In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
Углубленный анализ раковых клеток протеомов необходимы для выяснения онкогенные pathomechanisms, а также для выявления потенциальных лекарственных целей и диагностические биомаркеры. Тем не менее, методы количественного протеомики характеристик опухолей пациентов, полученных и в частности их клеточных субпопуляций в значительной степени не хватает. Здесь мы описываем экспериментальную настройку, что позволяет количественный анализ протеомов раковых клеток, полученных из субпопуляций жидкие или твердые опухоли. Это достигается путем объединения сотовых стратегии обогащения количественного Супер-SILAC основе масс-спектрометрии с последующим анализом данных биоинформатики. Чтобы обогатить специфических клеточных подмножеств, жидкие опухоли сначала immunophenotyped с помощью проточной цитометрии с последующим FACS сортировки; для солидных опухолей, лазерная захвата микродиссекции используется для очистки специфических клеточных субпопуляций. На втором этапе, белки извлекают из очищенных клеток, а затем в сочетании с опухоль-специфических,SILAC-меченых шип в стандарт, который позволяет белка количественное. Полученный белковый смесь подвергают гель-электрофореза либо или фильтр автоматизированного приготовлени образца (FASP) с последующим трипсином переваривания. Наконец, триптические пептиды анализировали с использованием гибридного квадрупольного масс-спектрометра Orbitrap, и полученные данные обрабатываются с биоинформационных программные пакеты, включая MaxQuant. С помощью процесса, представленного здесь, до 8000 белков могут быть идентифицированы и количественно в образцах пациента, полученных, и полученные профили экспрессии белка можно сравнить у пациентов с целью выявления диагностических протеомических подписи или потенциальных лекарственных целей.
Масс-спектрометрия на основе протеомики стала и теперь широко используется дисциплина в клеточной биологии и поступательного биомедицинских исследований. Технический прогресс в области дали возможность изучить сложные клеточные процессы в клеточных линий и животных моделях, как тысячи белков могут быть идентифицированы в одном масс-спектрометрического эксперимента 1,2. Аналогичный прогресс был достигнут для анализа многих пост-трансляционных модификаций, таких как фосфорилирование или убиквитинирования, хотя обычно для этого требуется на заказ рабочие процессы для обогащения и анализа данных для каждого типа модификации 2,3. Кроме того, участие химических и метаболических стратегий маркировки, в том числе SILAC, обеспечивает точное относительное количественное белков и PTMs, что делает этот метод особенно привлекателен для открытия основных клеточных процессов, диагностических биомаркеров и потенциальных мишеней для лекарственных средств в человеческий рака 4.
Тем не менее,несколько проблем, которую необходимо преодолеть в связи с протеомного анализа первичных злокачественных опухолей человека 5. Прежде всего, образцы рака человека часто показывают высокую степень клеточной гетерогенности, что обусловлено наличием различных типов клеток, принадлежащих к микроокружения опухоли, в том числе иммунных клеток и фибробластов. Во-вторых, клональный эволюция приводит к генетического разнообразия внутри самих опухолей, в результате существования нескольких клеточных субпопуляций с различными функциональными свойствами. В соответствии с нынешней концепции нескольких раковых стволовых клеток, находящихся движущих сил развития рака и прогрессии, протеомики анализа таких (функционально очень актуально) клеточных субпопуляций, как ожидается, иметь большое значение для лучшего понимания онкогенных механизмов, имеющих значение для клинического применения 6. В-третьих, количественные профили экспрессии белка больших наборов образцов часто требуются для идентификации надежной клинической BiomarKERS; это не может быть достигнуто путем химической маркировки, таких как iTRAQ 7, в то время как метаболические стратегии маркировки – полагаясь, как они это делают, на клеточной пролиферации 4 – также являются неприменимыми. В-четвертых, большинство доступных твердые образцы опухоли являются фиксированных формалином, что затрудняет массовое спектрометрического анализа протеома за счет образования белковых сшивок 8. Наконец, большинство существующих протеомики рабочие процессы требуют значительного количества обработки образцов и сбора данных, что делает анализ чисел выборки соответствующих клинических исследований сложно, и призывают к новым процессом парадигмы 9,10.
Для решения этих препятствий мы разработали экспериментальную установку, которая сочетает в себе либо потока цитометрии сортировки клеток 11 или лазер-захвата микродиссекции 12,13 сотовой обогащения с супер-SILAC 14 стратегии внедрения глобальной внутренний стандарт для комплексного анализа масс-спектрометрического, С помощью метода, описанного здесь, можно количественно до 8000 белков в отдельных образцах опухолей человека, полученных из жидкого или твердого рака.
Масс-спектрометрическое профилирование пациентов, полученных протеомов раковых клеток необходим для открытия новых диагностических / прогностических биомаркеров, а также, чтобы дать более глубокое понимание рака клеточной биологии, который в свою очередь может привести к выявлению новых потенциальных мишеней для лекарственных средств. Тем не менее, такие масс-спектрометрии анализ весьма сложной, в частности потому, что различные преаналитического вопросы должны быть решены, если кто-то, чтобы получить надежные и биологически соответствующие результаты.
Экспериментальный рабочий описано здесь, дает возможность количественного протеомики характеристик протеомов, полученных из клеточных субпопуляций жидких и твердых опухолей. Начальное обогащение опухолевых клеток либо FACS на основе клеток-sortingor микродиссекции необходима, чтобы избежать загрязнения клетками микроокружения опухоли. Кроме того, эти методы позволяют выделить клеточные субпопуляции интерес. Недавние исследования клеточно-биологического есть демонstrated, что некоторые клеточные субпопуляции есть опухоль начала свойствами и, таким образом, весьма актуальны для патогенезе рака 19,20. Масс-спектрометрии, как стало более чувствительным в последние годы, количественные анализы протеомические являются выполнимыми для малых количеств белка, который может быть получен из нескольких тысяч клеток, что делает возможным, чтобы сосредоточить внимание на функционально соответствующие клеточных популяций.
Настройка, представленная здесь может быть использован для идентификации и проверки новых диагностических биомаркеров в образцах FFPE. Таким образом, он обещает BEA полезный инструмент для улучшения клинической диагностики, как на сегодняшний день по-прежнему отсутствие молекулярных биомаркеров в необходимом количестве и качестве для многих типов рака. Важные примеры сложных дифференциальных диагнозов, для которого биомаркеров отсутствуют, являются дискриминации между первичным раком легких с метастазами в легких, intrapancreatic холангиоцеллюлярный карциномы и аденокарциномы поджелудочной, а также отличаетсяПроизводная доброкачественной нейрофибромы от высокой злокачественных периферийных опухолей нервных оболочки. Более того, мы и другие показали, что количественное выяснение протеомическим подписей могут быть полезны при изучении биологии клеток рака в целом, так и для выявления прогностических биомаркеров терапевтического ответа у больных раком 21.
В настоящее время два недостатки метода, представленные здесь, требование для широкого ручной обработки образца и спрос на nanoLC-MS / MS время приобретения. В то время как первые могут быть решены путем перемещения подготовки пробы, например, форматирует 96-а и используя робота обработку, последний потребует изменения в средствах массовой стратегию приобретения спектрометрический. После того, как подмножества белков-мишеней были определены, которые могут быть связаны с, например, классификации опухолей, мы предусматриваем конструкцию целевых методов масс-спектрометрии, которые обеспечивают количественные показания для этих подмножеств с сильно пониженным усилием отрыва, иПоэтому с соответствующим сокращением времени приобретения. Если требуемое время приобретения требуется может быть сокращен с 24 – 36 ч (жидкие опухоли) или 3 ч (солидные опухоли), чтобы например, 1 час использование целевых масс-спектрометрии и простой одномерный разделение пептидов, то в результате усиления пропускной могут быть использованы, чтобы значительно увеличить количество биологических и технических повторов рассмотренных с соответствующими улучшения в значимости результатов количественного определения. Целевые подходы масс-спектрометрии уже было продемонстрировано, что подходящий инструмент для проверки раком белок, ассоциированный с биомаркеров-кандидатов 22, и были разработаны до точки, где они показывают обещание для проверки или даже в качестве потенциального инструмента для рутинного клинического использования 23 , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |