In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
בניתוחים מעמיקים של proteomes תא הסרטני יש צורך להבהיר pathomechanisms שעור, כמו גם לזהות מטרות פוטנציאליות לתרופה, וסמנים דיאגנוסטיים. עם זאת, שיטות לאפיון proteomic כמותי של גידולים המופק מחולה ובתת-האוכלוסיות הסלולריות שלהם בפרט במידה רבה חסרות. כאן אנו מתארים ניסיוני הגדרה המאפשרת ניתוח כמותי של proteomes של תת-אוכלוסיות של תאי הסרטן נובעות משני גידולים נוזליים או מוצקים. זו מושגת על ידי שילוב של אסטרטגיות העשרה סלולריות עם ספקטרומטר מסה ואחריו ניתוח נתונים bioinformatic מבוסס Super-SILAC כמותיים. כדי להעשיר את תת סלולריים ספציפיים, גידולים נוזליים immunophenotyped ראשון על ידי זרימת cytometry אחרי FACS-מיון; לגידולים מוצקים, microdissection לייזר ללכוד משמש לטיהור תת-אוכלוסיות סלולריות ספציפיות. בשלב שני, חלבונים המופקים מהתאים המטוהרים ושילוב לאחר מכן עם גידול ספציפי,SILAC שכותרת סטנדרטי המאפשרת כימות חלבון ספייק-ב. תערובת חלבונים וכתוצאה מכך היא נתון או ג'ל אלקטרופורזה או לדוגמא סינון בעזרת הכנה (FASP) ואחריו עיכול tryptic. לבסוף, פפטידים tryptic מנותחים באמצעות ספקטרומטר מסת quadrupole-orbitrap היברידי, והנתונים המתקבלים מעובדים עם חבילות תוכנת bioinformatic כולל MaxQuant. באמצעות זרימת העבודה שהוצגה כאן, עד 8,000 חלבונים ניתן לזהות ולכמת בדגימות שמקורם בחולה, וניתן להשוות את פרופילי ביטוי חלבון וכתוצאה מכך בקרב חולים לזהות חתימות proteomic לאבחון או למטרות תרופה פוטנציאליות.
פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה התפתחה וכיום היא משמעת בשימוש נרחב בביולוגיה של תא ומחקר ביו-רפואי translational. התקדמות טכנית בתחום הפכה אותו ניתן ללמוד תהליכים תאיים מורכבים בשורות תאים ומודלים של בעלי חיים, כאלף חלבונים יכולים להיות מזוהות בניסוי ספקטרומטריה יחיד 1,2. התקדמות דומה נעשתה לניתוח רבים שינויי posttranslational כגון זרחון או ubiquitination, אם כי זה בדרך כלל דורש זרימות עבודה העידו להעשרה וניתוח נתונים עבור כל סוג של 2,3 שינוי. יתר על כן, מעורבותם של אסטרטגיות כימיות ומטבולית תיוג, כוללים SILAC, מאפשרת כימות היחסית מדויקת של חלבונים וPTMs, מה שהופך שיטה זו אטרקטיבית במיוחד לגילוי תהליכים בסיסיים סלולריים, סמנים דיאגנוסטיים ויעדים אפשריים לתרופה בסרטן בבני אדם 4.
עם זאת,כמה אתגרים יש להתגבר בכל קשור לניתוח proteomic של הסרטן אנושי ראשוני 5. קודם כל, דגימות סרטן בבני אדם לעתים קרובות להראות רמה גבוהה של ההטרוגניות סלולרית שנובעת מנוכחותם של סוגי תאים שונים השייכים למייקרו-הסביבה של הגידול, כולל תאים וfibroblasts חיסוניים. שנית, אבולוציה משובט מובילה למגוון גנטי בתוך הגידולים עצמם, וכתוצאה מכך קיומם של מספר תת-אוכלוסיות סלולריות עם תכונות פונקציונליות שונות. על פי התפיסה הנוכחית של כמה תאי גזע סרטני שהכוחות המניעים מאחורי התפתחות והתקדמות הסרטן, ניתוח proteomic של תת-אוכלוסיות (תפקודי רלוונטיות מאוד) כגון סלולריות צפוי להיות בעלת חשיבות גדולה להבנה טובה יותר של מנגנונים שעור רלוונטית ליישום קליני 6. שלישית, פרופילי ביטוי חלבון הכמותי של קבוצות גדולות של דגימות נדרשים לעתים לזיהוי biomar הקליני חזקKERS; זה לא יכול להיות מושלם על ידי תיוג כימי כגון 7 iTRAQ, ואילו אסטרטגיות תיוג מטבולית – הסתמכות, כפי שהם עושים, בהתרבות תאים 4 – הן גם ישימה. רביעית, רוב דגימות גידולים מוצקות הזמינות הן פורמלין-קבוע, אשר מסבך ניתוח proteome ספקטרומטריה עקב היווצרות של חלבון crosslinks 8. לבסוף, רוב תהליכי העבודה פרוטאומיקה הקיימת דורשים כמויות משמעותיות של עיבוד מדגם ורכישת נתונים, עיבוד הניתוח של מספרים לדוגמה רלוונטיים למחקר קליני קשה, וקוראות לעבודה חדשה פרדיגמות 9,10.
כדי לטפל במכשולים הללו פיתחנו התקנה ניסיונית המשלבת גם תא זרימת cytometric מיון 11 או לייזר ללכוד microdissection 12,13 להעשרה סלולרית עם אסטרטגית Super-SILAC 14 להציג תקן פנימי עולמי לניתוח ספקטרומטריה מקיף. על ידי שימוש בשיטה שתוארה כאן, אפשר לכמת עד 8,000 חלבונים בדגימות גידולים אנושיים אחת הנגזרות משני סוגי הסרטן נוזליים או מוצק.
פרופיל ספקטרומטריה של proteomes סרטן תאים שמקורם בחולה נדרש לגילוי של סמנים חזוי / אבחון חדשים, כמו גם לתת הבנה טובה יותר של ביולוגיה של סרטן תאים, אשר עשוי בתורו להוביל לזיהוי של מטרות פוטנציאליות לתרופה חדשות. עם זאת, ניתוחי ספקטרומטריה כאלה הם מאתגרים מאוד, במיוחד בגלל בעיות מראש אנליטיות שונות צריכים להיפתר, אם אחד הוא להשיג תוצאות חזקות ורלוונטיות מבחינה ביולוגית.
העבודה הניסויית המתוארת כאן מאפשרת אפיון כמותי של proteomic proteomes נגזר מאוכלוסיות סלולריות של שני גידולים נוזליים ומוצקים. יש צורך בהעשרה הראשונית של תאים סרטניים או על ידי microdissection התא-sortingor מבוסס FACS, כדי למנוע זיהום על ידי תאים של מייקרו-הסביבה של הגידול. יתר על כן, טכניקות אלו מאפשרות אחד לבודד אוכלוסיות סלולריות של עניין. מחקרי תא-ביולוגי אחרונים יש לי שדstrated שיש לי תת-אוכלוסיות סלולריות מסוימות נכסי ייזום-גידול ולכן הם רלוונטיים ביותר להיווצרות מחל סרטן 19,20. כספקטרומטריית מסה הפכה רגישה יותר בשנים האחרונות, ניתוחים כמותיים proteomic הם ריאלי עבור הכמויות הקטנות של חלבון שניתן להפיק מכמה אלף תאים, מה שמאפשרים להתמקד באוכלוסיות תאים רלוונטיות מבחינה תפקודית.
הסט-אפ שהוצג כאן יכול לשמש כדי לזהות ולאמת את סמנים דיאגנוסטיים רומן בדגימות FFPE. לפיכך, הוא מבטיח BEA כלי שימושי לשיפור אבחון קליני, כעד כה עדיין יש חוסר של סמנים ביולוגיים מולקולריים במספר ובאיכות נאותים לסוגים רבים של סרטן. דוגמאות חשובות של אבחנה מבדלת קשה, שלסמנים ביולוגיים חסרות, הן האפליה בין סרטן הריאות ראשוני מגרורות בריאות, קרצינומה cholangiocellular intrapancreatic ואדנוקרצינומה של לבלב, כמו גם שונותentiation של neurofibroma השפיר מגידולי עצבים היקפיים נדן הממאירים ביותר. יתר על כן, אנו ואחרים הראו כי הבהרת כמותי של חתימות proteomic יכולה להיות שימושית בלימוד ביולוגיה של תא הסרטן באופן כללי, ולחושפים סמנים ביולוגיים חזוי של תגובה לטיפול בחולי סרטן 21.
שני חסרונות הנוכחיים של השיטה שהוצגה כאן הם הדרישה לעיבוד מדגם ידני נרחב והביקוש בזמן רכישת NanoLC-MS / MS. בעוד ניתן לטפל לשעבר על ידי הזזת הכנת מדגם לדוגמה, פורמטים 96-היטב ובאמצעות עיבוד רובוטית, האחרון ידרוש שינוי באסטרטגיית רכישות ספקטרומטריה. ברגע תת קבוצות של חלבוני היעד זוהו שיכולה להיות קשורות לדוגמה, סיווג גידול, אנו חוזים את העיצוב של שיטות ספקטרומטריית מסה ממוקדות המספקות קריאות כמותי לתת אלה במאמץ הפרדה מופחת במידה ניכרת, ולכן עם זמן רכישה מופחתת בהתאם. אם זמן הרכישה הנדרש הנדרש יכול להיות מופחת 24-36 שעות (גידולים נוזליים) או 3 שעות (גידולים מוצקים) לדוגמה, שעה 1 באמצעות ספקטרומטר מסה ממוקדת והפרדה חד-ממדית פשוטה של פפטידים, אז רווח וכתוצאה מכך התפוקה יכול לשמש כדי להגדיל באופן משמעותי את מספרם של משכפל ביולוגי וטכני שנבדק, עם מקביל שיפורים במשמעות של תוצאות כימות. ממוקדת גישות ספקטרומטריה כבר הוכיחו להיות כלי מתאים לאימות של סמן ביולוגי-מועמדי חלבון סרטן הקשורים 22, ופותחו לנקודה שבה הם מראים הבטחה לאימות או אפילו ככלי פוטנציאלי לשימוש קליני שיגרתי 23 , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |