Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

En fisk-matning Laboratorie Bioassay att bedöma Antipredatory aktivitet av sekundära metaboliter från vävnader av marina organismer

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

Denna bioassay använder en modell rovfisk att bedöma förekomsten av utfodring-avskräckande metaboliter från organiska extrakt av vävnader av marina organismer vid naturliga koncentrationer med hjälp av en näringsmässigt jämförbar livsmedelsmatris.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kemisk ekologi utvecklas genom samarbete mellan kemister och ekologer. Medan subdiscipline av marksänd kemisk ekologi har funnits under en längre tid, är det av marin kemisk ekologi bara några decennier gammal men har gett viktiga insikter i evolutionär ekologi och samhällsstruktur av marina organismer 1-8. Med utnyttjande av de framväxande teknologier sportdykning och NMR-spektroskopi, organiska kemister snabbt genererat ett stort antal publikationer som beskriver nya metaboliter från bentiska marina ryggradslösa djur och alger under 1970- och 1980-talen 9. Förutsatt att sekundära metaboliter måste tjäna något syfte, många av dessa publikationer skrivs ekologiskt viktiga egenskaper till nya föreningar utan empiriska bevis. Vid ungefär samma tid var ekologer också dra nytta av tillkomsten av dykning och beskriva de distributioner och bestånd av bottendjur och växter tidigare kända from relativt ineffektiva provtagningsmetoder såsom muddring. Antagandet av dessa forskare var att allt fastsittande och mjuk arbetsföra måste kemiskt varas att undvika konsumtion av rovdjur 10. I ett försök att introducera empiri vad var annars beskrivande arbete med arter abundances började några ekologer extrapolera kemiskt försvar från toxicitetsanalyser 11. De flesta toxicitetsanalyser involverade exponeringen av hel fisk eller andra organismer till vattensuspensioner av råa organiska extrakt av ryggradslösa vävnader, med efterföljande bestämning av de torra koncentrationer av extrakt som är ansvariga för att döda hälften av analys organismer. Men toxicitets analyserna inte efterlikna det sätt på vilket potentiella rovdjur uppfattar offer under naturliga förhållanden, och senare studier har funnit något samband mellan toxicitet och smaklighet 12-13. Det är förvånande att publikationer i ansedda tidskrifter som används tekniker som har liten eller ingen ecological relevans 14-15 och att dessa studier fortfarande allmänt citeras idag. Det är ännu mer alarmerande att notera att studier baserade på toxicitetsdata fortsättningsvis att publiceras 16-18. Bioassay beskrivs häri utvecklades i slutet av 1980-talet för att ge ett ekologiskt relevant strategi för marina kemiska ekologer att bedöma antipredatory kemiskt försvar. Metoden kräver en modell rovdjur att prova en rå organisk utdrag ur målorganismen vid en naturlig koncentration i en näringsmässigt jämförbar livsmedelsmatris, som ger smak uppgifter som är mer ekologiskt meningsfulla än toxicitetsdata.

Den allmänna metod för bedömning av antipredatory aktiviteten i vävnaderna av marina organismer omfattar fyra viktiga kriterier: (1) en lämplig generalist rovdjur måste användas i foderanalyser, (2) organiska metaboliter av alla polariteter måste uttömmande heras från vävnaden av rikta organism, (3) de metaboliter skall be blandas i en näringsmässigt lämplig experimentell mat vid samma volymetriska koncentrationen som finns i organismen från vilken de extraherade, och (4) den experimentella designen och statistisk metod måste ge en meningsfull metrisk att indikera relativa distastefulness.

Proceduren som beskrivs nedan är speciellt utformad för att utvärdera antipredatory kemiskt försvar i Karibien marina ryggradslösa djur. Vi använder den Thalassoma bifasciatum, Thalassoma bifasciatum, som modell rovfiskar eftersom denna art är vanligt med Caribbean korallrev och är känd för att prova ett brett sortiment av bottendjur 19. Vävnad från målorganismen först utvinns, kombineras sedan med en livsmedelsblandning, och slutligen erbjuds till grupper av T. bifasciatum att observera om de avvisar extraktbehandlade livsmedel. Analys data med hjälp av denna metod har gett viktiga insikter i den defensiva kemi marina organismer 12,20-21, life historia avvägningar 22-24 och samhällsekologi 25-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Steg 3 i detta protokoll omfattar ryggradsdjur ämnen. Förfarandet har utformats så att djuren får den mest human behandling möjligt och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of North Carolina Wilmington.

1) Vävnads Extraktion

  1. Använd vävnad som är i sitt naturliga tillstånd av hydrering och inte pressas, torkade ut eller alltför våt som detta kommer att förändra volymetriska koncentrationen av sekundära metaboliter. Klipp eller hacka vävnaden i bitar eller skivor som kan infogas i ett 50 ml centrifugrör. Obs: Färsk vävnad kan användas i vissa fall, men det är ofta bättre att skära eller hacka frusen vävnad, vilket inte är föremål för klämma när man skär.
  2. Lägg vävnadsbitar till 30 ml av en 1: 1 blandning av diklormetan (DCM) och metanol (MeOH) i ett graderat centrifugrör tills en slutlig volym av 40 ml uppnås. Var noga med att utföra alla steg som innebär överföring avlösningsmedel i ett dragskåp med god ventilation.
  3. Cap röret och invertera den flera gånger, sedan skaka flera gånger under en 4 h extraktion period. Observera: Under denna period, kombinerar vatten med MeOH och den resulterande MeOH: vattenfasen separerar från DCM fasen. Vävnaden växelvis exponerades för DCM och MeOH: vatten som en emulsion som rören omskakas.
  4. Överför DCM extraktet till en rundbottnad kolv och indunsta till torrhet på en rotationsindunstare med användning av låg värme (<40 ° C). Använda minimal lösningsmedel, överföra det torkade extraktet till en 20 ml scintillationsflaska. Montera flaskan med en rotationsindunstare adapter och åter avdunsta till torrhet på en rotationsindunstare med användning av låg värme (<40 ° C).
    Obs: Nästa steg kräver användning av en hemmagjord komprimerings instrument som kan sättas samman genom att skruva följande poster i ordningsföljd på slutet av en gängad stång: (1) mutter, (2) bricka, och (3) ekollon mutter. Brickan ska antingen vara perforerat ellermonterade så att den är mindre än den inre diametern hos en 50 ml centrifugrör.
  5. Återgående till den graderade centrifugrör som innehåller vävnaden och MeOH: vattenextraktet, pressa extraktionsmediet ur vävnaden genom kompression. Överför MeOH: vattenextraktet till samma rundbottnad kolv och lagra kyld (<10 ° C).
  6. Lägg MeOH till den graderade centrifugrör tills nu dehydratiserade vävnaden nedsänkes under en andra extraktion av 2 till 6 h varaktighet, sedan överföra den nya MeOH extrakt till den kylda rundkolv innehållande MeOH: vattenextraktet. Om det finns någon oro för att vävnaden inte är helt extraherats, upprepa 2-6 tim MeOH utvinning.
  7. Torka av MeOH på en rotationsindunstare med användning av låg värme (<40 ° C). Överför den återstående vattenhaltiga extraktet från den rundbottnade kolven till scintillationsflaska innehållande det torkade opolära extrakt, med användning av en minimal volym av MeOH för att skölja den rundbottnade kolven.
  8. Evaporate vattenextraktet till torrhet med hjälp låg värme (<40 ° C) på en vakuum koncentrator. Den scintillationsflaska innehåller nu den totala torra råa organiska extraktet av 10 ml vävnad. Evakuera gasutrymme av flaskan med N2-gas för att förhindra oxidation, försegla tätt och lagra frysta (-20 ° C).

2) Food Preparation

  1. Förbered frystorkat bläckfisk mantel pulver.
    Obs: Squid mantel ger en näringskälla som är jämförbar med andra bottendjur, och kommer att användas som ingrediens i delsteg av 2.2.
    1. Tina frysta ringar av bläckfisk mantel i varmt avjoniserat (DI) vatten, sedan puré dem i en hög hastighet mixer.
    2. Häll ett tunt lager av mosad bläckfisk mantel på ett grunt cookie plåt och frysa (-20 ° C), sedan bryta ark fryst bläckfisk puré i små bitar som ska frystorkas.
    3. Lyofilisera fryst bläckfisk mantel puré efter de operativa förfarandena i frEeze tork.
    4. Pulvrisera de frystorkade bitar av bläckfisk mantel puré i en höghastighetsblandare för att bilda ett pulver.
    5. I ett dragskåp, häll pulveriserade bläckfisk manteln i en roterande mjöl sil och sålla för att separera stora bitar av vävnad från fint pulver.
    6. Överför fina pulveriserade bläckfisk mantel till en förslutningsbar behållare. Evakuera behållaren huvudutrymmet med N2-gas för att förhindra oxidation och lagra fryst (-20 ° C).
  2. Förbered maten blandningen.
    Anmärkning: När man kör multipla konsekutiva analyser, är det praktiskt att framställa ~ 100 ml livsmedelsblandning, men detta recept kan skalas till mindre volymer om nödvändigt.
    1. Kombinera en blandning av 3 g alginsyra och 5 g frystorkat bläckfisk mantel pulver med 100 ml Dl-vatten i en 150 ml bägare. Rör om kraftigt med en microspatula under några minuter tills pulvret är fullständigt hydratiserad, och blandningen är homogen.
      Obs: Om så önskas, karamellfärg kan läggas till denna mep: det är lättare att lägga färgämne till maten blandning som kommer att generera både behandlade och kontrollblandningar (maskering den naturliga pigment av extraktet i extraktet behandlade blandning) snarare än att försöka matcha färgen på extraktet behandlade blandning genom att lägga färgämne till kontrollblandningen. En grönaktig eller brunaktig matfärg är ofta önskvärt att maskera eventuella pigment i råextraktet.
    2. Ladda exakt 10 ml av mat blandningen i en graderad spruta. Akta dig för att införandet av luftbubblor under denna process.
    3. Avlägsna 20 ml scintillationsflaska med torr rå ekologiskt extrakt från frysen. Lägg en droppe eller två av MeOH, rör sedan extraktet till en homogen blandning med en microspatula.
    4. Mata den laddade 10 ml spruta med livsmedelsmatris i 20 ml scintillationsflaska och rör om med en microspatula att homogenisera extraktet behandlade livsmedel blandning.
      Obs: Det kan hjälpa att mata sprutan i mindre steg (dvs, mata 2 ml och homogenisera, sedan r.pprepa tills alla 10 ml har homogeniserats).
  3. Förbered analyspellets.
    1. Ladda en mycket liten volym av extraktblandningen (~ 1 ml) i en spruta, och dränka sprutspetsen i en lösning av 0,25 M CaCl2. Mata innehållet i sprutan för att bilda en lång, spagettiliknande sträng.
    2. Efter några minuter, ta bort det härdade strängen, hacka den i 4 mm långa pellets på ett glas skärbräda med ett rakblad, skölj sedan i havsvatten.
    3. Upprepa steg 2.3.1 och 2.3.2 utan att inkludera vävnadsextrakt för att göra kontrollpellets. Var noga med att behandla styr pellets med en motsvarande volym av lösningsmedel (se tillägg av MeOH till behandlad blandning i steg 2.2.3) för att kontrollera för lösningsmedels tillägg. Om en negativ kontroll önskas för att bekräfta att analys fisk kan avskräckas från utfodring, lägga denatoniumbensoat vid en koncentration av 2 mg ml -1 till rå mat blandningen 27.

3) smaklighetBioanalyser

  1. Utför utfodrings analyser med vildfångad gul-fas Thalassoma bifasciatum, Thalassoma bifasciatum, hålls i grupper om tre i ogenomskinliga sidiga fack i laboratorie akvarier.
  2. Leverera mat pellets från en bägare med havsvatten med hjälp av en glaspipett med en gummi glödlampa. Obs: Det kan ta ett par dagar för att utbilda fisken att få mat på detta sätt. En konditione stimulus (t.ex. några tryckningar av pipetten på akvarieglaset) som föregår leveransen av livsmedel kan vara till hjälp att träna fisken att förvänta sig tillägg av mat pellets.
  3. Scoring pelletar. Tänk dig en pellet godtas om lätt konsumeras av fisken. Tänk dig en pellet avvisas om inte ätit efter minst tre försök av en eller flera fiskar att ta det i sin munhåla, eller om pelleten närmade sig och ignoreras efter ett sådant försök.
  4. Scoring prover. Obs: Analysförfarandet avbildas som ett flödesschema i figur 1 Grupper av fisk som vägrar att äta.kontroll pellets vid varje steg i protokollet anses inte längre. Det finns två möjliga utfall av en enda körning av analysen: provet antingen accepteras eller förkastas.
    1. Börja med en kontroll pellet för att bekräfta att den grupp av fisken är samarbetsvillig. Erbjud en behandlad pellet. Om fisken acceptera behandlade pellets, poäng provet som accepteras. Om fisken förkastar den behandlade pelleten, erbjuda en efterföljande kontrollpellet för att bestämma huruvida det att fisken har upphört utfodring. Om fisken accepterar den efterföljande kontrollen pellets, poäng provet som förkastades.
  5. Replikering. Upprepa analysförfarandet med tio oberoende grupper av fisk för varje extrakt.

4) Utvärdera Betydelse

  1. Utvärdera betydelsen av skillnader i konsumtionen av kontroll vs behandlade pellets med en modifierad version av Fishers exakta test 26. Ändra testet så att marginal summorna för kontroll och behandlade pellets är fasta, Behandla dem båda som stickprov. Obs: Detta ger p = 0,057 när 7 pellets äts; Därför är varje extrakt anses avskräckande om 6 eller färre pellets äts, och välsmakande om 7 eller fler pellets äts.
  2. Att jämföra den relativa smaklighet bland grupper av extrakt, beräkna en genomsnittlig antal pellets äts inom varje grupp. Håll tröskeln vid 6 pellets så en grupp av likadana extrakt anses avskräckande om det genomsnittliga antalet pellets äts + standardfel (SE) ≤6. Obs: I representativa resultat, är grupparbete arter, så replikerar utdrag kommer från olika individer och den relativa smaklighet kan jämföras mellan olika arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här rapporterar vi resultaten av denna bioanalys för sex arter av vanliga karibiska svampar (Figur 2). Dessa data ursprungligen publicerades 1995 av et al. Pawlik 12 och demonstrera kraften i denna strategi för att kartlägga skillnader i kemiska försvarsstrategier bland samarbete före taxa. Resultaten redovisas som en genomsnittlig antal livsmedel pellets ätit + standardfel (SE) för varje art. Nästan inga pellets åts i analyser med råa organiska extrakt från Agelas clathrodes, Amphimedon compressa och Aplysina cauliformis. Däremot fick pellets gjorda med extrakt från Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa och Mycale laevis lätt konsumeras i analysen 12. Färre än sex pellets åts för de första tre arterna, så de ansågs väsentligt avskräckande. Däremot var de andra tre arterna inte signifikant från kontrollerna, och varanses tilltalande.

Figur 1
Figur 1:. Schematisk bild av analysförfarandet I alla stadier, förkastandet av en kontrollpellet visar att denna uppsättning av analys fisken är samarbetsvillig eller mätta och kan inte användas längre. Protokollet börjar genom att erbjuda varje uppsättning av fisk en kontrollpellets följt av en behandlad pellet. Därefter om det behandlade pelleten accepteras provet gjorde som accepteras. Om det behandlade pelleten förkastas men den efterföljande kontrollen pelleten accepteras provet poängsätts som avvisas.

Figur 2
Figur 2: Förbrukning av Thalassoma bifasciatum av mat pellets (medelvärde + SE) som innehåller råa organiska extrakt av svampar på naturliga koncentrationer, först rapporterades 1995 av Pawlik 12 Fisk konsumerade alla 10 kontroll pellets i samtliga fall. Efter varje artnamn är antalet replikatprover specificerade (varje replikera från den separata utvinning av ett geografiskt avgränsad prov svampvävnad). För varje enskild analys gjordes extrakt anses avskräckande om antalet pellets ätit var mindre än eller lika med 6 (p = 0,057, modifierad Fishers exakta test), vilket indikeras av den streckade linjen i diagrammet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det förfarande som beskrivs häri tillhandahåller en relativt enkel, ekologiskt relevanta laboratorieprotokoll för bedömning antipredatory kemiskt försvar hos marina organismer. Här granskar vi de viktiga kriterier som är uppfyllda av denna uppsättning metoder:

(1) Lämplig rovdjur. Detta utfodring analys sysselsätter Thalassoma bifasciatum, Thalassoma bifasciatum, en av de mest förekommande fiskar på korallrev i hela Karibien. Den bluehead är en generalist köttätare känt att prova ett brett sortiment av bottendjur 19. Generalist rovdjur är det bästa valet för dessa inledande analyser eftersom majoriteten av rovfiskar på reven är generalister, och det förväntas att antipredatory försvar skulle i stort sett riktas mot dem, till skillnad från specialist rovdjur som kan ha utvecklats mekanismer för att kringgå försvar. Laboratorieundersökningar av kemiska försvar med en enda potentiell predator är avtio följt av mer tidskrävande och komplicerad fältförsök som förlitar sig på svaren från en full uppsättning potentiella rovdjur under fältförhållanden 28-33.

(2) Extraktion procedur. Den första vävnads extraktionssteg, som använder en lösningsmedelsblandning av lika delar diklormetan (DCM) och metanol (MeOH), snabbt tränger vävnad, solubilisering membran och dehydratiserande cellulärt material. Vävnaden är uttorkad efter detta steg, så de efterföljande stegen extrahera återstående metaboliter av alla polerna i MeOH. Upprepning utvinning i MeOH tills vävnaden är helt utvinns utgör en uttömmande extraktionsprocedur. Mindre variationer på denna extraktion system är acceptabla, såsom substitution av en extraktion lösningsmedel för en annan av samma polaritet, men vävnads extraktion kan vara ofullständig om en olämplig lösningsmedel används. Potentiella fallgropar felaktig vävnads extraktion diskuteras i detalj på annat håll <sup> 8.

(3) Framställning av experimentell mat. Den konstgjorda livsmedelsmatrisen måste simulera vävnaden hos målorganismen både näringskvalitet och koncentration av sekundära metaboliter. Det är troligt att samma sensoriska processer som rovdjur använder för att avvisa utfodring-avskräckande metaboliter också är inblandade i uppfattningen av näringskvalitet livsmedel. Livsmedel med lågt näringsvärde kan avvisas på mycket lägre nivåer av kemiskt försvar, och omvänt, får sekundära metaboliter bara avskräckande vid högre än naturliga koncentrationer om dessa metaboliter presenteras i en konstgjord mat som är mer näringsrik än den vävnad från vilken den härleddes. Pulveriserad, frystorkat bläckfisk mantel är ett användbart närings substitut eftersom det är lätt tillgänglig, lätt att mäta, och dess näringsegenskaper har redan fastställts 34.

Den andra vid utarbetandet av den experimentell mat gäller bestämning av koncentrationen av extraktet, vilket måste göras på grundval av volym, inte massa. Rovdjur äter våt vävnad, och vävnaderna av marina organismer varierar brett i vattenhalt. Ur ett rovdjur, skulle en tugga av en manet eller anemon innehåller betydligt mer vatten per enhet torrvikt än samma storlek bett av en bläckfisk eller havs slug. För mycket hydratiserade vävnader, skulle koncentrationen av metaboliten per enhet torrvikt vara mycket högre än per volymenhet, men volym (biter) är det mått som är ekologiskt relevant. Dessutom får vävnader av marina organismer har mycket olika densitet på grund av mineralskelettelement. Fastställande av metabolit koncentration genom volym löser båda problemen och är den mest relevanta måttet med utgångspunkt från konsumtion av vävnad med en potentiell predator. Det här ämnet, inklusive exempel från litteraturen, diskuteras i detalj på annan plats 8.

.. innehåll "> (4) Experimentell design och statistisk metod Lämplig experimentell design och statistisk analys av uppgifterna är lika viktiga för beteendeanalyser som för alla andra vetenskapliga forskning som innebär att bestämma betydelsen av skillnader i försöksresultat Analysen beskrivs här är enkel: skillnader ska fastställas med en modifierad beredskapsbord. Metoden kräver att alla livsmedel erbjudanden kontroll konsumeras eftersom utredaren inte skulle använda experimentella rovdjur som inte livnär sig på kontroll livsmedel 8. Även om användningen av Fishers exakta test har modifierats från sitt ursprungliga användning av Pawlik et al. 12, tröskelvärdet på 6 behandlade pellets äts förblir oförändrad. Under åren har andra statistiska test föreslagits som substitut, men kasseras efter samråd med medarbetare James E Blum (UNCW Institutionen för matematik och statistik ). Till exempel, McNemars testet har föreslagits,men är olämpligt, både därför att den saknar en matchad uppsättning data, och eftersom en rad av beredskapsbordet är fastställt till 10 kontroll pellets äts.

Trots vår erfarenhet att denna analysmetod ger anmärkningsvärt tydliga resultat, ändå grundat sig på en beteendevetenskaplig svar. Om fisken är svalt för en tid innan analysen, kan de äta mer behandlade pellets än de skulle om fisken välnärda, särskilt om en defensiv metabolit är närvarande i de behandlade livsmedel pellets vid en nära-tröskelkoncentration av aktivitet. Av dessa skäl bör resultaten i napp analyserna inte övertolkas. Till exempel, en skillnad mellan två vävnadsprover av 1/10 vs 9/10 pellets ätit indikerar det första provet är avskräckande och den andra inte, men en skillnad på 3/10 vs 5/10 pellets ätit kan bero på beteendevariation mellan analyser, och det första provet är inte nödvändigtvis mer avskräckande än den andra.

En nyckel application av denna bioassay är dess användning i bioassay styrd fraktione, varvid successiva partitioner av råextraktet testas på fisk för att isolera de kemiska föreningar som ansvarar för utfodring-avskräckande aktivitet 29,32-33,35-38. När närvaron av en kemiskt försvar har fastställts, är det råa organiska extraktet kromatografiskt fraktion i mindre delmängder av föreningar som utgör blandningen, och dessa delmängder matas att fiska i samma utfodring analysen. Återigen, bör detta ske på en volym basis, med hjälp av "ml ekvivalenter" av vävnadsextrakt snarare än mass motsvarigheter. Som intäkterna separations är fraktioner bäst analyseras som en seriespäd förhållande till den naturliga volymetriska koncentration: 4 ×, 2 ×, och 1 ×. Denna spännvidd av koncentrationer beaktar den förmodat minskade avskräckande aktivitet som kommer från att dela de aktiva metaboliter över två eller flera kromatografiska fraktioner eller från förlust av aktiva metaboliter through nedbrytning, reaktion, eller fastsättning kromatografisk media. När de aktiva metaboliter har isolerats från bioassay styrd fraktione får utredaren identifiera dem med hjälp av standard spektroskopiska tekniker och bör också göra samma sak för inaktiva fraktioner som kan ha sekundära metaboliter. Det är lika viktigt att veta vilka sekundära metaboliter är aktiva i ekologiskt relevanta experiment som att veta vilka metaboliter inte 8.

Element av detta förfarande kan även användas för att designa nya experimentella tekniker. Till exempel, var detta bioanalys anpassad för ryggradslösa rovdjur (t.ex. krabbor 39 och seastars 40), för andra geografiska regioner 41, och till och med att ta itu med andra forskningsfrågor (t.ex. strukturella försvar 31,34,42 och Aposematism 27). De fyra kriterier bör tjäna som vägledning för framtida anpassningar av denna metod. Sammanfattningsvis här bioassay förfarande provides ett mer ekologiskt relevant metod för att bedöma antipredatory kemiskt försvar från vävnader av marina organismer. Studier med denna procedur har avancerade vår förståelse av de faktorer som styr fördelningen och förekomst av marina ryggradslösa djur med Caribbean korallrev (t.ex. senast, Loh och Pawlik 26) och kan informera utredningar i olika områden för bevisupptagning, inklusive farmakologi, bioteknik och evolutionär ekologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
  5. Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. Springer. New York. (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61, (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159, (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45, (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401, (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8, (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107, (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208, (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25, (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127, (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58, (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15, (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28, (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322, (1), 67 (2005).
En fisk-matning Laboratorie Bioassay att bedöma Antipredatory aktivitet av sekundära metaboliter från vävnader av marina organismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter