In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
Diepgaande analyses kanker cel proteoom nodig oncogene pathomechanisms helderen, alsmede potentiële drug targets en diagnostische biomarkers identificeren. Echter, zijn methoden voor de kwantitatieve proteomics karakterisering van de patiënt afgeleid tumoren en in het bijzonder hun cellulaire subpopulaties ontbreken grotendeels. Hier beschrijven we een experimentele set-up die kwantitatieve analyse van proteomen van kankercel subpopulaties afgeleid van vloeibare of vaste tumoren mogelijk maakt. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën combineren met kwantitatieve Super-SILAC gebaseerde massaspectrometrie gevolgd door bio gegevensanalyse. Naar specifieke cellulaire subsets te verrijken, worden vloeibare tumoren eerst immunophenotyped door flowcytometrie gevolgd door FACS-sortering; voor solide tumoren, is laser-capture microdissection gebruikt om specifieke cellulaire subpopulaties te zuiveren. In een tweede stap worden eiwitten geëxtraheerd uit de gezuiverde cellen en vervolgens gecombineerd met een tumor-specifieke,SILAC gemerkte spike in standaard dat eiwit kwantificering mogelijk maakt. Het verkregen eiwitmengsel onderworpen aan ofwel gelelektroforese of Filter Aided Monsterbereiding (FASP) gevolgd door tryptische digestie. Tenslotte worden tryptische peptiden geanalyseerd met een hybride quadrupool-massaspectrometer orbitrap, en de verkregen gegevens worden verwerkt met bioinformatica software pakketten zoals MaxQuant. Met behulp van de hier gepresenteerde tot 8000 eiwitten workflow worden geïdentificeerd en gekwantificeerd patiënt afgeleide monsters, en de resulterende eiwitexpressie profielen kunnen vergeleken worden bij patiënten met diagnostische proteomics handtekeningen of potentiële drug targets te identificeren.
Massaspectrometrie gebaseerde proteomics is ontstaan en is nu een veel gebruikte discipline in de celbiologie en translationeel biomedisch onderzoek. Technische vooruitgang op het gebied hebben het mogelijk om complexe cellulaire processen in cellijnen en diermodellen studie gemaakt als duizenden eiwitten kunnen worden geïdentificeerd in een enkele massaspectrometrische experiment 1,2. Soortgelijke vooruitgang geboekt voor de analyse van vele posttranslationele modificaties zoals fosforylering of ubiquitinatie, hoewel maat werkstromen voor verrijking en gegevensanalyse voor elk type modificatie 2,3 meestal vereist. Bovendien is de betrokkenheid van chemische en metabolische labeling strategieën, waaronder SILAC, maakt een nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitten en PTMs, waardoor deze werkwijze bijzonder aantrekkelijk voor de ontdekking van biologische processen, diagnostische biomarkers en potentiële drug targets in verschillende kankers 4.
Echter,verschillende uitdagingen overwonnen moeten worden met betrekking tot proteomics analyse van primaire menselijke kankers 5. Allereerst menselijke kanker monsters vertonen vaak een hoge mate van cellulaire heterogeniteit die door de aanwezigheid van verschillende celtypes behoren tot de tumor micro-omgeving, zoals immune cellen en fibroblasten. Tweede klonale evolutie leidt genetische diversiteit in de tumoren zelf, waardoor het bestaan van verscheidene cellulaire subpopulaties met verschillende functionele eigenschappen. Volgens het huidige concept van een paar kanker stamcellen zijn de drijvende krachten achter de ontwikkeling en progressie van kanker, proteomics analyse van dergelijke (functioneel zeer relevant) cellulaire subpopulaties verwachting is van groot belang voor een beter begrip van oncogene mechanismen die relevant zijn voor klinische toepassing 6. Ten derde kwantitatieve eiwitexpressie profielen van grote series monsters vaak vereist voor de identificatie van robuuste klinische Biomarkers; Dit kan niet worden bereikt door chemische labeling zoals iTRAQ 7, terwijl metabolisch merken strategieën – vertrouwen, aangezien zij op cellulaire proliferatie 4 – zijn eveneens van toepassing. Vierde meeste beschikbare vaste tumor monsters in formaline gefixeerd, die massaspectrometrische proteoom analyse bemoeilijkt door de vorming van eiwit crosslinks 8. Tot slot, de meeste bestaande proteomics workflows vereisen aanzienlijke hoeveelheden monster verwerking en data-acquisitie, waardoor de analyse van de aantallen monsters die relevant zijn voor klinisch onderzoek moeilijk, en waarin wordt opgeroepen tot nieuwe workflow paradigma 9,10.
Om deze obstakels te pakken we een experimentele opstelling die ofwel Stromingscytometrische cel combineert het sorteren 11 of laser-capture microdissection 12,13 voor cellulaire verrijking met een Super-SILAC 14 strategie om een wereldwijde interne standaard voor een uitgebreide massaspectrometrische analyse introduceren ontwikkeld. Met de hier beschreven werkwijze is het mogelijk te kwantificeren tot 8.000 eiwitten in enkele humane tumormonsters afgeleid van vloeibare of vaste kankers.
Massaspectrometrische profilering van patiënt afgeleide kanker cel proteoom is nodig voor de ontdekking van nieuwe diagnostische / predictieve biomarkers alsook een beter begrip van kanker celbiologie geven die op hun beurt leiden tot de identificatie van nieuwe potentiële drug targets kunnen. Dergelijke massaspectrometrische analyses zijn zeer uitdagend, vooral omdat diverse pre-analytische problemen moeten worden opgelost, als men robuuste en biologisch relevante resultaten.
De experimentele workflow beschreven maakt kwantitatieve proteomics karakterisering van proteomen afgeleid van cellulaire subpopulaties van zowel vloeibare als vaste tumoren. De initiële verrijking van tumorcellen door een FACS-gebaseerde mobiele sortingor microdissectie nodig om verontreiniging door cellen van de tumor micro-omgeving voorkomen. Bovendien zijn deze technieken mogelijk maken om cellulaire subpopulaties van belang te isoleren. Recente celbiologische studies hebben demontoond dat bepaalde cellulaire subpopulaties hebben tumor-initiërende eigenschappen en zijn dus zeer relevant voor kanker pathogenese 19,20. Massaspectrometrie gevoeliger is geworden in de afgelopen jaren, kwantitatieve proteoomanalyse haalbaar voor kleine hoeveelheden eiwitten die kunnen worden afgeleid uit een paar duizend cellen, waardoor het mogelijk te concentreren op functioneel relevante celpopulaties.
De set-up hier gepresenteerd kan worden gebruikt om nieuwe diagnostische biomarkers in FFPE monsters identificeren en te valideren. Daarom belooft het nuttig hulpmiddel bea voor de verbetering van de klinische diagnostiek, aangezien er tot op heden nog onvoldoende moleculaire biomarkers in voldoende kwaliteit voor vele soorten kanker. Belangrijke voorbeelden van moeilijke differentiaaldiagnoses waarvoor biomarkers ontbreken, zijn het onderscheid tussen primaire longkanker van metastasen in de longen, intrapancreatic cholangiocellulaire carcinoom en pancreas adenocarcinoom, evenals verschillenentiation van goedaardige neurofibroom van zeer kwaadaardige perifere zenuw-schede tumoren. Bovendien wij en anderen hebben aangetoond dat kwantitatieve opheldering van proteomics handtekeningen nuttig bij het bestuderen kankercelbiologie in het algemeen en voor het openbaren voorspellende biomarkers therapeutische respons bij kankerpatiënten 21 kan zijn.
Twee huidige nadelen van de hier gepresenteerde methode de noodzaak van uitgebreide handleiding monster verwerking en vergt nanoLC-MS / MS acquisitietijd. Terwijl de eerste door het bewegen van monstervoorbereiding tot bv 96-well-formaten en met behulp van robotica verwerking kan worden aangepakt, zal de laatste van een verandering in massa strategie trometrische verkrijging te eisen. Zodra subsets van doeleiwitten geïdentificeerd die kunnen worden gekoppeld aan bijvoorbeeld tumorclassificatie, voorzien wij het ontwerp van gerichte massaspectrometrie methoden kwantitatieve uitlezingen deze deelverzamelingen met een sterk verminderde separatie inspanningen leveren, endaarom met een overeenkomstig verminderd acquisitie tijd. Indien de vereiste acquisitietijd nodig worden verlaagd 24-36 uur (vloeibaar tumoren) of 3 uur (vaste tumoren) op bijv, 1 uur met behulp van doelgerichte massaspectrometrie en eenvoudige eendimensionale scheiding van peptiden, dan is de resulterende winst overslag kunnen worden gebruikt om aanzienlijk het aantal biologische en technische repliceert onderzocht verhogen, met bijbehorende verbetering in de betekenis van kwantificering resultaten. Gerichte massaspectrometrische benaderingen reeds aangetoond een geschikt instrument voor de verificatie van kanker-geassocieerde eiwit biomarker-kandidaten 22 zijn, en zijn ontwikkeld tot een punt waar ze veelbelovend voor validatie of zelfs als een potentieel middel voor routinematig klinisch gebruik 23 , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |