In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
في عمق تحليل proteomes الخلايا السرطانية وهناك حاجة لتوضيح pathomechanisms أنكجنيك، وكذلك لتحديد أهداف المخدرات المحتملة والمؤشرات الحيوية التشخيصية. ومع ذلك، أساليب لتوصيف بروتيوميك الكمي للأورام المستمدة من المريض وخاصة في القطعان الخلوية تفتقر إلى حد كبير. نحن هنا وصف تجريبي مجموعة المتابعة الذي يسمح التحليل الكمي للproteomes المجموعات السكانية الفرعية الخلايا السرطانية المشتقة من الأورام إما سائلة أو صلبة. ويتحقق ذلك من خلال الجمع بين استراتيجيات تخصيب الخلوية مع الكمي قياس الطيف الكتلي مقرها سوبر SILAC يليه تحليل البيانات بيوينفورمتيك. لإثراء مجموعات فرعية الخلوية محددة، وimmunophenotyped الأورام السائلة أول مرة من قبل التدفق الخلوي تليها FACS الفرز. لالأورام الصلبة، ويستخدم الليزر التقاط تسليخ مجهري لتنقية مجموعات سكانية فرعية الخلوية محددة. في الخطوة الثانية، يتم استخراج البروتينات من خلايا النقاء والجمع في وقت لاحق مع وجود ورم محددة،SILAC المسمى-ارتفاع في مستوى تمكن البروتين الكمي. يخضع الناتجة خليط من البروتين إما الكهربائي للهلام أو تصفية (فلترة) بمساعدة تحضير العينة (FASP)، يليه الهضم زيتية. وأخيرا، يتم تحليل الببتيدات زيتية باستخدام-رباعي orbitrap مطياف الكتلة الهجين، وتتم معالجة البيانات التي تم الحصول عليها مع مجموعات البرامج بيوينفورمتيك بما في ذلك MaxQuant. من خلال سير العمل المعروضة هنا، يصل إلى 8،000 البروتينات يمكن تحديدها كميا وفي عينات المستمدة من المريض، ويمكن مقارنة مما أدى لمحات البروتين التعبير بين المرضى لتحديد التوقيعات البروتين التشخيص أو الأهداف المحتملة المخدرات.
وقد برزت البروتيوميات القائم على مطياف الكتلة والآن الانضباط تستخدم على نطاق واسع في بيولوجيا الخلية والبحوث الطبية الحيوية متعدية. جعلت التطورات التقنية في مجال من الممكن لدراسة العمليات الخلوية المعقدة في خطوط الخلايا والنماذج الحيوانية، كما يمكن التعرف على آلاف البروتينات في واحدة جماعية التجربة الطيفي 1،2. وقد تم إحراز تقدم مماثل لتحليل العديد من التعديلات ما بعد النقل مثل الفسفرة أو ubiquitination، على الرغم من أن هذا يتطلب عادة سير العمل مفصل لتخصيب اليورانيوم وتحليل البيانات لكل نوع من التعديل 2،3. وعلاوة على ذلك، وإشراك استراتيجيات وضع العلامات الكيميائية والتمثيل الغذائي، بما في ذلك SILAC، تمكن الكمي النسبي دقيق من البروتينات وPTMs، مما يجعل هذه الطريقة جاذبية خاصة لاكتشاف العمليات الخلوية الأساسية، والمؤشرات الحيوية التشخيصية والأهداف المحتملة المخدرات في سرطان البشري 4.
ومع ذلك،العديد من التحديات لا بد من التغلب عليها فيما يتعلق تحليل البروتين من السرطانات البشرية الابتدائية 5. أولا وقبل كل شيء، عينات سرطانية بشرية غالبا ما تظهر درجة عالية من التجانس الخلوية التي ويرجع ذلك إلى وجود مختلف أنواع الخلايا التي تنتمي إلى المكروية الورم، بما في ذلك الخلايا المناعية والخلايا الليفية. ثانيا، تطور نسيلي يؤدي إلى التنوع الجيني داخل الأورام نفسها، مما أدى إلى وجود عدة مجموعات سكانية فرعية الخلوية مع خصائص وظيفية متميزة. وفقا لمفهوم الحالي لعدد قليل من الخلايا الجذعية السرطانية كونها القوى الدافعة وراء تطور مرض السرطان والتقدم، تحليل البروتين من هذه القطعان الخلوية (وظيفيا ذات الصلة للغاية) ومن المتوقع أن تكون ذات أهمية كبيرة لفهم أفضل لآليات أنكجنيك ذات الصلة لتطبيق السريرية 6. ثالثا، غالبا ما يتطلب كمية البروتين ملامح التعبير عن مجموعات كبيرة من العينات لتحديد BIOMAR السريرية قويةاستعادة الطاقة الحركية. هذا لا يمكن أن يتحقق عن طريق وضع العلامات الكيميائية مثل iTRAQ 7، في حين استراتيجيات وضع العلامات الأيضية – التي تعتمد، كما يفعلون، على انتشار الخلوي 4 – غير قابلة للتطبيق بالمثل. رابعا، معظم عينات الورم الصلبة المتوفرة هي الثابتة الفورمالين، مما يعقد الشامل التحليل الطيفي بروتيوم بسبب تشكيل crosslinks البروتين 8. وأخيرا، فإن معظم سير العمل البروتينات الموجودة تتطلب كميات كبيرة من تجهيز العينات والحصول على البيانات، مما يجعل تحليل أرقام عينة ذات الصلة للبحوث السريرية الصعب، والدعوة لسير العمل الجديد نماذج 9،10.
لمعالجة هذه العقبات التي وضعت الإعداد التجريبية التي تجمع بين إما خلية تدفق cytometric فرز 11 أو الليزر التقاط تسليخ مجهري 12،13 لتخصيب الخليوي مع استراتيجية سوبر SILAC 14 إلى إدخال المعيار الداخلي العالمي للتحليل الطيفي الشامل الشامل. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، فمن الممكن لتحديد ما يصل إلى 8،000 البروتينات في واحدة عينات الورم الإنسان المستمدة من السرطانات إما سائلة أو صلبة.
وهناك حاجة التنميط الطيفي الشامل من proteomes سرطان الخلايا المشتقة من المريض لاكتشاف المؤشرات الحيوية التنبؤية / التشخيص الجديدة، وكذلك لإعطاء فهم أفضل للبيولوجيا الخلايا السرطانية، والتي قد تؤدي بدورها إلى تحديد أهداف أدوية جديدة محتملة. ومع ذلك، فإن مثل هذه التحليلات الطيفي الشامل تشكل تحديا للغاية، ولا سيما بسبب مختلف القضايا قبل التحليلية يجب أن تحل، إذا واحد هو الحصول على نتائج قوية وذات الصلة من الناحية البيولوجية.
سير العمل التجريبي وصفها هنا يسمح لتوصيف بروتيوميك الكمي للproteomes المستمدة من القطعان الخلوية على حد سواء الأورام السائلة والصلبة. هناك حاجة لتخصيب الأولي من الخلايا السرطانية من قبل أي أساس FACS خلايا-sortingor تسليخ مجهري لتجنب التلوث بواسطة خلايا الورم المكروية. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه التقنيات واحدة لعزل مجموعات سكانية فرعية الخلوية في المصالح. دراسات الخلايا البيولوجية الأخيرة لها شيطانstrated أن بعض المجموعات السكانية الفرعية الخلوية لها خصائص بدء الورم وبالتالي فهي ذات أهمية كبيرة لسرطان المرضية 19،20. كما أصبح قياس الطيف الكتلي أكثر حساسية في السنوات الأخيرة، والتحليلات البروتين الكمية مجدية لكميات صغيرة من البروتين التي يمكن استخلاصها من بضعة آلاف من الخلايا، مما يجعل من الممكن للتركيز على السكان الخلية ذات الصلة وظيفيا.
مجموعة المتابعة المقدمة هنا يمكن استخدامها لتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية التشخيصية الجديدة في عينات FFPE. وبالتالي، فمن عود لBEA أداة مفيدة لتحسين التشخيص السريري، وحتى الآن لا يزال هناك نقص في المؤشرات الحيوية الجزيئية في عدد كاف والجودة لكثير من أنواع السرطان. أمثلة هامة من تشخيصات تفريقية الصعبة، التي المؤشرات الحيوية غير موجودة، هي التمييز بين سرطان الرئة الأولية من الانبثاث في الرئة، وسرطان خلايا الأقنية الصفراوية داخل البنكرياس وغدية البنكرياس، وكذلك تختلفentiation من ورم ليفي عصبي حميدة من الأورام العصبية الطرفية غمد الخبيثة للغاية. وعلاوة على ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أن توضيح كمية من التوقيعات البروتين يمكن أن تكون مفيدة في دراسة بيولوجيا الخلايا السرطانية بشكل عام، وللكشف عن المؤشرات الحيوية التنبؤية للاستجابة العلاجية في علاج مرضى السرطان 21.
اثنين من السلبيات الحالية للالطريقة المعروضة هنا هي شرط اليدوي للواسعة تجهيز العينات والطلب على nanoLC-MS / MS اكتساب الوقت. في حين أن الأول يمكن معالجتها عن طريق تحريك إعداد نموذج لمثل تنسيقات 96-جيدا واستخدام المعالجة الروبوتية، وهذا الأخير سوف يتطلب تغييرا في استراتيجية الاستحواذ الجماعية الطيفي. مرة واحدة وقد تم تحديد مجموعات فرعية من البروتينات المستهدفة التي يمكن أن تترافق مع مثل تصنيف الورم، ونحن نتصور تصميم أساليب مطياف الكتلة الهادفة والتي تقدم قراءات الكمية لهذه المجموعات الفرعية مع جهد فصل تقلص إلى حد كبير، ووبالتالي مع انخفاض في المقابل اكتساب الوقت. إذا كان اكتساب الوقت المطلوب ويمكن خفض من 24 المطلوبة – 36 ساعة (أورام السائلة) أو 3 ساعة (الأورام الصلبة) لسبيل المثال، 1 ساعة باستخدام استهدفت قياس الطيف الكتلي والفصل بسيط أحادي البعد من الببتيدات، ثم ينتج عنها من مكاسب في الإنتاجية يمكن استخدامها لزيادة كبيرة في أعداد مكررات البيولوجية والتقنية فحصها، مع تحسينات في المقابلة على أهمية النتائج الكمي. وقد تم بالفعل أثبت النهج الطيفي الجماعية المستهدفة ليكون أداة مناسبة للتحقق من السرطان المرتبط بالبروتين العلامات البيولوجية-22 مرشحا، وتم تطويرها لنقطة حيث أنها تظهر الوعد للمصادقة أو حتى كأداة محتملة للاستخدام السريري الروتيني 23 ، 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |