Abstract
Njuren fungerar normalt för att upprätthålla hemodynamisk homeostas och är en viktig plats för skador orsakade av läkemedelstoxicitet. Läkemedelsinducerad nefrotoxicitet beräknas bidra till 19- 25% av alla kliniska fall av akut njursvikt (AKI) i kritiskt sjuka patienter. AKI upptäckt har historiskt förlitat sig på statistik som serumkreatinin (SCR) eller urea (BUN) som bevisligen otillräckliga i fullständig bedömning av nefrotoxicitet i den tidiga fasen av nedsatt njurfunktion. För närvarande finns det ingen robust diagnostisk metod för att noggrant detektera hemodynamiska förändring i den tidiga fasen av AKI medan sådana förändringar kan faktiskt före ökningen av serum biomarkörer nivåer. En sådan tidig upptäckt kan hjälpa kliniker göra en korrekt diagnos och hjälp i i beslutsfattandet för terapeutisk strategi. Råttor behandlades med Cisplatin att inducera AKI. Nefrotoxicitet bedömdes i sex dagar med hjälp av högfrekvent ultraljud, scr mätning och på histopatologi avnjure. Hemodynamiska utvärdering med 2D och färg-Doppler bilder användes för att seriellt studera nefrotoxicitet hos råttor med hjälp av ultraljud. Våra data visade framgångsrik läkemedelsinducerad njurskada hos vuxna råttor genom histologisk undersökning. Färg-Doppler baserat sonografisk bedömning av AKI indikerade att resistiv-index (RI) och pulserande-index (PI) ökades i behandlingsgruppen; och topp-systoliska hastighet (mm / s), slut diastoliskt hastighet (mm / s) och hastighetstidsintegral (VTI, mm) minskade i njurartärerna i samma grupp. Viktigare är att dessa hemodynamiska förändringar utvärderas av ultraljud föregick uppkomsten av SCR nivåer. Sonography baserade index som RI eller PI kan därför vara användbara prediktiva markörer för njurfunktion hos gnagare. Från våra ultraljud baserade observationer i njurarna hos råttor som genomgick AKI, visade vi att dessa icke-invasiva hemodynamiska mätningar kan betrakta som en noggrann, känslig och robust metod för att upptäcka tidigt stadium njursvikt. Thans studie understryker också vikten av etiska frågor i samband med användning av djur i forskning.
Introduction
Serumkreatinin (SCR) har varit den gyllene standarden metriska att bedöma njurfunktion för mer än två decennier. Nyligen har många studier rapporterat att njurskada inträffar mycket tidigare än de förändringar i SCR 1. Det finns emellertid inga robusta metoder för detektion av hemodynamiska förändringar som sker tidigt under loppet av njurskada inklusive läkemedelsinducerad nefrotoxicitet.
Läkemedelsinducerad akut renal hemodynamisk dysfunktion leder till njurvävnadsskada och ytterligare progression till njursvikt 2,3. Under de senaste två decennierna, studier tyder på att avbildningsverktyg såsom datortomografi (CAT), funktionell magnetisk resonanstomografi (fMRI) och ultraljud spela en roll i hemodynamiska bedömning 4. I den aktuella bildframställning, gråskala ultraljud i kombination med färg-Doppler teknik, är det oftast för att fastställa och bedöma anatomiska statusen hos njure 3,5,6. Sullivan et. al., och Bonnin et. al. rapporterade nyligen att ultraljud är en effektiv, kraftfull och icke-invasiv verktyg i analys hemodynamiska förändringar i vasokonstriktion och hypoxi spänningsdjurmodeller 7,8. Denna teknik är också ofta används för att detektera artär stenos 9,10.
Senaste tekniska framstegen inom området för hög upplösning ultraljud har tillåtit forskare att ta itu med kardiovaskulär toxicitet med hjälp av högfrekvent (25-80 MHz) och hög upplösning (<0,03 mm upplösning) sonder, in vivo 11. Vår hypotes är att med hjälp av denna höga upplösning ultraljud för att studera njure kommer att ge ett unikt tillfälle för en icke-invasiv och känslig metod för tidig upptäckt av nefrotoxicitet.
Cisplatin används för att behandla testikel-, äggstocks-, urinblåsa, huvud, lunga, och halscancer i kombination med andra läkemedel 12-14. Cisplatin har hade väldokumenterad nefrotoxicitet på grund av cell nekros proximal tubuli (PT) och samla kanaler resulterade i stigande urea (BUN) och SCR 15. Häri ger vi en detaljerad steg-för-steg metoder för användning av icke-invasiv renal ultraljud för att karakterisera nedsatt njurfunktion med hjälp av råttmodell av drogen (cisplatin) -inducerad nefrotoxicitet.
Protocol
Utför alla förfaranden i Sprague Dawley köpta från Charles River Laboratories i enlighet med American Veterinary Medical Association (AVMA) riktlinjer och med godkända Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) protokoll.
1. Animaliska Förberedelser och kirurgiska ingrepp
- Acklimatisera alla djur för en vecka innan något experimentellt förfarande.
- Söva djur med hjälp av isofluran (2-3% för att framkalla, och 1,0% för att upprätthålla) och tillämpa ögonsalva i båda ögonen för att förhindra uttorkning, irritation eller sår.
- Ta bort hår från djurets bröst med # 40 blad och hårborttagningskräm vid behov. Det kan ha att ta bort hår form djurets tillbaka om vi inte kan ha bra bilddata som erhållits från ventrala sidan avbildning.
2. Nefrotoxicitet råttmodell
- För cisplatin-inducerad nefrotoxicitet modell, administrera Cisplatin, använder protokollet ens som tidigare beskrivits. 15
- Utför ultraljud vid baslinjen, 24 timmar före administrering av cisplatin (dag 0). (Se steg 3, Imaging Protocol)
- Randomisera råttor (n = 6) i två grupper. Dag 1, administrera Cisplatin (10 mg / ml) (10 mg / kg kroppsvikt, engångsdos nefrotoxicitet induktion), injektionsvolym (1 ml / kg kroppsvikt) beräknas genom djurets kroppsvikt), intraperitonealt i studiegruppen och normal saltlösning ( NS) i kontrollgruppen.
- Söva djur som i steg 1,2 vid 24, 48, 72, 96, 120, 144 h efter administrering av cisplatin.
- Ta bilden med hög upplösning ultraljudssystemet (se Material och utrustning tabell) under stabila anestesi skede av djur. Fortsätta att övervaka djurets grundläggande fysiologiska funktioner under avbildning från anestesi induktion genom fullständig återhämtning.
- Övervaka djurets vitala under avbildningsförfaranden: råtta-temperatur: 35,9 till 37,5, andningsfrekvens: 66-144 / min, hjärtfrekvens: 250-600 / min.Den optimala vitala läsa i vår föreslagna studien är: temperatur: 36,5 till 37,0, andningsfrekvens: 80-100 / min, hjärtfrekvens: 450-550 / min.
NOTERA: Använd Intravenös fluidinfusion, och värmelampa att upprätthålla djurets normala fysiologiska tillstånd för att minimera effekterna av kirurgi och anestesi. Assist andning med mekanisk ventilator under förfarandet vid behov. Emellertid är mekanisk ventilation sällan behövs i detta experiment.
3. Imaging protokoll
Obs! Ultraljud maskin leverantören tillhandahåller den uppvärmda plattform för långa avbildningsproceduren. Men vi inte använda den uppvärmda plattformen i vår visat experiment eftersom det bara tar 5 till 15 minuter. Dess kontrollerade för kroppstemperatur som övervakas med en rektal termometer ansluten till fysiologi omkopplaren.
- Tvär bild av njure (B-läge):
- Använda MS 250 ultraljud med centerfrekvens av 21 MHz anslutaed till den aktiva portar, ställa in programmet förinställd på "General Imaging".
- Med djuret liggande på plattformen, placera 21 MHz ultraljudssonden med hjälp av järnvägssystemet, mittlinjen på djur och isolera aorta. I detta läge sonden vinkeln är 90 grader till vänster parasternal linje (tvärgående axel) (Figur 1A, B).
- Från denna position skjuter plattformen med djuret så att sonden är nu i nivå med njurartären (antingen vänster eller höger, kan bilden en i taget).
- Genom att använda micromanipulators, visa antingen höger eller vänster njurartären.
- Justera sondvinkeln genom att luta något längs y-axeln av sonden för att erhålla en fullständig njure vy i mitten av skärmen.
- När rätt landmärken (njurbäcken, njurartärstenos) identifieras som visas i figur 1C och D, cine lagra bilden med hjälp av högsta bildhastigheten tillåtet med sonden används.
- Tvär bild av Kidney (färg-Doppler vy):
- Med färg-Doppler-tangenten på tangentbordet, aktivera Color Doppler akustisk fönster. Detta bidrar till att isolera njurartärstenos och nedsatt ven (figur 1D). (Blå färg indikerar arteriell flöde och röd färg indikerar venflöde).
- Se till att fokus djup (angivet med och gult pilspets på Y-axeln) ligger i centrum av njuren. Registrera data med cine butik.
- Se till registrering av data med högsta möjliga bildhastighet möjligt (> 200 bilder / sek).
- Tvär bild av Kidney (pulsad våg eller PW view):
- Klicka på PW-tangenten medan Färg Doppler läge för att få upp en gul indikatorlinjen (pulsad våg Doppler provvolym) på skärmen (figur 1F).
- Placera den gula linjen i njurartären, i en vinkel som sker parallellt med riktningen på flödet genom kärlet med hjälp av PW vinkel nyckel.
- I det här läget, delar upp akustisk fönster upp i övre och nedre sektionerna.
- Använd Cine butik för att fånga bilden av vågformer som anger hastigheten hos artärflödet på topp systole och diastole.
4. Djurhantering Efter Imaging
- Från dag 0 till dag 5, placera djuret i en ren återhämtning område (med ren pappershandduk på sängkläder) i bröstbenet VILA läge efter avbildning. Observera att vi hanterar alla djur med extrem försiktighet med "Tail Holding" metod för aggressiva djur som djur återhämta sig från anestesi.
- Under bedövningsmedel återhämtning, hålla djurets kroppstemperatur med en extern heat källa och övervaka djurets vitala med elektrofysiologiska prober tills djuret återhämtat sig fullständigt från anestesin.
- Avkastning återhämtade djur till anläggningen huset rummet när de är alert och aktiv.
- Avliva alla råttor enligt institutionens riktlinjer för Dag 6 och skörd njurar (se steg 4,7) för histologisk bedömning liksom steg 4,5.
- Samla djurets urin från uppsamlingsrör fästa i den metaboliska buren för kreatinin test för att kontrollera njurfunktionen.
- Utför paraffinsektion djur njure, och utföra HE (hematoxylin och eosin) färgning för att kontrollera nefrotoxicitet (se steg 4,7 för detaljer).
- Offra djur och exsanguinate med 0,9% NaCl-lösning, följt av 10% buffrad formalin fixering genom den vänstra ventrikeln. Efter blodtappning med 0,9% NaCl-lösning, ta bort råttnjurar för histologisk bedömning 16.
- Paraffin bädda 6 mm sektioner för att följa njur Morpholnik och nefrotoxicitet. Dehydratisera njurvävnaden i 30% sackaros i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) under 48 h vid 4 ° C. Därefter fastställa sektionerna i 10% buffrat formalin för 24-48 timmar vid 4 ° C.
- Därefter bädda njurvävnaden i paraffin, och lagra vävnad paraffinblock vid RT tills snittning. Ytterligare avsnitt vävnaden block med en paraffinmaskinsektion och placera sektionerna på en belagd glasskiva.
- Deparrafinize sektionen och rehydratiseras och färgades med Hematoxylin under 10 min följt av Eosin i 3 min. Montera sektionerna på en bild och få dem utvärderas av en gnagare patolog.
5. Data Beräkning och analys
- Beräkna njurartärtopphastigheter från Color Doppler bilder som kommer från steg 3,2. Välj Velocity Time Integral (VTI) verktyg för att spåra topparna av systoliskt och diastoliskt hastighet.
- Beräkna resistivt index (RI) och pulserande index (PI) med användning av equations nedan.
RI = (topp systolisk hastighets slutdiastoliska hastigheten) / topp systoliska hastighet
PI = (topp systoliska hastighets slutdiastoliska hastigheten) / medelhastighet. - Utföra statistiska analyser av RI och PI resultat med standardavvikelser från medelvärdet av tre cykelmätningar. För andra standardparametrar hänvisas till handböckerna från tillverkaren att dataanalys med hjälp av egenutvecklade programvaror (se Material och utrustning tabell).
Representative Results
Bilderna som presenteras i denna studie togs av en enda operatör. Alla bilder samlades med hjälp av högfrekvent ultraljud maskin (se Material och utrustning tabell). Alla bilddata analyserades med en enda utredare. Resultaten visade att Cisplatin-behandlade djur hade SCR intervallet från 0,5 till 2,1 (normalt intervall <1,1) vid dag 6 (figur 2A). Emellertid de histologiska studier visade konsekventa mönster av akut tubuli interstitiella skador jämfört med normala koksaltbehandlade djur.
Med hjälp av högupplösande ultraljud för att mäta hemodynamiska förändringar av njure, data visade att det inte fanns någon förändring av morfologin hos djur som behandlats med NS mellan dag 0 och dag 6, medan pulsus Parvus morfologi detekterades i djur på dag sex efter Cisplain behandling. Den övre gränsen för normal RI och PI är 0,7 och 1,15, respektive, i råttor 17. Med hjälp av ovanstående index för att bedöma hemodynamiska förändringar av njure, som visade att det finns en betydande ökning av RI och PI i cisplatin-behandlade djur på dag sex.
Figur 1. Ultraljudsapparatinställningar för att detektera njur bilder i råttor. Grafiska illustrationer av avbildningssystem med fastställandet av djurstadiet (A) och avbildningssonden läge (B) under driften av råttnjure sonografisk avbildning. Prov sonografisk bilder som erhållits från råttnjure med hjälp av högfrekventa, högupplösta ultraljudssystem (se Material och hälso utrustning tabell). (CF). Data visar tydligt njure anatomiska struktur och blodflödet i njurkärl med tillräcklig information för att ytterligare hemodynamisk parameter mätning och analys.09fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Histologi och njure sonografisk bilder av råttor under cisplatinbehandling. Serumkreatinin (SCR) och histologi studie visar normal njurvävnad i vehikelbehandlade råttor och svår proximala tubuli njurskada (gul pil) i Cisplatin behandlad råtta (A, B). SCR ökade marginellt efter cisplatinbehandling, men förblev inom det normala intervallet (<1,1). Sonografisk bilder av höger njure hos råttor i Färgdopplerläge vid dag 0, 3 och 6 på fordonet och cisplatin behandlade råttor (C); hemodynamiska parametrar, RI och PI, var signifikant ökat utvärderas efter färg-Doppler ultraljud (D, E). Den övre gränsen för normal RI är 0,7 och 1,15 för PI. Viktigare, than Ovanstående data visar de hemodynamiska förändringar föregick uppgång SCR. Pulsvågshastighet mätning visar en långsam och svag puls (pulsus Parvus tecken, gul cirkel) efter cisplatinbehandling som korrelerar med histologi studieresultat. Detta fenomen indikerar njurartärstenos, obstruktion och ytterligare försämrad njurfunktion. Histologiska data visade framgångsrik läkemedelsinducerad proximala tubuli njurskada och sonografisk bedömning visade betydande förändringar i RI, PI och pulsvågshastighet använda färg-Doppler-teknik. N = 3, *, p <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Njurar hemodynamiska parametrar för Läkemedelsinducerad AKI
Discussion
Under det senaste decenniet har många framsteg skett i sonografisk teknik, inklusive utveckling av högfrekventa mekaniska sonder, som erbjuder sonografisk data med hög kvalitet, känslighet och precision. Dessa prober kan ge ungefär 50 ^ m axiell upplösning vid ett penetrationsdjup på 5 till 12 mm och hög bildhastighet (större än 200 ram / sec), vilket således det kan användas som ett kraftfullt verktyg för att studera små djur, såsom råttor och möss 18, 19. Dessutom gör det också för att samla in sonografisk bilder på lätt sederade eller medvetna djur med vitala på fysiologiska nivåer. Dessutom ger denna icke-invasiv modalitet också möjlighet att utföra längsgående bedömning av strukturella och funktionella förändringar under sjukdomsprogression utan att offra djur 19.
År 1959, Dr.. Rusell och Brush beskrivs först de tre "R" regler (Replacement, Reduction, och förfining) för att höja awareness av etiska frågor i djuranvändning i forskning. Det föreslagna protokollet visar för första gången att icke-invasivt litet djur ultraljud kan utnyttjar minimalt antal djur i minst smärta, lidande eller ångest i Nephorotoxicity studie. Därför är det en potentiell effektiv modalitet att uppfylla de tre "R" regler för försöksdjur.
Många sonografisk studier har fokuserat på hjärt tillämpningar; bedömningar njurfunktionen ofta härrör från mätningar av hjärtstatus snarare än en direkt undersökning av njure 20-25. Vi har etablerat en bild metod för att visualisera anatomiska och funktionella förändringar i njure i realtid. Vi använde en förvald uppsättning kompletterande akustiska fönster, gråskalelläge / B och färg-Doppler, specifika för njur vy. Vi använde RI och PI index för att utvärdera sambandet mellan dessa index och förändringar av njurfunktionen i cisplatin-inducerad toxicitet modellen.
Det nya i att upptäcka drog nefrotoxicitet med den föreslagna sonografisk metodik och härledda protokoll är dess tidiga robust detektering av hemodynamiska förändringar i händelse av njurskada. Tyder resultaten på att de intra-renala vaskulära hemodynamiska förändringar i själva verket föregå den stigande SCR. Dessa data jämföras med den konventionella guldmyntfoten med hjälp av histologisk analys och visar att små djur ultraljud är en icke-invasiv, känslig och reproducerbar modalitet, som har minimal krav på djur. Det är därför ett effektivt verktyg för tidig upptäckt av läkemedelsinducerad nefrotoxicitet använder råttmodell.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | Miltex, Inc. | Surgi-Prep | Apply 24 hours prior to imaging |
| cis-Diamineplatinum(II) dichloride | Sigma | 479306 | To induce acute kidney injury at small animals. |
| Isoflurane | Baxter International Inc. | NDC 10019-773-40 | 2-3% for induction, and 1-1.5 % for maintenance; heart beats will be maintained at above 500 beats per minute |
| High Frequency Ultrasound | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | Vevo 2100 | |
| High-frequency Mechanical Transducer | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | MS250, MS550D, MS400 |
References
- Bonventre, J. V. Diagnosis of acute kidney injury: from classic parameters to new biomarkers. Contrib Nephrol. 156, 213-219 (2007).
- Lerman, L. O., Textor, S. C., Grande, J. P. Mechanisms of tissue injury in renal artery stenosis: ischemia and beyond. Progress in cardiovascular diseases. 52 (3), 196-203 (2009).
- Karas, M. G., Kizer, J. R. Echocardiographic assessment of the right ventricle and associated hemodynamics. Progress in cardiovascular diseases. 55 (2), 144-160 (2012).
- Milman, Z., et al. Hemodynamic response magnetic resonance imaging: application for renal hemodynamic characterization. Nephrol Dial Transplant. 28, 1150-1156 (2013).
- Anavekar, N. S., et al. Usefulness of right ventricular fractional area change to predict death, heart failure, and stroke following myocardial infarction (from the VALIANT ECHO Study). Am J Cardiol. 101 (5), 607-612 (2008).
- Lindqvist, P., Calcutteea, A., Henein, M. Echocardiography in the assessment of right heart function. Eur J Echocardiogr. 9 (2), 225-234 (2008).
- Sullivan, J. C., et al. Novel use of ultrasound to examine regional blood flow in the mouse kidney. American journal of physiology. Renal physiology. 297, F228-F235 (2009).
- Bonnin, P., Sabaa, N., Flamant, M., Debbabi, H., Tharaux, P. L. Ultrasound imaging of renal vaso-occlusive events in transgenic sickle mice exposed to hypoxic stress. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1076-1084 (2008).
- Desberg, A. L., et al. Renal artery stenosis: evaluation with color Doppler flow imaging. Radiology. 177 (3), 749-753 (1990).
- Ciccone, M. M., et al. The clinical role of contrast-enhanced ultrasound in the evaluation of renal artery stenosis and diagnostic superiority as compared to traditional echo-color-Doppler flow imaging. International angiology : a journal of the International Union of Angiology. 30 (2), 135-139 (2011).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
- Boulikas, T., Vougiouka, M. Recent clinical trials using cisplatin, carboplatin and their combination chemotherapy drugs (review). Oncology reports. 11 (3), 559-595 (2004).
- Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V.
- Hye Khan, M. A., Abdul Sattar, M., Abdullah, N. A., Johns, E. J. Cisplatin-induced nephrotoxicity causes altered renal hemodynamics in Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rats: role of augmented renal alpha-adrenergic responsiveness. Exp Toxicol Pathol. 59, 253-260 (2007).
- Vaidya, V. S., Bonventre, J. V. Mechanistic biomarkers for cytotoxic acute kidney injury. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (5), 697-713 (2006).
- Lu, T. S., Chen, H. W., Huang, M. H., Wang, S. J., Yang, R. C. Heat shock treatment protects osmotic stress-induced dysfunction of the blood-brain barrier through preservation of tight junction proteins. Cell stress, & chaperones. 9 (4), 369-377 (2004).
- Kaya, M. Hemodynamics - New Diagnostic and Therapeutic Approaches. , InTech. 1-30 (2012).
- Bjornerheim, R., Grogaard, H. K., Kjekshus, H., Attramadal, H., Smiseth, O. A. High frame rate Doppler echocardiography in the rat: an evaluation of the method. European journal of echocardiography : the journal of the Working Group on Echocardiography of the European Society of Cardiology. 2 (2), 78-87 (2001).
- Zhang, L., et al. A high-frequency, high frame rate duplex ultrasound linear array imaging system for small animal imaging. IEEE transactions on ultrasonics, ferroelectrics, and frequency. 57, 1548-1557 (2010).
- Frea, S., et al. Echocardiographic evaluation of right ventricular stroke work index in advanced heart failure: a new index? J Card Fail. 18 (12), 886-893 (2012).
- Marwick, T. H., Raman, S. V., Carrio, I., Bax, J. J. Recent developments in heart failure imaging. JACC Cardiovasc Imaging. 3 (4), 429-439 (2010).
- Pokreisz, P. Pressure overload-induced right ventricular dysfunction and remodelling in experimental pulmonary hypertension: the right heart revisited. Eur Heart J supplements. 9 (Supplement H), H75-H84 (2007).
- Senechal, M., et al. A simple Doppler echocardiography method to evaluate pulmonary capillary wedge pressure in patients with atrial fibrillation. Echocardiography. 25 (1), 57-63 (2008).
- Souders, C. A., Borg, T. K., Banerjee, I., Baudino, T. A. Pressure overload induces early morphological changes in the heart. Am J Pathol. 181 (4), 1226-1235 (2012).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
