In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
Análises aprofundadas de proteomas de células de câncer são necessários para elucidar pathomechanisms oncogênicos, assim como para identificar alvos potenciais drogas e biomarcadores de diagnóstico. No entanto, os métodos para caracterização proteômica quantitativa de tumores derivados do paciente e em particular as suas subpopulações celulares são muito insuficientes. Aqui nós descrevemos um experimental set-up que permite a análise quantitativa de proteomas de subpopulações de células de câncer derivada de tumores líquidos ou sólidos. Isto é conseguido através da combinação de estratégias de enriquecimento celulares com espectrometria de massa baseia-Super-SILAC seguido por análise quantitativa dos dados de bioinformática. Para enriquecer subconjuntos celulares específicos, tumores líquidos são primeiro immunophenotyped por citometria de fluxo seguido de FACS-ordenação; para os tumores sólidos, por captura de laser de microdissecação é usado para purificar as subpopulações celulares específicos. Num segundo passo, as proteínas são extraídas das células purificadas e posteriormente combinados com um específico para o tumor,SILAC marcado padrão espiga em que permite a quantificação da proteína. A mistura de proteína resultante é submetido a electroforese em gel ou filtro ou Aided Preparação da Amostra (FASP) seguido por digestão tríptica. Finalmente, os péptidos trípticos são analisados utilizando um espectrómetro de massa de quadrupolo-Orbitrap híbrido, e os dados obtidos são processados com pacotes de software de bioinformática, incluindo MaxQuant. Por meio do fluxo de trabalho aqui apresentado, até 8000 proteínas podem ser identificados e quantificados em amostras derivadas de pacientes, e os perfis de expressão de proteínas resultantes podem ser comparados entre pacientes para identificar as assinaturas de proteómica ou de diagnóstico potenciais alvos de drogas.
Proteômica baseada em espectrometria de massa surgiu e agora é uma disciplina amplamente utilizado em biologia celular e investigação biomédica translacional. Os avanços técnicos no campo, foi possível estudar os processos celulares complexos em linhas de células e modelos animais, como milhares de proteínas podem ser identificadas em um único experimento de espectrometria de massa 1,2. Progresso semelhante foi feita por análise de várias modificações pós-traducionais tais como a fosforilação ou ubiquitinação, embora isto geralmente requer fluxos de trabalho à medida para o enriquecimento e a análise dos dados para cada tipo de modificação 2,3. Além disso, o envolvimento das estratégias de rotulagem químicas e metabólicas, incluindo SILAC, permite a quantificação precisa relativa de proteínas e PTMs, tornando este método particularmente atraentes para a descoberta de processos celulares básicos, diagnóstico biomarcadores e alvos potenciais drogas em cancro humano 4.
No entanto,vários desafios precisam ser superados em relação à análise proteômica dos cânceres humanos primários 5. Em primeiro lugar, as amostras de cancro humano apresentam frequentemente um elevado grau de heterogeneidade celular que é devido à presença de vários tipos de células que pertencem ao microambiente tumoral, incluindo células do sistema imunológico e fibroblastos. Em segundo lugar, a evolução clonal leva a diversidade genética dentro de si os tumores, resultando na existência de várias subpopulações celulares com propriedades funcionais distintas. De acordo com o conceito atual de algumas células-tronco do câncer, sendo as forças motrizes do desenvolvimento e progressão do câncer, análise proteômica dessas subpopulações celulares (funcionalmente altamente relevantes) é esperado para ser de grande importância para uma melhor compreensão dos mecanismos oncogênicos relevante para a aplicação clínica 6. Em terceiro lugar, os perfis de expressão de proteínas quantitativos de grandes conjuntos de amostras são muitas vezes necessários para a identificação de Biomar clínico fiávelkers; esta não pode ser conseguida por marcação química, tais como iTRAQ 7, enquanto que as estratégias de marcação metabólica – contando, como o fazem, com a proliferação celular 4 – não têm aplicação. Em quarto lugar, a maioria das amostras de tumores sólidos que estão disponíveis são fixados em formalina, o que complica a análise de espectrometria de massa proteoma devido à formação de ligações cruzadas de proteína 8. Por fim, a maioria dos fluxos de trabalho existentes proteômica requerem quantidades significativas de processamento de amostras e aquisição de dados, tornando a análise dos números de amostras relevantes para a investigação clínica difícil, e chamando para novo fluxo de trabalho paradigmas 9,10.
Para enfrentar esses obstáculos, desenvolvemos uma montagem experimental que combina ou célula de citometria de fluxo de classificação 11 ou captura a laser microdissection 12,13 para o enriquecimento celular com uma estratégia de Super-SILAC 14 a introduzir uma norma interna global para análise por espectrometria de massa global. Ao utilizar o método aqui descrito, é possível quantificar até 8.000 proteínas em amostras de tumores humanos individuais derivadas de cancros, quer líquido ou sólido.
Perfis de espectrometria de massa de proteomas-celulares de cancro derivadas de pacientes é necessária para a descoberta de novos biomarcadores preditivos de diagnóstico / bem como para se obter uma melhor compreensão da biologia das células do cancro, que pode por sua vez conduzir à identificação de novos alvos potenciais drogas. No entanto, tais análises de espectrometria de massa são altamente desafiador, em particular porque várias questões pré-analíticos têm de ser resolvidos, se se quiser obter resultados robustos e biologicamente relevantes.
O fluxo de trabalho experimental descrito aqui permite a caracterização proteômica quantitativa de proteomas derivados de subpopulações celulares de ambos os tumores sólidos e líquidos. É necessário efectuar o enriquecimento inicial de células tumorais, quer por FACS com base nas células-sortingor microdissecação para evitar a contaminação por células do microambiente do tumor. Além disso, estas técnicas permitem isolar subpopulações celulares de interesse. Estudos com células-biológico recentes têm demôniostrated que determinadas subpopulações celulares têm propriedades de iniciação do tumor e são, portanto, altamente relevante para a patogênese do câncer 19,20. Como espectrometria de massa tornou-se mais sensível nos últimos anos, as análises proteômicas quantitativos são viáveis para as pequenas quantidades de proteína que podem ser derivadas de alguns milhares de células, tornando possível para se concentrar em populações de células funcionalmente relevantes.
A configuração aqui apresentado pode ser utilizado para identificar e validar novos biomarcadores de diagnóstico em amostras de FFPE. Por isso, promete bea ferramenta útil para a melhoria do diagnóstico clínico, a data ainda há uma falta de biomarcadores moleculares em número e em qualidade adequada para vários tipos de câncer. Exemplos importantes de diagnósticos diferenciais difíceis, para os quais biomarcadores estão faltando, são a discriminação entre câncer de pulmão primário de metástases no pulmão, carcinoma colangiocelular intrapancreatic e adenocarcinoma do pâncreas, assim como diferemciação de neurofibroma entre tumores benignos e de bainha de nervo periférico altamente malignas. Além disso, nós e outros demonstraram que a elucidação quantitativa de assinaturas proteomic pode ser útil no estudo da biologia celular de cancro em geral, e para revelar biomarcadores preditivos da resposta terapêutica em doentes com cancro 21.
Duas desvantagens atuais do método aqui apresentado são a exigência de ampla amostra de transformação manual e a demanda de nanoLC-MS / MS tempo de aquisição. Enquanto o primeiro pode ser abordada, movendo a preparação da amostra para por exemplo, formatos de 96 poços e usando processamento robótico, este último vai exigir uma mudança na estratégia de aquisição de espectrometria de massa. Uma vez que os subconjuntos de proteínas-alvo foram identificadas, que pode estar associada com, por exemplo, classificação de tumores, prevemos a concepção de métodos de espectrometria de massa-alvo que fornecem leituras quantitativas para estes subconjuntos com um esforço bastante reduzido de separação, eportanto, com a correspondente redução do tempo de aquisição. Se o tempo de aquisição necessária requerida pode ser reduzida 24-36 hr (tumores líquidos) ou 3 h (tumores sólidos) para, por exemplo, 1 hora usando espectrometria de massa e a separação de péptidos unidimensional simples, então o ganho em rendimento resultante alvo Pode ser utilizado para aumentar significativamente o número de réplicas biológicas e técnicas examinados, com a melhoria correspondente na significância dos resultados de quantificação. Abordagens de espectrometria de massa visados já foi demonstrado ser uma ferramenta adequada para a verificação de associados a cancro da proteína biomarcadores candidatos-22, e têm sido desenvolvidos para um ponto onde eles são promissores para a validação ou mesmo como uma potencial ferramenta para o uso clínico de rotina 23 , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |