följande inställningar: 770 xg, acceleration = 4, broms / retardation = 0, 32 ° C.
  12. Förbered en TCM lösning med 50 IU / ml rhIL-2. Till exempel, bereda en 200 TCM-lösning genom att lägga 10.000 IU rhIL-2. Tillsätt 1 ml rhIL-2 / TCM till varje brunn efter centrifugering.
  13. Kultur över natten vid 37 ° C i 5% CO2.

6. CAR T-cell kultur och skörd

Dagar 3 och 4:

  1. Om T-celler uppnår> 80% sammanflödet, kan cellerna delas (detta sker vanligen genom dag 3 eller dag 4). Att dela upp celler, försiktigt pipettera upp och ner i varje brunn 2-3 gånger, och flytta 1 ml från varje brunn i nya brunnar i en fräsch 24-väl vävnadskultur behandlad plåt. Lägg sedan till 1 ml färsk TCM med 50 IU / ml IL-2 till varje brunn så att den slutliga volymen är 2 ml i alla brunnar.
  2. Om cellerna inte når> 80% sammanflödet, utföra en halv medieförändring genom att långsamt pipettera upp 1 ml av media från toppen av varje brunn. Undvik disturbing celler bosatte sig på botten medan du tar bort media. Tillsätt 1 ml färsk TCM innehållande 50 lU / ml rhIL-2.

Dag 5:

  1. Resuspendera CAR T-celler genom att försiktigt pipettera upp och ner 3 gånger i varje brunn och överför till en 250 ml centrifugrör. Snurra cellerna vid 300 xg under 10 min.
  2. Helt aspirera supernatanten utan att störa pelleten. Tvätta en gång med PBS, räkna celler som tidigare beskrivits, och tvätta med PBS en andra gång. En typisk BIL T-cell avkastningen är ca 1 x 10 6 celler per brunn (8 plattor x 24 brunnar = 192 x 10 6 CAR T-celler).
  3. Resuspendera cellerna i PBS vid en koncentration av 5 x 10 7 / ml för en injektion av 1 x 10 7 i en volym av 200 | j, g (t ex, för 192 x 10 6 CAR-T-celler, resuspendera tvättade pelleten i 3,84 ml PBS).

7. CAR T-cell Administrering till tumörbärande möss

Dag 5:

  1. Transport celler på is till djuranläggning för intravenös injektion. Load 500-1000 l till insulinspruta med 27-31 G nål, säkerställer att alla bubblor utvisas.
  2. Ta en mus vid basen av svansen och placera i röret rainer.
  3. Dra svansen sträckt med venen vänd uppåt, och glider nålen cirka 1-2 mm under huden i venen genom att föra in den parallellt med svansvenen. Sakta utvisa 200 l i venen. Om nålen är rätt isatt i venen kommer volymen lätt strömma in; annars blir det motstånd och nålen kommer att behöva tas bort från svansen och åter korrekt isatta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CAR-T-celler genereras genom transduktion med EGFRvIII CAR retrovirala vektorn 11. Denna vektor, MSGV1, utvecklades från SFGtcLuc_ITE4 vektorn 35, vilket innehåller det murina stamcellviruset (MSCV) långa terminala upprepningar, den förlängda gag-regionen och kuvertsplitsstället (splitsningsdonator, sd, och splitsningsacceptorn, sa), och viral paketeringssignalen (ψ). Den EGFRvIII BIL innehållande den humana anti EGFRvIII variabel fragmentet enkelkedjig (scFv) 139, i tandem med murin CD8TM, CD28, 4-1 BB, och CD3ζ intracellulära regioner, klonades in i den retrovirala vektorn nedströms Ncol-stället (Figur 3) .

Efter transduktion, kan CAR T-celler kvantifieras och phenotyped genom flödescytometri. EGFRvIII CAR-T-celler kan visualiseras med en två-färgpanel bestående av ett streptavidin-fykoerytrin (SA / PE) -konjugerad biotynlated EGFRvIII härledda multimeren och anti-CD3-FITC. Använda kultur och transduktion protocols beskrivs här, vi rutinmässigt observera CAR uttryck bland 55-70% av murina splenocyter (Figur 4A) 11. Alternativt kan CARs även färgas för expression med användning av get-anti-human F (ab ') 2-biotin primär och SA / PE-sekundära antikroppar som tidigare har beskrivits 36. CAR-T-celler kan vidare phenotyped genom tillsats av andra fluorescensmärkta antikroppar till två färger CAR panel. Till exempel, färgning för CD8 och CD4 visar att 70% av transducerade bilar är CD8 + T-celler, medan 20% är CD4 + T-celler (Figur 4B). CAR-T-celler med detta uttrycksprofil har visat sig lätt trafik till hjärnan och behandla intrakraniella tumörer.

Tabell 1:. Temozolomide dos baserad på djurens vikt Temozolomide doser beräknades utifrån en total dos av 60 mg / kg.

Kroppsvikt Volym
25 g 0,50 ml
0,48 ml
23 g 0,46 ml
22 g 0,44 ml
21 g 0,42 ml
20 g 0,40 ml
19 g 0,38 ml
18 g 0,36 ml
17 g 0,34 ml
16 g 0,32 ml
15 g 0,30 ml
14 g 0,28 ml
13 g 0,26 ml
12 g 0,24 ml
11 g 0,22 ml
D d # Fraktioner SÄNG SOC
16,5 5,5 3 62 GBM
14 7 2 63 GBM
20 4 5 60 GBM
12 6 2 48 LGA
16 4 4 48 LGA
21 3 7 52,5 LGA
12 3 4 30 Met
16 2 8 32 Met

Tabell 2:. Kliniskt relevanta doser biologiskt ekvivalenta stråldoser Strålnings beräknades enligt BED = D [1 + d / (α / β)], där D = total dos, d = fraktionerad dos, och α / β = 2). Den totala dosen administreras som WBI till murina värden visas i termer av the bråk doser levereras och den mänskliga dosen som modelleras av dessa doser fraktioner. För modelländamål är malignitet som sängen är vårdstandard också visat.

Figur 1
Figur 1:. Tidslinje för behandling av tumörbärande möss och samtidig ex vivo CAR generation standardbehandling kemoterapi och hela hjärnan bestrålning börjar fyra dagar efter tumörimplantation (A). Under detta tidsintervall är CAR T-celler som genereras och odlade ex vivo (B) och levereras efter en fullständig kurs i värdkonditione.

Figur 2
Figur 2: Layout och inställningar för strålnings leverans.Röntgenstrålar levereras enligt en dosimetri av 320 kV och 10 mA, med en varierande varaktighet väljs enligt den önskade dosen (A). Bränn fält av röntgenstrålning är en smal 2,5 cm stort område. Sedated djur är ordnade efter gallret (B) så att deras huvuden ligger inom området för högsta röntgenstråleintensitet, (C) visar vyn från en ände av den röntgenstråle. Cirka 4 djur kan vara under bestrålningsanordningen under en kurs av röntgen administration enligt denna grid layout (B, D). Bly slangar används för att skydda kroppen, vilket innebär att endast deras huvuden exponerade för WBI (D).

Figur 3
Figur 3: Den modifierade SFGtcLuc_ITE4 retrovirala vektorn, MSGV1, användes för transduktion och generering av CAR-T-celler Den.EGFRvIII CAR insats innehållande den humana anti EGFRvIII variabla fragment enda kedja (scFv) 139, i tandem med mus CD8TM, CD28, 4-1 BB, och CD3ζ intracellulära regioner, flankeras av murina stamcellsvirus (MSCV) långa terminala upprepningar (LTR ). Uppströms om CAR insatsen är den förlängda gag-regionen och kuvertsplitsstället (splitsningsdonator, sd, och splitsningsacceptorn, sa), och den virala packningssignal (ψ).

Figur 4
Figur 4: EGFRvIII CARs uttrycks på ytan av T-celler 48 timmar efter transduktion, var T-celler färgades för ytan uttryck av EGFRvIII bilar använder en multimer sammansatt av LEEKKGNYVVTDHC-K (biotin) NH2 / streptavidin-PE.. Otransducerade T-celler från samma donator färgades också som en negativ kontroll. Data visar antalet CAR-T-celler (y-axeln) positiva för staining av PE-konjugerad EGFRvIII multimer (x-axeln), gated på CD3 + celler som en T-cellmarkör, där uttryck befanns vara 60,9% (A). CAR-T-celler som färgats för CD4-PerCP-Cy5.5 och CD8-APC visar en expressionsprofil 21,7% och 70,9%, respektive (B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Behandlingen tidslinje beskrivs här var utformad för att modellera den kliniska standardbehandling och utnyttja dess effekter för CAR adoptiv terapi. CAR T celldoser, TMZ regimer och strålbehandling administrering kan modifieras för att öka in vivo T-cellaktivitet, lymphodepletion, och tumördödande. TMZ regimer kan ökas för att ge värd myeloablation och ökad expansion av adoptivt överförda celler 30. Dessutom kan de lymphodepletive effekterna av TMZ vara rekapituleras med låg dos (4-6 Gy) singel-fraktionen helkroppsbestrålning (TBI), vilket kringgår de tumördödande egenskaper SOC. Strålnings regim tillämpas här härmar en biologiskt ekvivalent dos av 60 Gy; kan dock antalet fraktioner och hundra doser stämmas för att efterlikna andra kliniska doser (tabell 2). Viktigt vår modell av SOC använder biologiskt ekvivalenta doser av WBI, snarare än extern strålning levereras fokalt till tumören och margins, vilket ofta används i kliniken, och därmed kan leda till en mindre dos av strålning levereras till tumören och en ökad risk för toxicitet till friska mushjärna. Trots dessa begränsningar är emellertid WBI en accepterad teknik för modellering klinisk strålbehandling i en preklinisk inställning.

CAR T-cells doser kan ökas eller minskas för att observera dos effekter på tumördödande och total överlevnad 11. Dessutom kan tidpunkten för behandlingen och -väg leverans modifieras för att se skillnader i effekt. Till exempel kan CAR T-celler levereras intrakranialt att säkerställa aktivitet vid tumörstället. Utbytet av CAR-positiva T-celler kan variera beroende på effektiviteten av transduktion. Ett sätt att säkerställa en framgångsrik transduktion är genom att bära ett grönt fluorescerande protein (GFP) -kontroll under hela förfarandet. För att göra detta, kan 1 HEK293T 10 cm PDL platta delas för GFP transfektion och transduktion av en enda väl av T-celler för att rasbrantern för GFP på dagarna 3-5. En kritisk faktor vid transduktionseffektiviteten är omfattningen av T-cellaktivering och proliferation vid tillsats av viral supernatant. Vi noterar en viktig skillnad mellan vår metod för T-cellaktivering, vilket uppnås genom tillsats av ConA till odlingsmediet, och som används i klinisk miljö, uppnås av CD3- och CD28 agonist monoklonala antikroppar. Även om det senare används rutinmässigt för att generera patientens retrovirus omvandlade CAR T-celler och har också varit framgångsrik i transduktion av murina T-celler, vi tidigare fastställt att ConA stimuleringen ledde till bättre och mer konsekventa transduktioner 37. Vi har också konstaterat att den totala CAR T-cell avkastning kan variera beroende på när steget 5,18 utförs. Om du upplever dålig CAR T-cell avkastning, rekommenderar vi att du utför steg 5,18 omedelbart efter steg 5,17 i stället för att vänta på 5-6 h inkubation. Även om detta kan påverka effektiviteten i transduktion, har vi inte observerat betydande difnader i CAR ytan uttryck i våra studier.

Efter transduktion, kan CAR T-celler kvantifieras och phenotyped med flödescytometri; vi stain våra EGFRvIII BIL T-celler med en två-färgpanel bestående av ett streptavidin-fykoerytrin (SA / PE) -konjugerad biotynlated EGFRvIII härledda multimeren och anti-CD3. Alternativt kan CARs även färgas för expression med användning av get-anti-human F (ab ') 2-biotin primär och SA / PE-sekundära antikroppar som tidigare har beskrivits 36. Vi observerar rutin CAR uttryck bland 55-70% av murina splenocyter 11. Vi har tidigare visat att tillförsel av T-celler med denna CAR expressionsprofil kan lätt trafik till hjärnan och behandla tumörer. TMZ- eller TBI-inducerad lymfopeni förbättrar klonal expansion av adoptivt överförda celler, öka frekvensen av CAR-positiva celler och deras övergripande antitumörsvar. CAR-T-celler kan spåras in vivo genom att färga perifert blod med enppropriate tetramer; detta är en användbar teknik för att förstå BIL T-cellöverlevnad över tiden och effekterna av värd-konditionering på cellfunktion och persistens bilt. Alternativt, om ingen tetramer är tillgänglig för antigenreceptorn, en fluorescerande reporter kan inkluderas i CAR vektorkonstruktionen, eller bil-T-celler kan märkas ex vivo med karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) före administrering för in vivo-spårning.

Beroende på tumörmodell, immunoterapi plattform, och SOC regim, kan klinisk SOC administreras tillsammans adoptiv terapi eller vacciner medföra toxicitet. TMZ är ett DNA-alkyleringsmedel som leder till icke-specifik celldödande, och ökade doser kan leda till viktminskning och morbiditet i murina värdar. Hög dos och långvarig fraktioner av WBI kan resultera i hydrocefalus. Dessutom kan inflammatoriska effekter från en stark vaccin och / eller adoptivt överförda T-cellsvar leda till sjuklighet på grund avtoxiska cytokin stormar. Det är också viktigt att notera effekterna av systemisk anestesi på morbida djur. Om TMZ och WBI leda till betydande toxicitet, sedan ketamin / xylazin doser kan minskas med 20-25% för att minska risken för dödlighet, som djur behöver bara vara sövd och orörlig under 10 min för leverans av små stråldoser (2- 8 Gy).

Värdkonditioneringen är avgörande för alla immunterapi plattformar som inkluderar adoptiv överföring. Eftersom immunterapi prövningar ofta utvärderas inom ramen för SOC, bör preklinisk utvärdering av immunterapier ske inom denna inställning för att rekapitulera den kliniska scenariot. Vi presenterar här ett exempel på att utnyttja lymphodepletive och tumördödande effekter av SOC med adoptiv terapi använder CAR T-celler. Denna regim är ett kraftfullt verktyg som kan tillämpas på andra immunterapi plattformar för att utvärdera effekterna av kombinerade SOC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector Imgenex 10045P Helper vector for generating CAR retrovirus
Concanavalin A Sigma Aldrich C2010 Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction
Retronectin ClonTech/Takara T100B Facilitates retroviral transduction of T cells
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Transfection reagent
DMEM, high glucose, pyruvate Life technologies 11995-065 HEK293 culture media
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 T cell culture media
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life technologies 11058-021 Transfection media
200 mM L-Glutamine Life technologies 25030-081 T cell culture media supplement
100 mM Sodium Pyruvate Life technologies 11360-070 T cell culture media supplement
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution Life technologies 11140-050 T cell culture media supplement
55 mM 2-Mercaptoethanol Life technologies 21985-023 Reducing agent to remove free radicals
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life technologies 15140-122 T cell culture media supplement
Gentamicin (50 mg/ml) Life technologies 15750-060 T cell culture media supplement
GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum Gemini Bio Products 100-500 Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V–Standard Grade Gemini Bio Products 700-100P Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates
Pharm Lyse (10x concentrate) BD Biosciences 555899 Lyses red blood cells during splenocyte processing
70 μm Sterile Cell Strainers Corning 352350 Filters away large tissue particles during splenocyte processing
100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine Corning 356469 Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection
Name Company Catalog Number Comments
Temozolomide Best Pharmatech N/A Lyophilized powder prepared on the day of administration
Dimethyl Sulfoxide Sigma Life Sciences D2650 Necessary for complete dissolution of temozolomide
Saline Hospira IM 0132 (5/04) Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine
Ketathesia HCl Henry Schein Animal Health 11695-0701-1 Ketamine solution
AnaSed Lloyd Inc N/A Xylazine sterile solution 100 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Tags

Cancer Biology tumörimmunoterapi glioblastom chimär antigenreceptor adoptiv överföring temozolomid strålbehandling
Generering av CAR T-celler för adoptiv terapi som led i Glioblastoma Standard of Care
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Riccione, K., Suryadevara, C. M.,… More

Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (96), e52397, doi:10.3791/52397 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter