In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.
Derinlemesine kanser hücresi proteomların analizleri onkojenik patomekanizmaların aydınlatmak için, yanı sıra potansiyel ilaç hedefleri ve teşhis Biyobelirteçleri tanımlamak için gereklidir. Ancak, hasta kaynaklı tümörlerin ve özellikle hücresel alt popülasyonlar kantitatif proteomik karakterizasyonu için yöntemler büyük ölçüde eksiktir. Burada, sıvı ya da katı tümörler ya da elde edilen kanser hücresi alt-popülasyonlarının proteomların analiz edilmesine olanak sağlamıştır deneysel kurulum tarif eder. Bu biyoinformatik veri analizi ve ardından kantitatif Süper SILAC bazlı kütle spektrometresi ile hücresel zenginleştirme stratejileri birleştirerek elde edilir. FACS-sıralayarak ardından sitometri spesifik hücresel alt kümelerini zenginleştirmek için, sıvı tümörler ilk akış tarafından immunophenotyped edilir; katı tümörler için, lazer yakalama mikrodiseksiyon spesifik hücresel alt-popülasyonunu saflaştırmak için kullanılır. İkinci bir aşamada, bir protein, arıtılmış hücrelerinden ekstre edilir ve daha sonra bir tümör-spesifik birlikte,Protein miktarının sağlayan başak-standardı SILAC-etiketli. Elde edilen protein karışımının, jel elektroforezi ya da triptik sindirme ile ve ardından filtre Destekli Numune Hazırlama (FASP) 'ye tabi tutulmuştur. Son olarak, triptik peptidler bir melez quadrupole-Orbitrap kütle spektrometresi ile analiz edilir ve elde edilen veriler MaxQuant dahil biyoinformatik yazılım suit ile işlenir. 8000 proteine kadar burada sunulan akışı aracılığı ile tespit edilebilir ve bir hastada elde edilen numunelerde ölçülmüştür ve elde edilen protein ekspresyon profilleri teşhis proteomik imza ya da potansiyel ilaç hedeflerini tanımlamak için hastalar arasında karşılaştırılabilir.
Kütle spektrometresi tabanlı proteomik ortaya çıkmıştır ve hücre biyolojisi ve translasyonel biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılan bir disiplin şimdi. Binlerce proteinin tek bir kütle spektrometrik deney 1,2 tespit edilebilir bu alandaki teknik ilerlemeler, hücre hatları ve hayvan modellerinde kompleks hücresel süreçlerin çalışma mümkün kılmıştır. Bu, genellikle bir değişiklik 2,3 her türü için zenginleştirme ve veri analizi için sipariş akışlarını gerektirir, ancak benzer bir ilerleme, fosforilasyon ya da ubikitinasyon gibi birçok dönüşüm sonrası modifikasyonların analizi için yapılmıştır. Ayrıca, SILAC dahil olmak üzere kimyasal ve metabolik etiketleme stratejileri, katılımı, insan kanserinde 4 temel hücresel süreçler, tanı biyolojik belirteçler ve potansiyel ilaç hedefleri keşfi için bu yöntem özellikle çekici hale proteinlerin ve PTMS doğru nispi ölçümü sağlar.
Bununla birlikte,birçok karşı primer insan kanserlerinin 5 proteomik analizi ile ilgili aşılması gerekmektedir. Her şeyden önce, insan kanser örnekleri, genellikle bağışıklık sistemi hücreleri, fibroblastlar, tümör mikro-e ait çeşitli hücre tiplerinin varlığı nedeniyle hücresel heterojenlik yüksek derecesini göstermektedir. İkincisi, klonal evrim farklı fonksiyonel özelliklere sahip çeşitli hücresel alt popülasyonlar varlığına sonuçlanan, kendi tümörler içinde genetik çeşitliliğe yol açar. Kanser gelişimi ve ilerlemesi gibi (işlevsel son derece alakalı), hücresel alt popülasyonlar proteomik analizi ardındaki itici güçleri olan birkaç kanser kök hücrelerinin mevcut kavramına göre klinik uygulama için ilgili onkojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması için büyük önem olması bekleniyor 6. Üçüncü olarak, yüksek numune miktarlarının setleri kantitatif protein ekspresyon profilleri, genellikle, güçlü bir klinik BIOMAR tanımlanması için gerekli olankers; dayanarak bu gibi hücre çoğalması 4, -, – aynı şekilde uygulanamaz metabolik etiketleme stratejileri ise, bu, örneğin iTRAQ 7 gibi kimyasal etiketleme başarılamaz. Dördüncü olarak, en uygun bir katı tümör örnekleri formalinle sabitlenmiş, bağlı bir protein çapraz bağlarının 8 oluşumu için kütle spektrometrik analizi proteom zorlaştırmaktadır bulunmaktadır. Son olarak, en mevcut proteomik iş akışları zor klinik araştırmalar için ilgili örnek sayı analizi render örnek işleme ve veri toplama önemli miktarda gerektirir, ve yeni iş akışı çağrısında 9,10 paradigmalar.
Bu engelleri gidermek için biz kapsamlı kitle spektrometresi analizi için küresel bir iç standart tanıtmak için bir süper-SILAC 14 strateji ile hücresel zenginleştirme için 11 veya lazer yakalama mikrodiseksiyon 12,13 sıralama ya akım-sitometrik hücre birleştiren bir deney düzeneği geliştirdi. Burada tarif edilen yöntem kullanılarak, sıvı ya da katı kanserler ya da elde edilen tek bir insan tümör örneklerinde 8000 proteine kadar ölçmek mümkündür.
Hasta kaynaklı kanser hücre proteomların Kitle spektrometrik profil yeni tanı / öngörü biyomarkerların keşfi için gerekli yanı sıra kanser hücre biyolojisi daha iyi bir anlayış vermek için hangi olabilir yeni potansiyel ilaç hedeflerinin belirlenmesine yol açacaktır. Çeşitli ön-analitik konular bir sağlam ve biyolojik ilgili sonuçlar elde etmek ise, çözülmesi gereken Ancak, bu tür kitlesel spektrometrik analizler, özellikle zorlu vardır.
Burada tarif edilen deney akışı, sıvı ve katı tümörlerin, hem hücresel alt popülasyonlannda elde proteomların kantitatif proteomik karakterizasyonu için izin verir. ya da FACS-bazlı hücre sortingor mikro-kesim ile tümör hücrelerinin ilk zenginleştirme tümör mikro-hücreleri ile kirlenmesini önlemek için gereklidir. Ayrıca, bu teknikler bir ilgi hücresel subpopülasyonunun izole sağlar. Son hücre biyolojik çalışmalar iblis varBazı hücresel subpopülasyonunun tümör başlatan özelliklere sahip ve dolayısıyla kanser patogenezinde 19,20 için son derece alakalı olduğunu strated. Kütle spektrometresi son yıllarda daha duyarlı hale geldikçe, kantitatif proteomik analizler, birkaç bin hücrelerden elde edilebilir protein küçük miktarlarda mümkün olan mümkün işlevsel ilgili hücre popülasyonlarının odaklanmak için yapım.
Burada sunulan set-up FFPE örneklerinde yeni tanı Biyobelirteçleri tanımlamak ve doğrulamak için kullanılabilir. Dolayısıyla, hala birçok kanser türleri için yeterli sayıda ve kalitede moleküler biyolojik belirteçler eksikliği olduğu tarihe kadar, klinik teşhis iyileştirilmesi için yararlı bir araç bea vaat ediyor. Biyomarkırlar eksik olan zor ayırıcı tanı, önemli örnekleri, akciğer metastazları, intrapankreatik kolanjiosellüler karsinom ve pankreas adenokarsinomaya primer akciğer kanseri arasındaki ayrımcılık vardır, yanı sıra farklıoldukça malign periferik sinir kılıfı tümörleri-benign nörofibromlar ayırt edilmesi. Ayrıca, ve diğerleri proteomik imza sayısal aydınlatılması, genel olarak kanser hücresi biyolojisi okuyan ve kanser hastalarında 21 terapötik tepkinin işaretidir biyolojik işaretleri ortaya çıkarılması için yararlı olabileceğini göstermiştir.
Burada yer alan yöntem iki akım dezavantajları zengin manuel Örnek işleme gerekliliği ve nanoLC-MS / MS, alma zamanına ilişkin bir talep vardır. Eski örneğin, 96-kuyu formatları örnek hazırlama hareketli ve robotik işleme kullanılarak ele alınabilir iken, ikincisi kitle spektrometrik satın alma stratejisinde bir değişiklik gerektirecektir. Hedef proteinlerin alt-gruplar, örneğin, tümör sınıflandırması ile ilişkili olabilir ki belirlendikten sonra, bir önemli ölçüde azaltılmış ayrılma çaba ile, bu alt-gruplar için nicel okumalarını sağlayabilir hedef kütle spektrometresi yöntemleri tasarım öngörmektedir, veDolayısıyla buna bağlı olarak azalır, alma zamanına sahip. 24'ten azaltılabilir gereken gerekli alma süresi ise – 36 saat (sıvı tümörler) veya 3 saat (katı tümörler) gibi üzere, 1 saat daha sonra kütle spektrometrisi ve peptidlerin bir basit tek-boyutlu bir ayırma, iç verimle sonuçlanır kazanç hedef kullanılarak ölçüm sonuçlarının önemli iyileştirmeler karşılık gelen, incelenmiş ve biyolojik teknik replika anlamlı sayısını arttırmak için kullanılabilir. Hedeflenen kitle spektrometrik yaklaşımları zaten kanser-ilişkili protein biyolojik belirteç-adayların 22 doğrulanması için uygun bir araç olduğu gösterilmiştir ve onlar doğrulama için ya da rutin klinik kullanımda 23 için potansiyel bir araç olarak umut vaat bir noktaya geliştirilmiştir , 24.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia Münch for technical support.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
660 nm Kit | Thermo scientific | 22662 | |
Cell culture medium depleted of arginine and lysine | Thermo Scientific | 88421 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution | Bio Rad | 161-0436 | |
Dialyzed fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-107 | |
Diffuser caps for microdissection | MMI | 50202 | |
FACS-sorter | BD | FACSAria III | |
Ionic Detergent Compatibility Reagent | Thermo scientific | 22663 | |
Laser-capture microdissector | MMI | cell cut plus | |
LDS buffer | Life Technologies | NP0009 | |
Membrane slides for microdissection | MMI | 50103 | |
Microcon YM-30 | Millipore | MRCF0R030 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels | Life Technologies | NP0335PK2 | |
Picofrit Self-Pack Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | Mass Spectrometry Column/Emitter |
Reducing agent | Life Technologies | NP0007 | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 3 µm | |
Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase | Dr. Maisch | 120 C18-AQ, 5 µm | |
SILAC-labeled arginine | Eurisotop | CLM-2265-H-0.1 | |
SILAC-labeled lysine | Eurisotop | DLM-2640-0.25 | |
Trypsin, NB Sequencing Grade | Serva | 3728301 | for in-gel digests |
Trypsin, Sequencing Grade | Promega | V5111 | for in-solution digests |
Buffer and solutions | |||
Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF, 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4 | |||
Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT | |||
Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 | for FASP-protocoll | ||
0.05 M NH4HCO3 | |||
10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate | for in-gel digest | ||
5% aqueous formic acid. |