In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
Dybdeanalyser av kreft celle proteom er nødvendig for å belyse onkogene pathomechanisms, samt å identifisere potensielle narkotika mål og diagnostiske biomarkører. Imidlertid er metoder for kvantitativ karakterisering av proteomikk pasient-avledede tumorer og spesielt deres cellulære underpopulasjoner i stor grad mangler. Her beskriver vi et eksperimentelt oppsett som tillater kvantitativ analyse av proteom av cancercellepopulasjoner avledet fra enten flytende eller faste tumorer. Dette oppnås ved å kombinere cellulære berikelse strategier med kvantitativ Super-SILAC basert massespektrometri fulgt av bioinformatiske dataanalyse. Å berike spesifikke cellulære undergrupper, er flytende svulster først immunophenotyped av flowcytometri fulgt av FACS-sortering; for solide tumorer, er laser-fangst mikrodisseksjon brukes til å rense bestemte cellulære subpopulasjoner. I et andre trinn blir proteinene ekstrahert fra de rensede celler, og deretter kombinert med et tumorspesifikt,SILAC-merket spike-in standard som gjør det mulig protein kvantifisering. Den resulterende proteinblanding underkastes enten gelelektroforese eller Filter Aided Prøvepreparering (FASP) etterfulgt av tryptisk fordøyelse. Endelig er tryptiske peptider analysert ved hjelp av en hybrid quadrupole-orbitrap massespektrometer, og data innhentet behandles med bioinformatiske programvare suiter inkludert MaxQuant. Ved hjelp av arbeidsflyt presenteres her, opp til 8.000 proteiner kan bli identifisert og kvantifisert i pasient avledet prøver, og de resulterende protein expression profiler kan sammenlignes blant pasienter for å identifisere diagnostiske proteomikk signaturer eller potensielle narkotika mål.
Massespektrometri-baserte proteomikk har dukket opp, og er nå en mye brukt disiplin i cellebiologi og translasjonell biomedisinsk forskning. Tekniske fremskritt på området har gjort det mulig å studere komplekse cellulære prosessene i cellelinjer og dyremodeller, som tusenvis av proteiner kan bli identifisert i en enkel massespektrometrisk eksperiment 1,2. Lignende fremgang har blitt gjort for analyse av mange posttranslational modifikasjoner som fosforylering eller ubikineringsinhibitor, selv om dette krever vanligvis skreddersydde arbeidsflyter for berikelse og dataanalyse for hver type modifikasjon 2,3. Videre involvering av kjemiske og metabolske merking strategier, inkludert SILAC, muliggjør nøyaktig relativ kvantifisering av proteiner og PTMs, noe som gjør denne metoden spesielt attraktivt for oppdagelsen av grunnleggende cellulære prosesser, diagnostiske biomarkører og potensielle narkotika mål i menneskelig kreft 4.
Imidlertidflere utfordringer må overvinnes med hensyn til proteomikk analyse av primære humane kreftformer 5. Først av alt, humane kreftprøvene viser ofte en høy grad av cellulær heterogenitet som skyldes nærvær av forskjellige celletyper som tilhører tumor mikromiljøet, inkludert immunceller og fibroblaster. For det andre fører klonal evolusjon til genetisk mangfold innenfor svulstene seg selv, noe som resulterer i at det finnes flere cellulære subpopulasjoner med distinkte funksjonelle egenskaper. Ifølge den nåværende konseptet av noen få kreftstamceller være drivkreftene bak kreftutvikling og progresjon, proteomikk analyse av slike (funksjonelt svært relevante) cellulære subpopulasjoner forventes å være av stor betydning for en bedre forståelse av onkogene mekanismer relevant for klinisk anvendelse 6. For det tredje er kvantitative protein expression profiler av store sett av prøver ofte nødvendig for identifikasjon av robust klinisk BioMarKERS; Dette kan ikke oppnås ved kjemisk merking som iTRAQ 7, mens metabolske merkings strategier – stole, som de gjør, på cellulær proliferasjon 4 – er likeledes uanvendelig. For det fjerde er de fleste tilgjengelige faste tumorprøver er formalinfiksert, noe som kompliserer massespektrometrisk analyse proteom- på grunn av dannelsen av protein-tverrbindinger 8. Til slutt, de fleste eksisterende proteomikk arbeidsflyt krever betydelige mengder av utvalgets behandling og datainnsamling, rende analyse av prøvenummer relevante for klinisk forskning vanskelig, og ringer for ny arbeidsflyt paradigmer 9,10.
For å møte disse hindringene vi utviklet et eksperimentelt oppsett som kombinerer enten flow-cytometrisk celle sortering 11 eller laser-fangst mikrodisseksjon 12,13 for cellulær berikelse med en Super-SILAC 14 strategi for å innføre en global intern standard for omfattende massespektrometrisk analyse. Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet her, er det mulig å kvantifisere opp til 8000 proteiner i enkle humane tumorprøver avledet fra enten flytende eller faste kreftformer.
Massespektrometrisk profilering av pasient-avledet kreft-celle proteom er nødvendig for oppdagelsen av nye diagnostiske / prediktive biomarkører samt å gi en bedre forståelse av kreft-cellebiologi, som kan i sin tur føre til identifisering av nye potensielle narkotika mål. Imidlertid er slike massespektrometriske analyser er svært krevende, særlig fordi forskjellige pre-analytiske problemer som må løses, hvis man skal få robuste og biologisk relevante resultater.
Den eksperimentelle arbeidsflyt beskrevet her gjør for kvantitativ proteomikk karakterisering av proteom avledet fra cellulære subpopulasjoner av både flytende og faste svulster. Den innledende anrikning av tumorceller enten ved FACS-baserte celle sortingor mikrodisseksjon er nødvendig for å unngå forurensning av celler i tumormikromiljøet. Videre disse teknikkene tillater en å isolere cellulære subpopulasjoner av interesse. Nye cellebiologiske studier har demonstrated at visse cellulære subpopulasjoner har tumor initiere egenskaper og er derfor svært relevant for kreft patogenesen 19,20. Som massespektrometri er blitt mer følsom i de senere år, kvantitative proteomic analyser er mulig for de små mengder protein som kan utledes fra noen få tusen celler, noe som gjør det mulig å fokusere på funksjonelt relevante cellepopulasjoner.
Opplegget presenteres her kan brukes til å identifisere og validere nye diagnostiske biomarkører i FFPE- prøver. Derfor, det lover å bea nyttig verktøy for forbedring av klinisk diagnostikk, som til dags dato er det fortsatt mangel på molekylære biomarkører i tilstrekkelig antall og kvalitet for mange krefttyper. Viktige eksempler på vanskelige differensialdiagnoser, som biomarkører mangler, er det diskriminering mellom primær lungekreft fra metastaser i lungene, intrapancreatic cholangiocellular karsinom og bukspyttkjertelen adenokarsinom, samt forskjelligentiation av benign neurofibroma fra svært maligne perifere nerve-kappe svulster. Dessuten har vi og andre vist at kvantitativ belysning av proteomikk signaturer kan være nyttig i å studere kreftcellebiologi generelt, og for å avsløre prediktive biomarkører av terapeutisk respons hos kreftpasienter 21.
To aktuelle ulempene med metoden som presenteres her er kravet for omfattende manuell utvalgets behandling og etterspørselen på nanoLC-MS / MS fangsten. Mens det tidligere, kan løses ved å bevege prøvepreparering til f.eks, 96-brønners format og ved hjelp av robot behandling, vil den sistnevnte krever en endring i massespektrometrisk anskaffelsesstrategi. Når undergrupper av target-proteiner har blitt identifisert som kan være forbundet med for eksempel tumor klassifisering, ser vi for oss at utformingen av målrettede massespektrometri metoder som gir kvantitative avlesninger for disse undergrupper med en sterkt redusert innsats separasjon, ogderfor med en tilsvarende redusert fangsten. Hvis den nødvendige oppkjøpet tiden som kreves kan reduseres 24-36 hr (flytende svulster) eller tre timer (solide svulster) til f.eks, 1 time ved hjelp av målrettet massespektrometri og en enkel endimensjonal separasjon av peptider, så den resulterende gevinst i gjennomstrømningen kan brukes til å øke betydelig antall av biologiske og tekniske replikater ble undersøkt, med tilsvarende forbedringer i betydningen av kvantifisering resultater. Målrettede massespektrometri tilnærminger har allerede vist seg å være et egnet verktøy for verifikasjon av kreft-assosiert protein biomarkør-kandidater 22, og har blitt utviklet til et punkt der de viser lovende for validering eller selv som en potensiell verktøy for rutinemessig klinisk bruk 23 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |