In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
El análisis en profundidad de los proteomas celulares de cáncer son necesarias para dilucidar mecanismos patológicos oncogénicos, así como para identificar los posibles objetivos farmacológicos y biomarcadores de diagnóstico. Sin embargo, los métodos para la caracterización proteómica cuantitativa de los tumores derivados del paciente y, en particular, sus subpoblaciones celulares se carece en gran medida. Aquí se describe un montaje experimental que permite el análisis cuantitativo de proteomas de subpoblaciones de células de cáncer derivadas de tumores, ya sea líquida o sólida. Esto se logra mediante la combinación de estrategias de enriquecimiento celulares con espectrometría de masas basado-Super-SILAC cuantitativa seguido de análisis de datos bioinformáticas. Para enriquecer subgrupos celulares específicas, tumores líquidos están primero immunophenotyped por citometría de flujo seguido por FACS de clasificación; para tumores sólidos, láser de microdisección de captura se utiliza para purificar subpoblaciones celulares específicas. En un segundo paso, las proteínas se extraen de las células purificadas y posteriormente combinarse con un tumor-específica,SILAC marcado estándar espiga-en que permite la cuantificación de proteínas. La mezcla de proteína resultante se somete a electroforesis en gel o filtro Aided Preparación de la muestra (FASP) seguido por la digestión con tripsina. Finalmente, los péptidos trípticos se analizaron utilizando un espectrómetro de masas cuadrupolo-orbitrap híbrido, y los datos obtenidos se procesaron con paquetes de software de bioinformática, incluyendo MaxQuant. Por medio del flujo de trabajo que aquí se presenta, hasta 8.000 proteínas pueden ser identificados y cuantificados en las muestras de los pacientes derivados, y los perfiles de expresión de proteínas resultantes pueden ser comparados entre los pacientes para identificar firmas proteómicos de diagnóstico o los posibles objetivos farmacológicos.
Proteómica basada en la espectrometría de masas ha surgido y ahora es una disciplina ampliamente utilizado en la biología celular y la investigación biomédica traslacional. Los avances técnicos en la materia han hecho posible estudiar procesos celulares complejos en líneas celulares y modelos animales, como miles de proteínas pueden ser identificados en un solo experimento de espectrometría de masas 1,2. Se han realizado progresos similares para el análisis de muchas modificaciones postraduccionales tales como fosforilación o ubiquitinación, aunque esto usualmente requiere flujos de trabajo a medida para enriquecimiento y análisis de datos para cada tipo de 2,3 modificación. Por otra parte, la implicación de las estrategias de etiquetado químicas y metabólicas, incluyendo SILAC, permite la cuantificación relativa precisa de proteínas y PTM, haciendo de este método particularmente atractivo para el descubrimiento de procesos celulares básicos, biomarcadores diagnósticos y dianas de fármacos potenciales en el cáncer humano 4.
Sin embargo,varios desafíos tienen que ser superadas con respecto al análisis proteómico de los cánceres humanos primarios 5. En primer lugar, las muestras de cáncer humanos a menudo muestran un alto grado de heterogeneidad celular que es debido a la presencia de diversos tipos de células que pertenecen a la microambiente del tumor, incluyendo células inmunes y fibroblastos. En segundo lugar, la evolución clonal conduce a la diversidad genética dentro de los tumores a sí mismos, resultando en la existencia de varias subpoblaciones celulares con propiedades funcionales distintas. Se espera De acuerdo con el concepto actual de unas pocas células madre del cáncer son las fuerzas impulsoras detrás del desarrollo y progresión del cáncer, el análisis proteómico de dichas subpoblaciones celulares (funcionalmente muy relevantes) a ser de gran importancia para una mejor comprensión de los mecanismos oncogénicos relevante para la aplicación clínica 6. En tercer lugar, los perfiles de expresión de proteínas cuantitativos de grandes conjuntos de muestras se requieren a menudo para la identificación de BioMar clínica robustakers; esto no se puede lograr por medio del etiquetado químico tal como iTRAQ 7, mientras que las estrategias metabólicas etiquetado – basándose, como lo hacen, sobre la proliferación celular 4 – son igualmente inaplicable. En cuarto lugar, la mayoría de las muestras de tumores sólidos disponibles son fijados con formalina, lo que complica el análisis del proteoma de espectrometría de masas debido a la formación de reticulaciones de proteínas 8. Por último, la mayoría de los flujos de trabajo existentes proteómica requieren cantidades significativas de procesamiento de la muestra y adquisición de datos, haciendo que el análisis de los números de las muestras pertinentes para la investigación clínica difícil, y llamando a nuevo flujo de trabajo paradigmas 9,10.
Para hacer frente a estos obstáculos, hemos desarrollado un sistema experimental que combina ya sea celular por citometría de flujo de la clasificación 11 o láser captura microdissection 12,13 para el enriquecimiento celular con una estrategia de Super-SILAC 14 para introducir una norma interna global para el análisis integral de espectrometría de masas. Al utilizar el método descrito aquí, es posible cuantificar hasta 8000 proteínas en muestras de tumores humanos individuales derivados de cualquiera de los cánceres de líquidos o sólidos.
Se necesita Misa perfiles de espectrometría de proteomas de células de cáncer derivados de pacientes para el descubrimiento de nuevos biomarcadores de diagnóstico / predictivos, así como para dar una mejor comprensión de la biología de las células del cáncer, lo que podría a su vez conducir a la identificación de nuevas dianas farmacológicas potenciales. Sin embargo, este tipo de análisis de espectrometría de masas son muy difíciles, sobre todo porque varios temas pre-analíticos tienen que ser resueltos, si uno va a obtener resultados robustos y biológicamente relevantes.
El flujo de trabajo experimental descrito aquí permite la caracterización proteómica cuantitativa de proteomas derivados de subpoblaciones celulares de tumores tanto líquidos como sólidos. Se necesita el enriquecimiento inicial de las células tumorales ya sea por FACS basada en células sortingor microdisección para evitar la contaminación por las células del microambiente del tumor. Además, estas técnicas permiten una para aislar subpoblaciones celulares de interés. Estudios de células biológicas recientes han demoniotrado que ciertas subpoblaciones celulares tienen propiedades iniciadoras del tumor y por tanto son de gran relevancia para la patogénesis del cáncer 19,20. Como espectrometría de masas se ha vuelto más sensible en los últimos años, los análisis proteómicos cuantitativos son factibles para las pequeñas cantidades de proteína que se pueden derivar de unos pocos miles de células, por lo que es posible para centrarse en poblaciones de células funcionalmente relevantes.
La puesta a punto que aquí se presenta se puede utilizar para identificar y validar nuevos biomarcadores de diagnóstico en muestras FFPE. Por lo tanto, se compromete a bea herramienta útil para la mejora de los diagnósticos clínicos, como hasta la fecha todavía hay una falta de biomarcadores moleculares en número y calidad adecuadas para muchos tipos de cáncer. Ejemplos importantes de diagnósticos diferenciales difíciles, para las que se carece de biomarcadores, son la discriminación entre el cáncer de pulmón primario de las metástasis en el pulmón, carcinoma colangiocelular intrapancreática y adenocarcinoma de páncreas, así como difierenciación de neurofibroma tumores benignos de los nervios periféricos de la vaina altamente malignos. Además, nosotros y otros han demostrado que la elucidación cuantitativa de firmas proteómicos puede ser útil en el estudio de la biología de células de cáncer en general, y por revelar biomarcadores predictivos de respuesta terapéutica en pacientes con cáncer 21.
Dos inconvenientes actuales del método presentado aquí son el requisito para el proceso extenso manual de las muestras y la demanda de nanoLC-MS / MS tiempo de adquisición. Mientras que el primero se pueden abordar moviendo la preparación de muestras para por ejemplo, formatos de 96 pocillos y utilizando el procesamiento de robot, éste requerirá un cambio en la estrategia de adquisición de espectrometría de masas. Una vez subconjuntos de proteínas objetivo se han identificado que puede estar asociada con, por ejemplo, la clasificación de tumores, prevemos el diseño de métodos de espectrometría de masas específicas que proporcionan lecturas cuantitativas para estos subconjuntos con un esfuerzo de separación muy reducida, ypor lo tanto, con un tiempo de adquisición correspondientemente reducida. Si el tiempo de adquisición requerido requerido podría reducirse 24-36 hr (tumores líquidos) o 3 hr (tumores sólidos) a, por ejemplo, 1 hr mediante espectrometría de masas y una simple separación unidimensional de péptidos, a continuación, la ganancia resultante en el rendimiento dirigido podría utilizarse para aumentar significativamente el número de repeticiones biológicos y técnicos examinados, con las mejoras correspondientes en la importancia de los resultados de cuantificación. Enfoques de espectrometría de masas específicos han demostrado ser una herramienta adecuada para la verificación de la proteína de biomarcadores-candidatos asociados con el cáncer 22, y se han desarrollado a un punto en el que se muestran prometedores para la validación o incluso como una herramienta potencial para el uso clínico rutinario 23 , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |