Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.
I de fleste virveldyr, produserer leveren galle som er nødvendig for å emulgere absorbert fett, og muliggjøre spalting av lipider i tynntarmen, så vel som til å skille ut bilirubin og andre metabolske produkter. I leveren, initierer den eksperimentelle obstruksjon av ekstrahepatiske gallesystemet en kompleks kaskade av patologiske hendelser som fører til kolestase og betennelse som resulterer i en sterk fibrotisk reaksjon som stammer fra periportal felt. Derfor har kirurgisk ligation av felles gallegang blitt den mest brukte modellen for å indusere obstruktiv kolestatisk skade hos gnagere, og å studere de molekylære og cellulære hendelser som ligger til grunn for disse patofysiologiske mekanismer indusert av upassende galle flyte. I de senere årene har ulike kirurgiske teknikker blitt beskrevet som enten tillate gjeninnkobling eller reanastomosis etter gallegang ligation (BDL), for eksempel, delvis BDL, eller andre mikrokirurgiske metoder for spesifikke forskningsspørsmål. Imidlertid er den mest brukte modellen komplett obstruksjon av felles gallegang som induserer en sterk fibrotisk respons etter 21 til 28 dager. Dødeligheten kan være høy på grunn av smittsomme komplikasjoner eller tekniske unøyaktigheter. Her gir vi en detaljert kirurgisk prosedyre for BDL modell i mus som induserer en svært reproduserbare fibrotisk respons i henhold til 3R regelen for dyrevelferd postulert av Russel og Burch i 1959.
Leverfibrose er definert som den overdreven produksjon og akkumulering av ekstracellulær matriks (ECM) som stammer fra et komplekst nettverk av interaksjoner av matriks-produserende hepatiske stel celler og et bredt utvalg av lever-resident og en infiltrerende celle blodlegemer 1,2. Selv hepatisk fibrose kan være forårsaket av en rekke forskjellige stimuli de molekylære mekanismer som ligger under fibrose er generelt svært like. Etter hepatisk skade, er en høyt organisert program av molekylære og cellulære endringer initiert. I dette programmet oppstår et tett samspill mellom inflammatoriske signaler, monocytter / makrofager og leverstel celler som på sluttresultatet i stelcelleaktivering og transdifferensiering til myofibroblasts, ECM deponering og påfølgende anatomiske og funksjonelle endringer i levervev integritet tre. Aktivering av leverstel celler er spesielt drevet av betennelsessignaler og interaksjoner med levereni private makrofager (dvs. Kupffer celler). Patogen assosiert molekylære mønstre er anerkjent av spesialiserte mønstergjenkjenning reseptorer slik som Toll-lignende reseptorer som når aktivert signal gjennom et komplekst nettverk av ulike baner som utløser uttrykk og sekresjon av et mangfold av inflammatoriske cytokiner og chemokiner som driver den inflammatoriske prosessen tre. Den inflammatoriske respons og den dannede lever fornærmelse er bare midlertidig når sykdommen-dannende faktor er fjernet. I motsetning til dette, dersom skaden vedvarer, utvikler kronisk betennelse i leveren, og ekspresjon og akkumulering av ECM publikum i forgrunnen som resulterer i progressiv substitusjon av normal lever parenchyma av arrvev dannelse.
Siden lever fibrogenese hos mennesker er et verdensomspennende klinisk problem, har flere eksperimentelle gnager modeller av akutt og kronisk leversvikt er etablert i løpet av de siste tiårene. I murine system for eksempel vanlige modeller er administrering av en rekke forskjellige hepatotoxins, ligering av den felles gallegang, induksjon av immun-mediert leverskade, og målrettet innføring av gen-defekter eller omvendt overekspresjon av transgener som påvirker kritisk signalveier som er involvert i patogenesen av leverfibrose 4.
Ligering av den felles gallegang hos gnagere er utført som en eksperimentell prosedyre i forskning i mange år 5-8. Et første svært reproduserbare protokoll for langvarig gallegang ligation (BDL) hos gnagere var allerede presenteres nå mer enn tre tiår siden 9. I denne protokollen både kanylering / obstruksjon og ligering indusert en høy avkastning av skrumplever i rotter med morfologiske endringer som kunne sammenlignes med det som ble observert i menneskelig gallecirrhose 9. De respektive protokoll er enkel, den kirurgiske prosedyren er relativt hurtig anvendeligOg overlevelse av dyrene er høy med over 95%. I den klassiske rotte kanylering / obstruksjon protokollen, er en kort snitt på 2 cm laget like under xifoid prosessen. Deretter blir en kanyle innføres i den proksimale delen av gallegang og fiksert i sin stilling med silkesuturer. I et neste trinn blir den distale delen av kanylen hindret med 3 knop, satt gjennom den nedre ende av midtlinjesnitt, og begravet subkutant i nedre, høyre kvadrant 9. Til slutt blir buken lukket og dyrene får lov til å komme seg. I ligation protokollen, rottene utsatt for dobbel ligering av den felles gallegang enten med eller uten disseksjon av gallegang mellom ligaturer 9.
Dette eksperimentelle modellen er godt akseptert og brukes over hele verden i hundrevis av laboratorier for å indusere lever kolestase og fibrose. Det induserer intrahepatisk galle epitelcelleproliferasjon, myofibroblastic differentiation portal fibroblaster rundt prolifererende galle epitelceller, noe som resulterer i en meget reproduserbar, massiv ekspresjon og avsetning av ECM 10,11. Derfor er anvendelsen av denne modellen i rotter og mus være populær blant forskere som tar sikte på å forstå patogenesen av leverbetennelse og fibrose.
I vårt laboratorium har vi mye brukt denne protokollen i fortiden i rotter i flere eksperimentelle studier tar sikte på å undersøke spesielle molekylære og cellulære aspekter av lever fibrogenese og for å teste nye antifibrotic konsepter og narkotika 12-15.
Nylig har vi tilpasset denne metodikken til muse-systemet og fant at gallegang ligation kirurgi er også et attraktivt middel for å etablere tidsavhengig fibrose med lav variasjon og dødelighet hos mus 16-18. På grunn av den mindre størrelse av dyrene imidlertid noen viktige modifikasjoner med hensyn til anestesi, kirurgi intervention og etterbehandling observasjon er nødvendig for å oppnå pålitelige og reproduserbare resultatet i denne modellen. Den fullstendig tilpasning er oppsummert i den følgende protokoll, og i den tilhørende videodokumentasjon.
Kolestatisk leverskade er en av de viktigste årsaksfaktorer for utvikling av leverfibrose og skrumplever hos pasienter med kronisk leversykdom. Basert på det faktum at disse sykdommene produsere umåtelige helsekostnader, er det forståelig at mange forskere prøver å forstå de sykdomsfremkallende mekanismene for pågående leverfibrose. Derfor har eksperimentelle modeller blitt generert som etterligner ulike sider ved de komplekse mekanismene som fører til leverbetennelse, fibrose og cirrhose en.
Kirurgisk BDL er en av de mest utbredte eksperimentelle modeller som brukes til å indusere obstruktiv cholestatisk skade i mus og rotter 4,23,24. I de fleste av de protokoller, blir dyrene bedøvd, og et midtparti laparotomi utføres. Deretter blir gallegang avdekket fra bukhulen og ligert to ganger ved hjelp av kirurgisk hyssing. Som en konsekvens av mus og rotter som har fått denne operasjonen develop en sterk fibrotisk reaksjon som ved første stammer fra periportal felt 25. I løpet av årene har flere forskjellige kirurgiske teknikker og modifikasjoner er blitt beskrevet. Spesielle prosedyrer med tillate gjeninnkobling eller reanastomosis etter BDL 23. Andre teknikker er basert på partiell BDL resulterer i betydelig mindre nekrose dannelse og følgelig hepatocytt proliferasjon 24. Delvis BDL i kombinasjon med etterfølgende fjerning av galleblæren (cholecystektomi) som hindrer dannelse av kolecystitt representerer også en utmerket eksperimentell modell for akutt cholestase. Det ble foreslått å være en modell som er nærmere den menneskelige situasjonen 24. Og ja, under etableringen av denne modellen, det var allerede vist at det reproduserbart fører kolestase med bare minimal histologisk vevsskade og går ikke videre til kronisk kolestase 25. Derfor ble det foreslått at denne modellen er ideell for å studere late effekter av reversert kolestase 24. Enda mer sofistikerte metoder er basert på mikrokirurgi og tillate en rask og reproduserbar måte å påføre kolestatisk leverskade kun i utvalgte deler av leveren 26.
Selv om disse avanserte modifikasjoner fra den opprinnelige BDL protokollen har vist seg svært nyttig i å undersøke konkrete problemstillinger, mange laboratorier over hele verden i utgangspunktet sikte på å ansette BDL-modellen som en svært reproduserbar og pålitelig modell for kolestatisk leverfibrose. Imidlertid kan mange komplikasjoner oppstå som kan vesentlig endre reproduserbarheten og påliteligheten av resultatene som oppnås ved denne modellen, hvis tekniske unøyaktigheter ikke unngås. For eksempel, blødningskomplikasjoner i forbindelse med skade på blodkar medfølgende gallegangen (se figurene 3-4) kan oppstå ved eller raskt etter operasjonen. Dosering av anestesi med påfølgende cardiodepression eller respiratory svikt er også unødvendige komplikasjoner av prosedyren. Alvorlige infeksjoner, som strekker seg fra peritonitis til sepsis, kan opptre under hele perioden av eksperimentet, hvis suturer ikke er nøyaktig utført og galle lekker inn i bukhulen. Utilsiktede skader i tarmen under operasjonen kan også føre til bukhinnebetennelse. Derfor er det åpenbart at standardiserte protokoller som er i samsvar med strenge retningslinjer for håndtering er sterkt nødvendig. Denne bestemmelsen ble også nylig krevde innenfor landene i Den europeiske union, som implementert nye dyrevelferdsregler i 2013 en. De respektive krav som er knyttet til denne forskriften er ikke ny, og ble allerede foreslått i 1959, da Russell og Burch foreslo en etisk rammeverk for gjennomføring av vitenskapelige eksperimenter med dyr som er i hovedsak basert på en erstatning, raffinement og reduksjon (3R) prinsipp 27.
Ved å følge outlined protokollen er det bare noen få komplikasjoner som kan oppstå fra tekniske unøyaktigheter. Tre spesifikke problemstillinger kan oppstå i ganske lav frekvens.
Som med alle kirurgiske prosedyrer, overdose bedøvelse er en potensiell kilde til fare for dyrene, spesielt i kombinasjon med nedkjøling. Hvis under operasjonen kardiovaskulære komplikasjoner oppstår, bør tilførsel av bedøvelse stoppes umiddelbart, og operatøren skal prøve å gi mye som mulig oksygen til musen. Dette kan gjøres ved hjelp av en liten plastsprøyte som er fylt med luft og pumpes inn i munningen av svekket dyret. Alternativt, er bruken av en liten Peleusball for ventilasjon av det angrepne dyr ofte nyttig for revitalisering prosessen.
Problemer i sårtilheling
Etter BDL kirurgi, kan mus bite sine egne såre sømmer eller de av andre dyr. Hvis dette skjer, bør respektive mus være separatbur. Dyr med åpne sår skal bedøves, regionen rundt såret forsiktig sterilisert med en standard antiseptisk middel, og såret skal sys igjen. I løpet av de neste tre dagene, bør såret av disse dyrene bli jevnlig inspisert (to til tre ganger om dagen).
Distensions av magen eller dannelse av ascites er veiledende for bakterielle infeksjoner. Disse kan oppstå på grunn av ikke-sterile arbeids under operasjonen. Alle slags infeksjoner bør håndteres uten unntak som en human endepunkt og de berørte dyrene skal bli ofret.
Vi følger en enkel å følge protokoll som gjør at ytelsen til BDL i mus som er enkel å implementere og fremkaller dødelighet bare lav dyr kombinert med en høy reproduserbarhet. Alle de kirurgiske protokoller kan raskt pågrepet av dyktige forskere. Under komp eksperimentering, ble dyrene holdt på en varmeplate ved 37 ° C og fast forbundettil en anestesi systemet minimerer smerte og ubehag. For kirurgi, er magen åpnet med en midtlinjen laparotomi og gallegang dobbelt ligert uten å dissekere det. De representative resultater som ble diskutert her vise at de fenotypiske endringer i forhold til lever morfologi (betennelse, fibrose, skrumplever) er svært reproduserbare og la til å studere ulike aspekter av fibrogenese (f.eks., Initiering, betennelse, progresjon, end-stage sykdom) ved definerte tidspunkter.
Vi håper at sammendraget av vår protokoll vil bidra til å redusere læringskurve som er nødvendig for å kunne etablere denne fibrose modellen i andre laboratorier og for å garantere pålitelige og reproduserbare resultater på ulike steder. Dermed tror vi at den presentprotokollen støtter 3R-prinsippet som skulle av Russell og Burch i 1959 og representerer grunnlaget for nye dyrevelferdsreglene som i dag er implementert i mange land witynn det europeiske rammeverket.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke finansiell støtte fra den tyske Research Foundation (SFB / TRR57, Q3 og Q2). Forfatterne takker Mareike Schulz, Pascal Paschenda, og Klaudia Warzecha for deres hjelp i utarbeidelsen av fotografier.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
Scotch Tape | commercially available | ||
Tissue paper | commercially available | ||
Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |