In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
में गहराई से कैंसर सेल proteomes का विश्लेषण करती है oncogenic pathomechanisms स्पष्ट करने के लिए, साथ ही संभावित दवा लक्ष्य और नैदानिक बायोमार्कर की पहचान करने की जरूरत है। हालांकि, मरीज व्युत्पन्न ट्यूमर की और विशेष रूप से उनके सेलुलर उप-जनसंख्या में मात्रात्मक प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए तरीकों में काफी हद तक कमी कर रहे हैं। यहाँ हम तरल या ठोस ट्यूमर या तो से निकाली गई कैंसर कोशिका उप-जनसंख्या का proteomes के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक प्रयोगात्मक सेट अप का वर्णन है। यह पहले से पंजीकृत डेटा विश्लेषण द्वारा पीछा मात्रात्मक सुपर SILAC आधारित मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सेलुलर संवर्धन रणनीतियों के संयोजन के द्वारा हासिल की है। FACS-छँटाई द्वारा पीछा cytometry के विशिष्ट सेलुलर सबसेट को समृद्ध करने के लिए, तरल ट्यूमर पहले प्रवाह से immunophenotyped कर रहे हैं; ठोस ट्यूमर के लिए, लेजर कब्जा microdissection के विशिष्ट सेलुलर उप-जनसंख्या को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चरण में एक दूसरे, प्रोटीन शुद्ध कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और बाद में एक ट्यूमर विशेष के साथ संयुक्त,प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता है कि कील में मानक SILAC लेबल। जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन मिश्रण जेल वैद्युतकणसंचलन या tryptic पाचन द्वारा पीछा फ़िल्टर एडेड नमूना तैयार (FASP) या तो के अधीन है। अंत में, tryptic पेप्टाइड्स एक संकर quadrupole-Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं, और प्राप्त आंकड़ों MaxQuant सहित पहले से पंजीकृत सॉफ्टवेयर सूट के साथ कार्रवाई कर रहे हैं। 8000 प्रोटीन अप करने के लिए, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह के माध्यम से पहचाना जा सकता है और मरीज व्युत्पन्न नमूनों में मात्रा निर्धारित है, और जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल नैदानिक प्रोटिओमिक हस्ताक्षर या संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए मरीजों के बीच तुलना की जा सकती।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स में उभरा है और कोशिका जीव विज्ञान और translational जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल अनुशासन अब है। प्रोटीन के हजारों एक भी बड़े पैमाने पर Spectrometric प्रयोग 1,2 में पहचाना जा सकता है के रूप में क्षेत्र में तकनीकी प्रगति, सेल लाइनों और पशु मॉडल में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना दिया है। यह आमतौर पर संशोधन 2,3 के प्रत्येक प्रकार के संवर्धन और डेटा विश्लेषण के लिए bespoke वर्कफ़्लोज़ की आवश्यकता है, हालांकि इसी प्रकार प्रगति, इस तरह के फास्फारिलीकरण या ubiquitination के रूप में कई posttranslational संशोधनों के विश्लेषण के लिए किया गया है। इसके अलावा, SILAC सहित रासायनिक और चयापचय लेबलिंग रणनीतियों, की भागीदारी मानव कैंसर चार में बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं, नैदानिक बायोमार्कर और संभावित दवा लक्ष्यों की खोज के लिए इस पद्धति का विशेष रूप से आकर्षक बना रही है, प्रोटीन और PTMs की सटीक सापेक्ष मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।
हालांकि,कई चुनौतियों का प्राथमिक मानव के कैंसर 5 की प्रोटिओमिक विश्लेषण के संबंध में दूर किया जा करने के लिए है। सबसे पहले, मानव कैंसर के नमूने अक्सर प्रतिरक्षा कोशिकाओं और fibroblasts सहित ट्यूमर microenvironment, से संबंधित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति की वजह से है कि सेलुलर विविधता के एक उच्च स्तर दिखा। दूसरे, क्लोनल विकास विशिष्ट कार्यात्मक गुणों के साथ कई सेलुलर उप-जनसंख्या के अस्तित्व में है, जिसके परिणामस्वरूप खुद को ट्यूमर के भीतर आनुवंशिक विविधता की ओर जाता है। कैंसर के विकास और प्रगति, इस तरह के (कार्यात्मक अत्यधिक प्रासंगिक) सेलुलर उप-जनसंख्या का प्रोटिओमिक विश्लेषण के पीछे चला बलों जा रहा है कुछ कैंसर स्टेम कोशिकाओं की वर्तमान अवधारणा के अनुसार नैदानिक आवेदन के लिए प्रासंगिक oncogenic तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए बड़े महत्व का होने की उम्मीद है 6। तीसरा, नमूने के बड़े सेट की मात्रात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अक्सर मजबूत नैदानिक BIOMAR की पहचान के लिए आवश्यक हैंkers; भरोसा है कि वे कर के रूप में सेलुलर प्रसार 4 पर, – – वैसे ही अयोग्य हैं चयापचय लेबलिंग रणनीतियों, जबकि इस तरह के iTRAQ 7 के रूप में रासायनिक लेबलिंग के द्वारा पूरा नहीं किया जा सकता। चौथे, सबसे उपलब्ध ठोस ट्यूमर के नमूने formalin तय की वजह से प्रोटीन crosslinks 8 के गठन के लिए बड़े पैमाने पर Spectrometric proteome विश्लेषण पेचीदा जो कर रहे हैं। अंत में, सबसे मौजूदा प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लोज़ मुश्किल नैदानिक अनुसंधान के लिए प्रासंगिक नमूना संख्या के विश्लेषण के प्रतिपादन नमूना प्रसंस्करण और डाटा अधिग्रहण के महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है, और नए कार्यप्रवाह के लिए बुला 9,10 लद।
इन बाधाओं को संबोधित करने के लिए हम व्यापक बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण के लिए एक वैश्विक आंतरिक मानक लागू करने के लिए एक सुपर SILAC 14 रणनीति के साथ सेलुलर संवर्धन के लिए 11 या लेजर कब्जा microdissection के 12,13 छँटाई या तो प्रवाह cytometric सेल को जोड़ती है कि एक प्रयोगात्मक सेटअप विकसित। यहाँ वर्णित विधि का उपयोग करके, यह तरल या ठोस तरह के कैंसर या तो से ली गई एक मानव ट्यूमर के नमूनों में 8000 प्रोटीन अप करने के लिए यों तो संभव है।
रोगी व्युत्पन्न कैंसर सेल proteomes के मास Spectrometric रूपरेखा नई नैदानिक / भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज के लिए भी आवश्यक है और साथ ही कैंसर कोशिका जीव विज्ञान की एक बेहतर समझ देने के लिए जो हो सकता है नए संभावित दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए बारी के नेतृत्व में। विभिन्न पूर्व विश्लेषणात्मक मुद्दों में से एक मजबूत और जैविक रूप से प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए है, तो हल कर सकता है, क्योंकि हालांकि, इस तरह बड़े पैमाने पर Spectrometric विश्लेषण, विशेष रूप से अत्यधिक चुनौती दे रहे हैं।
यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह तरल और ठोस ट्यूमर दोनों के सेलुलर उप-जनसंख्या से निकाली गई proteomes की मात्रात्मक प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। या तो FACS आधारित सेल sortingor microdissection के द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं के प्रारंभिक संवर्धन ट्यूमर microenvironment की कोशिकाओं द्वारा संक्रमण से बचने की जरूरत है। इसके अलावा, इन तकनीकों का एक ब्याज के सेलुलर उप-जनसंख्या को अलग करने की अनुमति देते हैं। हाल ही में सेल जैविक अध्ययन दानव हैकुछ सेलुलर उप-जनसंख्या ट्यूमर की शुरुआत गुण होते हैं और इस तरह के कैंसर रोगजनन 19,20 के लिए बेहद प्रासंगिक हैं strated। मास स्पेक्ट्रोमेट्री हाल के वर्षों में और अधिक संवेदनशील बन गया है, मात्रात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण, कुछ हजार कोशिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है कि प्रोटीन की छोटी मात्रा के लिए संभव है कि यह संभव कार्यात्मक प्रासंगिक सेल आबादी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए कर रही है।
यहाँ प्रस्तुत सेट अप FFPE नमूनों में उपन्यास नैदानिक बायोमार्कर की पहचान करने और मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, यह अभी भी कई प्रकार के कैंसर के लिए पर्याप्त संख्या और गुणवत्ता में आणविक बायोमार्कर की कमी है तिथि करने के लिए, के रूप में नैदानिक निदान के सुधार के लिए उपयोगी उपकरण बिया का वादा किया। बायोमार्कर कमी कर रहे हैं, जिसके लिए मुश्किल अंतर निदान के महत्वपूर्ण उदाहरण, फेफड़ों में मेटास्टेसिस, intrapancreatic cholangiocellular कार्सिनोमा और अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता से प्राथमिक फेफड़ों के कैंसर के बीच भेदभाव कर रहे हैं, साथ ही अलग-अलगअत्यधिक घातक परिधीय तंत्रिका-म्यान ट्यूमर से सौम्य neurofibroma की entiation। इसके अलावा, हम और दूसरों प्रोटिओमिक हस्ताक्षरों में से मात्रात्मक व्याख्या, सामान्य रूप में कैंसर कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने में और कैंसर रोगियों के 21 में चिकित्सीय प्रतिक्रिया का भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर खुलासा करने के लिए उपयोगी हो सकता है कि पता चला है।
यहाँ प्रस्तुत विधि के दो वर्तमान कमियां व्यापक मैनुअल नमूना प्रसंस्करण के लिए आवश्यकता और nanoLC-एमएस / एमएस अधिग्रहण के समय पर मांग कर रहे हैं। पूर्व उदाहरण के लिए, 96 अच्छी तरह से प्रारूपों के लिए नमूना तैयार करने जा रहा है और रोबोट संसाधन का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है, बाद में बड़े पैमाने पर Spectrometric अधिग्रहण रणनीति में बदलाव की आवश्यकता होगी। लक्ष्य प्रोटीन के सबसेट जैसे, ट्यूमर वर्गीकरण के साथ संबद्ध किया जा सकता है कि पहचान की गई है एक बार, हम एक बहुत कम जुदाई प्रयास के साथ इन कैंपेन्स के लिए मात्रात्मक readouts प्रदान करते हैं कि लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री के तरीकों की डिजाइन की परिकल्पना की गई है, औरइसलिए एक तदनुसार कम अधिग्रहण के समय के साथ। 24 से कम किया जा सकता है आवश्यक आवश्यक अधिग्रहण के समय तो – 36 घंटे (तरल ट्यूमर) या 3 घंटा (ठोस ट्यूमर) उदाहरण के लिए, एक घंटा तो मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पेप्टाइड्स के एक सरल एक आयामी जुदाई, throughput में जिसके परिणामस्वरूप लाभ लक्षित का उपयोग मात्रा का ठहराव परिणामों के महत्व के क्षेत्र में सुधार के लिए इसी के साथ जांच की, जैविक और तकनीकी प्रतिकृति की काफी संख्या को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लक्षित जन के Spectrometric दृष्टिकोण पहले से ही कैंसर से जुड़े प्रोटीन बायोमार्कर-उम्मीदवारों में 22 के सत्यापन के लिए एक उपयुक्त उपकरण होने का प्रदर्शन किया गया है, और वे सत्यापन के लिए या यहां तक कि नियमित नैदानिक उपयोग 23 के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में वादा शो जहां एक बिंदु के लिए विकसित किया गया है 24।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |