Abstract
في معظم الفقاريات، فإن الكبد ينتج الصفراء ما هو ضروري لاستحلب الدهون الممتصة وتمكين هضم الدهون في الأمعاء الدقيقة وكذلك على إفراز البيليروبين والمنتجات الأيضية الأخرى. في الكبد، وانسداد التجريبي للنظام الصفراوي خارج الكبد يبدأ سلسلة معقدة من الأحداث المرضية التي تؤدي إلى ركود صفراوي والتهاب مما أدى إلى رد فعل قوي متليفة منشؤها من حقول حول الأوعية البابية. ولذلك، أصبح الربط الجراحي من القناة الصفراوية المشتركة نموذج الأكثر شيوعا للحث على إصابة الركودي معرقلة في القوارض ودراسة الأحداث الجزيئية والخلوية التي تكمن وراء هذه الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تحدثها غير مناسب تدفق الصفراء. في السنوات الأخيرة، وقد وصفت التقنيات الجراحية المختلفة التي إما السماح إعادة الاتصال أو إعادة المفاغرة بعد ربط القناة الصفراوية (BDL)، على سبيل المثال، جزئي BDL، أو أساليب المجهرية الأخرى للأسئلة بحثية محددة. ومع ذلك، فإن النموذج الأكثر استخداما هو إعاقة كاملة من القناة الصفراوية المشتركة أن يؤدي الى استجابة التليف قوية بعد 21 إلى 28 يوما. معدل وفيات يمكن أن تكون عالية بسبب مضاعفات معدية أو أخطاء فنية. هنا نقدم إجراء العمليات الجراحية مفصل لنموذج BDL في الفئران التي تحفز استجابة تليفي استنساخه للغاية وفقا لحكم 3R لرعاية الحيوان المفترضة التي كتبها رسل وبورتش في عام 1959.
Introduction
يتم تعريف تليف الكبد مثل الإنتاج المفرط وتراكم المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تنبع من شبكة معقدة من التفاعلات بين الخلايا النجمية الكبدية المنتجة للمصفوفة ومجموعة متنوعة واسعة من خلايا الدم في الكبد المقيمين والخلايا التسلل 1،2. وعلى الرغم من التليف الكبدي يمكن أن تسببها العديد من المحفزات المختلفة الآليات الجزيئية الكامنة التليف عادة ما تكون مشابهة جدا. وبعد الضرر الكبدي، يتم بدء برنامج مدبرة للغاية من التغيرات الجزيئية والخلوية. في هذا البرنامج التفاعل الوثيق بين الإشارات التهابات، وحيدات / الضامة والخلايا النجمية الكبدية يحدث ذلك في النتائج النهائية في تنشيط الخلايا النجمية وtransdifferentiation إلى myofibroblasts، ترسب ECM والتعديلات التشريحية والوظيفية متتالية من الكبد الأنسجة سلامة 3. هو الدافع وراء تنشيط الخلايا النجمية الكبدية خاصة من جانب إشارات التهابات والتفاعل مع الكبدالضامة السكنية (أي خلايا كوبفر). يتم التعرف على العوامل المسببة للأمراض أنماط الجزيئية يرتبط بها مستقبلات التعرف على نمط المتخصصة مثل مستقبلات تول مثل التي عند تفعيلها إشارة من خلال شبكة معقدة من الممرات المختلفة التي تؤدي الى التعبير وإفراز العديد من السيتوكينات و chemokines التهابات التي تدفع العملية الالتهابية 3. الاستجابة الالتهابية وإهانة الكبد شكلت مؤقتة فقط عند إزالة عامل المنتجة للمرض. في المقابل، إذا استمرت الإصابة، يتطور التهاب مزمن في الكبد والتعبير وتراكم الحشود ECM في المقدمة مما أدى إلى إحلال التدريجي لحمة الكبد طبيعية عن طريق تشكيل ندبا.
منذ تكون الألياف الكبد لدى البشر هي مشكلة سريرية في جميع أنحاء العالم، تم إنشاء العديد من النماذج القوارض التجريبية من الفشل الكبدي الحاد والمزمن خلال العقود الماضية. في مونظام rine على سبيل المثال، والنماذج شيوعا هي إدارة مجموعة متنوعة من hepatotoxins مختلفة، وربط من القناة الصفراوية المشتركة، تحريض اصابة الكبد بوساطة جهاز المناعة، وإدخال المستهدفة من عيوب جينية أو العكس وoverexpression من الجينات المحورة التي تؤثر حرجة مسارات إشارات تشارك في التسبب في التليف في الكبد 4.
وقد تم تنفيذ ربط من القناة الصفراوية المشتركة في القوارض خارج باعتباره الإجراء التجريبي في البحث لسنوات عديدة 5-8. وقد قدم أول بروتوكول استنساخه للغاية لقناة الصفراء طويلة ربط (BDL) في القوارض بالفعل الآن أكثر من ثلاثة عقود مضت 9. في هذا البروتوكول كل من القسطرة / إعاقة وربط يسببها ارتفاع العائد من تليف الكبد في الفئران مع التغيرات المورفولوجية التي كانت مماثلة لتلك التي لوحظت في التشمع الصفراوي البشري 9. بروتوكول منها هو بسيط، وإجراء العمليات الجراحية ينطبق بسرعة نسبيا، ومعدلات البقاء على قيد الحياة من الحيوانات عالية مع أكثر من 95٪. في الكلاسيكية بروتوكول الفئران القسطرة / إعاقة، يتم إجراء شق قصيرة من 2 سم فقط تحت عملية الخنجري. بعد ذلك، يتم إدخال قنية في الجزء القريب من القناة الصفراوية وثابتة في موقفها مع خيوط الحرير. في الخطوة التالية، وقطعت الطريق على الجزء الأعلى من قنية مع 3 عقدة، وطرح من خلال الطرف الأدنى من شق خط الوسط ودفن تحت الجلد في الربع السفلي الأيمن 9. في النهاية، يتم إغلاق البطن ويسمح الحيوانات في التعافي. في بروتوكول ربط، تتعرض الفئران لربط مزدوج من القناة الصفراوية المشتركة سواء مع أو بدون تشريح القناة الصفراوية بين الحروف المركبة 9.
ومن المقبول أيضا هذا النموذج التجريبي وتستخدم في جميع أنحاء العالم في مئات من المختبرات للحث على ركود صفراوي الكبد والتليف. أنه يدفع الصفراوية داخل الكبد تكاثر الخلايا الظهارية، التمايز myofibroblasticن من الخلايا الليفية بوابة حول تكاثر الخلايا الظهارية الصفراوية، مما أدى إلى والتعبير الهائل تكرار للغاية وترسب ECM 10،11. ولذلك، فإن تطبيق هذا النموذج في الجرذان والفئران ويجري شعبية بين العلماء التي تهدف إلى فهم التسبب في التهاب الكبد والتليف.
في المختبر لدينا، وقد استخدمنا هذا البروتوكول على نطاق واسع في الماضي في الفئران في العديد من الدراسات التجريبية التي تهدف إلى تحقيق الجوانب الجزيئية والخلوية الخاصة لتكون الألياف الكبدي واختبار المفاهيم والمخدرات 12-15 antifibrotic الرواية.
مؤخرا، ونحن تتكيف هذه المنهجية لنظام الفئران وجدت أن جراحة ربط القناة الصفراوية هي أيضا يعني جاذبية للإقامة التليف تعتمد على الوقت مع انخفاض التباين وفيات في الفئران 16-18. نظرا لحجم أصغر من الحيوانات، ومع ذلك، بعض التعديلات الهامة فيما يتعلق التخدير، interv الجراحيةention والمراقبة بعد المعالجة ضرورية للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في هذا النموذج. ولخص التكيف الكامل في البروتوكول التالي في وثائق والفيديو المرفقة.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام الدولة الرسمية (LANUV، ركلينغاوسين، ألمانيا). ويعيش الفئران في ظل ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد للمختبر الحيوان جمعيات العلوم (FELASA). وأجريت جميع التجارب وفقا للقانون الاتحادي الألماني فيما يتعلق بحماية الحيوانات و"دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (المعاهد الوطنية للصحة المنشور 8 الطبعة، 2011).
1. قبل الجراحة إعداد
ملاحظة: القيام بجميع الإجراءات في ظل ظروف نظيفة ولكن غير معقمة. جميع الأجهزة والمعدات التي يمكن إعادة استخدامها أخرى مثل ملقط الجراحة، مقص، وكوليبري ضام التي تستخدم لإجراء عمليات جراحية ويجب تعقيمها قبل استخدامها وفقا لبروتوكولات التي هي في الامتثال الصارم للمبادئ التوجيهية المؤسسية لإجراء جراحات في الحيوانات.؛ للحصول على قائمة مفصلة من الكواشف اللازمة والمواد والمعدات، يرجى الرجوع إلى قائمة من المواد المحددة / المعدات.
- خلال التجريب كامل، والحفاظ على الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس عند درجة حرارة 37 ° C، متصلا بشكل دائم إلى نظام التخدير، وغطاء منطقة العمليات بشكل عام مع وستائر ذاتية اللصق-السائل غير منفذة. صحيح ترتيب جميع أدوات القياس والحلول التي يتم استخدامها أثناء التجريب قبل الجراحة (الشكل 1).
- تخدير الفأر مع استنشاق 4 المجلد٪ الأيزوفلورين في 100٪ الأكسجين بمعدل تدفق من 4 لتر / دقيقة لتحريض التخدير. عمق التخدير كافية عند الوصول إلى المعايير الحيوية التالية: التنفس المنتظم عفوية، لا ارادي بعد وضع المحفزات الألم بين أصابع القدم، وليس استجابة للألم.
- حلق الفراء البطن من الفأرة مع ماكينة حلاقة كهربائية الفراء وحماية العينين من الجفاف عن طريق استخدام العين ونبيئة نظام التشغيل مرهم.
- ضع الماوس على 37 درجة مئوية ساخنة لوحة الساخنة، وإدراج خطم الماوس في قناع Fluovac من نظام التخدير Fluovac، وإصلاح أرجل الحيوان مع خطوط من الشريط الحرير.
- الحفاظ على التخدير من الفأرة عن طريق الاستنشاق من 1.5-3٪ الأيزوفلورين المجلد في 100٪ الأكسجين بمعدل تدفق من 1 لتر / دقيقة وجند تسكين المحيطة بالجراحة عن طريق الحقن داخل الصفاق من الحل البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ BW حل في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل) .
- تعقيم الجلد في البطن حلق مع مسحة الشاش أن هو مبلل مع معيار مطهر، وعلى استعداد لاستخدام محلول كحولي لتلقي العلاج قبل العملية من الجلد. ملاحظة: في بروتوكولات لدينا نحن نستخدم بولي الكحول antisepticum الجلد. هذا هو بما يتفق تماما مع القانون الاتحادي الألماني فيما يتعلق بحماية الحيوانات والمبادئ التوجيهية للاتحاد للمختبر الحيوان جمعيات العلوم. يحتوي هذا مطهر 70٪ (ت / ت) 2-بروبانول، butan-1،3.diol وآثار الكينولين الصفراء، وبايوته.
2. العمليات الجراحية
- فتح البطن مع البطن خط الوسط بطول حوالي 2 سم عن طريق قطع ترهل بالإضافة إلى رباط في نفس الوقت مع مقص جراحي 11.5 سم.
- تشريح النسيج الضام على رأس الصفاق باستخدام مقص بمثابة رش.
- قطع الصفاق على طول الخط ألبا لفتح التجويف البريتوني.
- توسيع تجويف عن طريق إدخال خياطة عقد في القص، ورفع خيوط من الخيط، وتحديد ذلك على رأس قناع Fluovac.
- تنتشر في منطقة العملية عن طريق إدراج ضام كوليبري في التجويف البريتوني (الشكل 2).
- رفع الكبد مع رطب (0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل) مسحة القطن بحيث الجانب البطني منه العصي على الحجاب الحاجز ونقير واضحة للعيان.
- فضح القناة الصفراوية عن طريق حركة الذيلية للامعاء (الشكل 3).
- فصل بعناية القناة الصفراوية منالمرافقة الوريد البابي والشريان الكبدي باستخدام ملقط التسنين الصغيرة (الشكل 4A).
- وضع خياطة 5-0 حول القناة الصفراوية وضمان الحصول عليها مع اثنين من عقدة الجراحية. عندما ربط عقدة تزيد من قوة الجر باستمرار لضمان عرقلة فعالة دون قطع القناة الصفراوية (الشكل 4B).
- إضافة ربط الجمجمة الثاني بنفس الطريقة ولكن لا تشريح القناة الصفراوية في ما بين (الشكل 4C). وإلا فسيكون هناك خطر كبير من أن التسريبات الصفراء إذا عقدة واحدة غير آمن، والحيوانات لا تعاني من الركود الصفراوي لكن تطور التهاب الصفاق الحاد.
- قطع نهايات الخيوط الجراحية (الشكل 4D)، وانخفاض القص، وإزالة ضام.
- شطف التجويف البريتوني مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم حل واستبدال أعضاء البطن لمواقف الفسيولوجية.
- وثيقة سواء البطن طبقات (البريتوني وترهل بالإضافة بها أمام) مع الغرز تشغيل منفصلة مع 6-0 Mersilk.
- قطع هNDS من الغرز وتعقيم المنطقة بالتعاون مع مسحة شاش مبلل بمحلول مطهر.
ملاحظة: عند إجراء عملية جراحية للمرة الأولى، أداء جميع الإجراءات تحت المجهر الجراحي في التكبير من 16X 20X-. وهذا يسمح اعتراف أفضل من القناة الصفراوية وبوضوح يميزها عن الوريد البابي والشريان الكبدي (الأرقام 5 و 6). بعض المختبرات يوصي تشريح القناة الصفراوية في بين الحروف المركبة اثنين. ترك القناة الصفراوية سليمة بسبب التسريبات المحتملة في واحدة من عقدة سوف يؤدي إلى التهاب الصفاق الحاد الوخيم، استسقاء، وendotoxemia النظامية عندما يتم تشريح القناة الصفراوية.
3. علاج ما بعد الجراحة والمتابعة
- السماح الماوس لاسترداد في قفص استعد بواسطة مصباح الأشعة تحت الحمراء حتى الماوس مستيقظا تماما ونشطة.
- بعد ذلك، حرك الماوس إلى قفص العادي وتوفير libitum الإعلانية الحصول على الماء والغذاء.
- After الجراحة، ومراقبة الحيوانات على فترات منتظمة وتنفيذ متابعة العلاج بعد العملية الجراحية مع تسكين مناسب (على سبيل المثال، حل البوبرينورفين) بناء على توصية المحلية للرعاية الحيوان الداخلية واستخدام اللجان.
ملاحظة: إجراء العلاج مسكن لمدة 3 أيام. قد يشير أي سلوك غير طبيعي المضاعفات النادرة مثل التهاب الصفاق، وتعفن الدم أو نزيف داخلي وينبغي التعامل مع مثل نقطة النهاية الإنسان لإنهاء التجربة. - يتم الاحتفاظ الحيوانات مع حرية الوصول إلى الغذاء والمياه الإعلانية libitum حتى نهاية التجربة. ليست هناك حاجة للرسم الدم منذ يشار تكون الألياف مستمرة من قبل اليرقان.
- عندما يتم التضحية الحيوانات، ويتم جمع الدم لقياس المعلمات السريرية الكيمياء (AST، ALT، البيليروبين الخ) ويتم استرداد الكبد لتحليل النسيجية والكيميائية الحيوية.
Representative Results
في التجريب نموذجي تم تنفيذ BDL في 40 من الذكور C57BL / 6 البرية من نوع الفئران الترجيح حوالي 18-20 غرام. وقد تم ذلك التجربة للتحقيق تكون الألياف الكبد في مرحلة البدء (3 و 7 أيام)، خلال التقدم (10، 14، و 20 يوما)، وخلال المدى الطويل (30 و 60 يوما) 16. في هذا النموذج، والتليف persinusoidal وضعت بالفعل في يوم 10 بعد الجراحة، في حين أن التليف حول الأوعية البابية التي زادت بشكل دائم حتى نهاية التجربة تم تطويره بالكامل بعد 20 يوما. في التجربة المذكورة، كل الحيوانات التي تلقت بسيطة الشام عملية قيد الحياة، واثنين من 40 الفئران (5٪) التي حصلت على مصرف لبنان فقط وضعت الحالة العامة سيئة، وبالتالي تم التضحية قبل الأوان قبل نقطة النهاية المخطط لها من التجربة. كان النشاط الحيوانات الشام التي تديرها دون استثناء بالفعل الطبيعي بعد يوم واحد البطن، في حين أن معظم الحيوانات تعرض للBDL أظهرت انخفاض النشاط خلال الأيام الثلاثة الأولى. Jوكان الجلد aundiced كانت واضحة بالفعل في جميع الحيوانات BDL واحد أو يومين بعد وضع من BDL 16.
قيم كل من الألانين ألانين (ALT) وناقلة اسبارتاتي (AST) التي تمثل علامات المصل راسخة من الإصابة الكبدية زيادة سريعة وبلغت ذروتها خلال يوم 7 ويوم 20 بعد BDL (الجدول 1). بعد ذلك، ALT AST وانخفض بشكل مطرد حتى يوم 30 و ظلت مستقرة حتى بعد 60 أيام من الجراحة. وتمشيا مع إصابة الركودي، وكانت تركيزات مصل من إجمالي البيليروبين مرتفعة بشكل مطرد وصلت إلى القاع بعد 7 أيام 16. تم الإبلاغ عن دوام مماثل من الأنشطة ALT و AST المصل أيضا بالنسبة للفئران التي خضعت مصرف لبنان. في دراسة حديثة انه مما يدل على أن AST و ALT المصل مستويات زيادة تصل إلى 5 أو 10 أضعاف من المعتاد في الأسبوع الأول بعد الجراحة BDL وانخفضت بعد أسبوعين 19.
عادة، وأكباد الحيوانات الشام التي تديرها لا تزال تبدو سموتح في نهاية التجربة، في حين أن كبد الحيوانات التي تلقت BDL تظهر التعديلات المعمارية التي تتميز أساسا عن طريق تشكيل ذمة وتليفي عقيدات على سطح الكبد وموه من المرارة التي هي شغلها مع كميات كبيرة من المقابلة الصفراء (الشكل 7). التعديلات الشكلية المميزة الكبد التي يتم الناجمة عن جراحة BDL هي أيضا قابلة للإثبات في التحليل النسيجي القياسي (الشكل 8).
في نفس مجموعة من التجارب، وكان تطوير تليف الكبد شبه كميا تقييمها على أساس علم الأنسجة الكبد تقييمها من قبل الطبيب الشرعي أعمى باستخدام نظام التسجيل الذي اقيم التليف حول الأوعية البابية 0-4 وتليف الحول جيبية 0-2، وإعطاء أقصى ، وكانت القيمة التي كان يعادل تليف 6. وكما كان متوقعا متوسط درجة التليف في مجموعة من الحيوانات الشام التي تديرها 0.00 ± 0.00. في المقابل، في مجموعة من الحيوانات رقبعة تلقت BDL، زادت درجة باطراد حتى يوم 60 إلى قيمة 4.83 ± 0.17. تم التوصل إلى الحد الأقصى من 3 لالتليف حول الأوعية البابية في يوم 20. في جميع الحيوانات تحليلها، كان التليف الحول جيبية غائبا خلال 10 أيام الأولى من التجربة وكان أولا ملحوظ بعد أسبوعين. بعد ذلك، فقد ارتفع باطراد حتى نهاية التجربة لقيم 1.8 ± 0.17 (الجدول 1).
أيضا في العديد من التجارب على الحيوانات المستقلة الأخرى التي تم تنفيذها، لوحظ أن تشكيل التليف كان استنساخه للغاية تعتمد على الوقت تبين زيادة من داخل الكبد التعبير الكولاجين وترسب نتيجة لتكون الألياف المستمر (الشكل 9). وبالمثل، فإن عملية تكون الألياف المستمر هو ملحوظ في التعبير مرتفعة من-α السلس الأكتين العضلات (α-SMA) الذي يمثل علامة من خلايا ليفية، أي تنشيط الكبد الخلايا النجمية وmyofibroblasts بوابة، وهيدروكسي الكبدي، وهو من الأحماض الأمينية التي توجد بوفرة في الكولاجين مصفوفات 18 (الشكل 9). وبالإضافة إلى ذلك، يتم زيادة التعبير عن فيمنتين التي تشير إلى كميات متزايدة من myofibroblasts الليفية أو بعد وضع الجراحة BDL 20. وترد تلازم من التهاب في الكبد المصابين من جراء زيادة التعبير عن Lipocalin 2 (LCN2) التي يسببها بقوة خلال اصابة الكبد الحادة والمزمنة وتتطور الآثار حماية الكبد أثناء إصابة الكبد الحادة 21،22.
ويمكن الكشف عن الخلايا الالتهابية أن اختراق كبد الحيوانات التي تلقت BDL بواسطة تلطيخ محددة مع الأجسام المضادة التي هي محددة لCD45 (الشكل 10). يتم التعبير عن هذه العلامة سطح الخلوية التي تعرف أيضا باسم PTPRC (بروتين التيروزين الفوسفاتيز، نوع مستقبلات) على وجه التحديد في جميع الخلايا المكونة للدم متباينة فيما عدا كريات الدم الحمراء وخلايا البلازما.
| الوقت بعد ربط القناة الصفراوية (أيام) | مجموع البيليروبين | AST (U / L) | ALT (U / L) | البوابة التليف | التليف الحول جيبية | مجموع النقاط |
| (ملغم / دل) | ||||||
| 0 (ن = 3) | 0.17 ± 0.06 | 192.67 ± 30.50 | 50.33 ± 6.03 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 3 (ن = 5) | 6.85 ± 2.21 | 1159.25 ± 319.27 | 566.50 ± 335.25 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 |
| 7 (ن = 5) | <td> 14.38 ± 2.14 ±976.60 ± 477.16 | 448.20 ± 259.47 | 0.60 ± 0.25 | 0.0 ± 0.0 | 0.60 ± 0.25 | |
| 10 (ن = 5) | 15.92 ± 2.60 | 1916.60 ± 868.25 | 560.40 ± 80.88 | 1.40 ± 0.25 | 0.25 ± 0.25 | 1.67 ± 0.25 |
| 14 (ن = 5) | 17.90 ± 3.84 | 1088.60 ± 276.32 | 505.00 ± 96.15 ± | 2.4 ± 0.25 | 1.0 ± 0.0 | 3.40 ± 0.24 |
| 20 (ن = 4) | 18.00 ± 2.12 | 1072.67 ± 364.27 | 404.00 ± 195.48 | 3.0 ± 0.0 | 1.0 ± 0.0 | 4.0 ± 0.0 |
| 30 (ن = 5) | 16.04 ± 4.79 | 446.40 ± 169.75 | 260.20 ± 126.97 | 2.8 ±. 0.2 | 1.4 ± 0.25 | 4.20 ± 0.20 |
| 60 (ن = 6) | 16.02 ± 1.19 | 484.67 ± 117.79 | 257.17 ± 50.97 | 3.0 ± 0.0 | 1.8 ± 0.17 | 4.83 ± 0.17 |
المختصرات المستخدمة هي: ALT، الألانين ألانين. AST، الألانين اسبارتاتي.
الجدول 1: الكيسي التهديف في تجربة تمثيلية ويرد بيانات هذا الجدول من دراسة التي تم بفعل التليف الكبد عن طريق القناة الصفراوية ربط في C57BL / 6 الفئران 16. في هذه الدراسة، كان معدل وفيات بعد الجراحة BDL 5٪ (2 من 40 الحيوانات تمت التضحية قبل الأوان بسبب الظروف الحيوان الفقيرة المتقدمة).
الشكل 1: الإعداد التجريبي لأداء الصفراءقناة الربط. يتم الاحتفاظ الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ويتم تغطية منطقة العمليات بشكل عام مع وستائر ذاتية اللصق-السائل غير منفذة. خلال عملية جراحية كاملة، ويرتبط هذا الحيوان بشكل دائم إلى نظام التخدير. يتم ترتيب جميع أدوات القياس والحلول (المسكنات، أدوية التخدير، محلول مطهر، 0.9٪ كلوريد الصوديوم) بشكل واضح.
الشكل 2: إعداد منطقة الجراحة افتتاح مسبقة من التجويف البريتوني، ينبغي حلق جلد البطن مع ماكينة حلاقة كهربائية الفراء وتطهيرها مع الشاش مسحة مطهر. ثم يتم تغطية منطقة الجراحة مع وستائر ذاتية اللصق-السائل غير منفذة. يتم فتح البطن مع البطن خط الوسط (~ 2 سم في الطول). يتم تكبير تجويف عن طريق إدخال خياطة عقد في القص ومنطقة العملية ينتشر عن طريقإدخال ضام كوليبري السماح التجريب دون عوائق أثناء الجراحة.
الشكل (3): تعرض القناة الصفراوية. (A) لإجراء عملية ربط القناة الصفراوية، ورفع الجانب البطني من الكبد بحيث يمكن التمسك الحجاب الحاجز ويصبح نقير الكبد واضحة للعيان. (B) لفضح أفضل القناة الصفراوية، تم نقل القناة الهضمية نحو caudally مع مسحة القطن مرطب. يتم وضع علامة على القناة الصفراوية مع سهم.
الشكل 4: Ligating القناة الصفراوية. (A) في خطوة هي الأولى، ويتم فصل القناة الصفراوية بعناية من الوريد البابي المرافقة والشريان الكبدي باستخدام ملقط الصغرى التسنين. (ب) وبعد ذلك، يتم وضع الخيط حولالقناة الصفراوية والمضمون مع عقدة الجراحية. (C) وبعد ذلك، يتم وضع خياطة الثانية على مقربة من خياطة الأولى ومعقود حول القناة الصفراوية. (D) هو اختصار خياطة، تجويف تشطف مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل ، وجميع الهيئات محل لموقفهم الفسيولوجية.
الشكل 5: تمثيل دقيقة من الغزل لتوثيق موضع الغرز ووضع اثنين من عقدة التي تحول دون تدفق الصفراء، وقد تم توثيق نفس الإجراء المبين في الشكل (4) تحت مجهر (A) الحبس من القناة الصفراوية مع خياطة الأولى. (B) الغزل للخياطة الأولى. (C) الحبس من القناة الصفراوية مع خياطة الثاني. (D) الغزل للخياطة الثانية. (E) انقر نقرا مزدوجا و ligated الصفراء دUCT بعد تقصير من الخيوط الزائدة. (E ') هذه اللوحة تصور تخطيطي ل(E). وبحروف مواقف اليمين (RL)، غادر (ليرة لبنانية) والمتوسط (مل) فصوص الكبد وكذلك القناة الصفراوية، والمعدة، والاثني عشر. في رسم هو ligated القناة الصفراوية مزدوج من قبل اثنين من الغرز.
الشكل 6: تشريح القناة الصفراوية، الوريد البابي والشريان الكبدي في الفئران لأفضل موقع تشريحي من القناة الصفراوية المشتركة، وصفت الوريد البابي والشريان الكبدي كمشروع. تميزت أيضا مواقف اليمين (RL)، غادر (ليرة لبنانية) متوسط (مل) والمذنبة (CL) فصوص الكبد.
الرقم 7: appeara الممثلالامتحانات التنافسية الوطنية من كبد بعد 2 أسابيع عملية صورية ومصرف لبنان. تعرض C57BL / 6 الفئران لعملية صورية أو الجراحة مصرف لبنان. بعد أسبوعين من فتح تجويف الحشوي. في حين أظهرت أكباد الحيوانات الشام التي تديرها أي علامة على التليف، كانت أكباد الحيوانات تلقي ربط من القناة الصفراوية بنية سطح غير منتظم مع تشكيل ذمة والعقيدات تليفي على سطح الكبد المقابلة.
تم إعداد الهيماتوكسيلين ويوزين وصمة عار أقسام الكبد من C57BL / 6 الحيوانات البرية التي كانت نوع الشام التي تديرها (A) أو تلقت BDL لمدة ثلاثة أسابيع (B): الرقم 8. كانت ملطخة المقاطع مع الإجراءات القياسية الهيماتوكسيلين ويوزين التالية. يرجى ملاحظة التعديلات نموذجية داخل الكبد BDL التي تشمل علامات التهاب (خلايا التسلل)، متني (الكبدcyte) نخر، وانتشار القنوات الصفراوية. شريط النطاق في كل لوحة الرقم يمثل 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9: قراءات النسيجية والكيميائية الحيوية لتكون الألياف الكبدي. تم إعداد (A) أقسام الكبد من الحيوانات التي تلقت عملية صورية أو BDL لمدة 2 اسابيع وملطخة سيريوس الأحمر (لوحة العلوي، وألياف الكولاجين باللون الأحمر) أو تحليلها من أجل التعبير عن α على نحو سلس الأكتين العضلات (α-SMA) (اللوحة السفلى ، α-SMA خلايا إيجابية في البني) من خلال المناعية. شريط النطاق في كل لوحة الرقم يمثل 100 ميكرون. (B) وتعرض مقتطفات البروتين من كبد لطخة غربية وتحليلها لexpression من نوع الكولاجين I، α-SMA، وفيمنتين التي يتم راسخة علامات تكون الألياف الكبدي. التعبير عن Lipocalin-2 (LCN2) يشير إلى استجابة التهابية مقترن تكون الألياف مستمر. في هذا التحليل، وقد تجلى المساواة البروتين التحميل من قبل الذين يحققون في البقع مع الأجسام المضادة المحددة لβ-الأكتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 10: تلطيخ المناعي بالتسلل الخلايا الالتهابية أعدت أقسام الكبد المسلسل من كبد الحيوان الذي تلقت القناة الصفراوية ربط لمدة 3 أسابيع. كانت ملطخة المقاطع مع الهيماتوكسيلين ويوزين (A) أو مع الأجسام المضادة التي هي محددة لCD45 (B). يرجى الملاحظة،ارتفاع عدد خلايا إيجابية CD45 المحيطة القنوات الصفراوية. هذه تتسرب الهائلة التي تشير إلى التهاب غير مرئية في أقسام الكبد المشتقة من الحيوانات الشام التي تديرها (لا يظهر). شريط النطاق في كل لوحة الرقم يمثل 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
اصابة الكبد الركودي هي واحدة من العوامل المسببة الرئيسية لتطوير تليف الكبد وتليف الكبد في المرضى الذين يعانون من مرض الكبد المزمن. استنادا إلى حقيقة أن هذه الأمراض تنتج تكاليف الرعاية الصحية لا يمكن التكهن بعواقبها، فمن مفهومة أن العديد من الباحثين يحاولون فهم الآليات المسببة للأمراض التليف الكبدي مستمر. ولذلك، تم إنشاء نماذج تجريبية تحاكي جوانب مختلفة من الآليات المعقدة التي تؤدي إلى التهاب الكبد، والتليف والتشمع 1.
الجراحية BDL هي واحدة من النماذج التجريبية الأكثر انتشارا التي تستخدم للحث على إصابة الركودي معرقلة في الفئران والجرذان 4،23،24. في معظم البروتوكولات، يتم تخدير الحيوانات ويتم تنفيذ عملية فتح البطن القسم الوسطي. وفي وقت لاحق، وكشفت القناة الصفراوية من تجويف البطن وو ligated مرتين باستخدام خيوط جراحية. ونتيجة لذلك، فإن الفئران والجرذان التي تلقت هذه الجراحة دevelop رد فعل متليفة قوية على أن تنشأ في البداية من حقول حول الأوعية البابية 25. خلال السنوات وقد وصفت العديد من التقنيات والتعديلات الجراحية المختلفة. حتى تسمح الإجراءات الخاصة لإعادة الاتصال أو إعادة المفاغرة بعد BDL 23. وتعتمد تقنيات أخرى على BDL جزئي مما أدى إلى تشكيل نخر أقل بكثير، وبالتالي انتشار الكبدية 24. BDL جزئي في تركيبة مع إزالة لاحقة من المرارة (استئصال المرارة) الذي يمنع تشكيل التهاب المرارة أيضا يمثل نموذج تجريبي ممتاز للركود صفراوي الحاد. واقترح أن تكون نموذجا أقرب إلى الوضع البشري 24. وبالفعل، أثناء إنشاء هذا النموذج، وقد تجلى ذلك بالفعل أنه يتسبب بتكاثر ركود صفراوي مع الحد الأدنى من إصابة الأنسجة النسيجية فقط ولا تشرع في ركود صفراوي المزمن 25. ولذلك، اقترح أن هذا النموذج هو المثالي لدراسة خطوط الطول(ه) من آثار ركود صفراوي عكس 24. وتستند حتى أساليب أكثر تطورا على المجهرية وتسمح طريقة سريعة وقابلة للتكرار لإيقاع إصابات الكبد الركودي فقط في أجزاء مختارة من الكبد 26.
على الرغم من أن هذه التعديلات متطورة من بروتوكول BDL الأصلي وقد ثبت مفيدة جدا في التحقيق الأسئلة بحثية محددة، العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم تهدف أساسا في توظيف نموذج BDL نموذجا استنساخه للغاية ويمكن الاعتماد عليها لتليف الكبد الصفراوي. ومع ذلك، يمكن أن تحدث العديد من المضاعفات التي يمكن أن يغير بشكل كبير من استنساخ وموثوقية النتائج التي حصل عليها هذا النموذج، إذا لم يتم تجنب أخطاء فنية. على سبيل المثال، والنزيف مضاعفات تتعلق إصابة الأوعية الدموية المصاحبة القناة الصفراوية (أنظر الشكلين 3-4) قد تحدث أثناء أو بسرعة بعد الجراحة. جرعة زائدة من التخدير مع cardiodepression أو ص لاحقافشل espiratory أيضا مضاعفات يمكن تجنبها من الإجراء. التهابات شديدة، بدءا من التهاب الصفاق إلى تعفن الدم، قد تحدث طوال فترة التجربة، إن لم يكن يتم تنفيذ الغرز بدقة وتسرب العصارة الصفراوية في التجويف البريتوني. الإصابات العرضية إلى الأمعاء أثناء الجراحة يمكن أن يؤدي أيضا إلى التهاب الصفاق. ولذلك، فمن الواضح أن بروتوكولات موحدة والتي هي في الامتثال لمبادئ توجيهية صارمة معالجة مطلوبة بشدة. كما كان يطالب هذا النص مؤخرا داخل دول الاتحاد الأوروبي، والتي تنفذ قواعد الرفق بالحيوان جديدة في عام 2013 1، ومتطلبات كل منها التي ترتبط مع هذه اللائحة ليست جديدة واقترحت بالفعل في عام 1959، عندما اقترح راسل وبورتش أخلاقية إطار لإجراء التجارب العلمية مع الحيوانات التي تقوم أساسا على بديل، والصقل والحد من (3R) المبدأ 27.
عند اتباع outlinبروتوكول إد لا يوجد سوى عدد قليل من المضاعفات التي قد تنشأ عن أخطاء فنية. قد تحدث ثلاث قضايا محددة في التردد المنخفض إلى حد ما.
كما هو الحال مع جميع العمليات الجراحية، وجرعة زائدة من مخدر هي مصدر محتمل للخطر على الحيوانات وخاصة في تركيبة مع انخفاض حرارة الجسم. إذا أثناء الجراحة تحدث مضاعفات القلب والأوعية الدموية، يجب أن تتوقف إمدادات التخدير فورا والمشغل يجب أن تحاول لتوفير اكبر قدر ممكن من الأكسجين إلى الماوس. ويمكن القيام بذلك عن طريق حقنة بلاستيكية صغيرة ومملوءة بالهواء وضخها في فم الحيوان ضعاف. بدلا من ذلك، استخدام Peleusball صغيرة للتهوية من الحيوان المصاب هو مفيد في كثير من الأحيان لعملية التنشيط.
مشاكل في التئام الجروح
بعد الجراحة BDL، قد الفئران دغة طبقات من قرحة الخاصة أو مصالح غيرها من الحيوانات. إذا حدث هذا، وينبغي أن تكون الفئران كل منها على حدةفي قفص. يجب تخدير الحيوانات مع الجروح المفتوحة، منطقة حول الجرح تعقيم بلطف مع معيار مطهر، وينبغي مخيط الجرح من جديد. خلال 3 أيام المقبلة، يجب أن يتم فحص الجرح من هذه الحيوانات بشكل منتظم (مرتين إلى ثلاث مرات في اليوم).
الإنتفاخات من البطن أو تشكيل استسقاء تدل على الالتهابات البكتيرية. قد تحدث هذه نتيجة لعمل غير معقمة أثناء الجراحة. وينبغي التعامل مع كل نوع من العدوى دون استثناء باعتبارها نقطة النهاية إنسانية ويجب التضحية الحيوانات المصابة.
قدمنا سيلة سهلة لمتابعة البروتوكول الذي يسمح للأداء BDL في الفئران التي هي بسيطة لتنفيذ وتثير نفوق الحيوانات منخفضة فقط جنبا إلى جنب مع استنساخ عالية. كافة البروتوكولات الجراحية يمكن القبض بسرعة من قبل العلماء المهرة. خلال التجريب كاملة، يتم الاحتفاظ الحيوانات على لوحة ظاهرة الاحتباس عند 37 درجة مئوية ومتصلا بشكل دائمإلى نظام التخدير تقليل الألم والضيق. لإجراء عملية جراحية، يتم فتح البطن مع البطن خط الوسط والقناة الصفراوية و ligated المزدوج دون تشريح ذلك. وتظهر نتائج تمثيلية التي تمت مناقشتها هنا إلى أن التعديلات المظهرية فيما يتعلق مورفولوجيا الكبد (التهاب، والتليف، تليف الكبد) هي استنساخه للغاية وتسمح لدراسة جوانب مختلفة من تكون الألياف (على سبيل المثال، بدء، التهاب، التقدم، نهاية مرحلة المرض) في تعريف نقاط الوقت.
نأمل أن ملخص بروتوكول لدينا سوف تساعد على تقصير منحنى التعلم ما هو ضروري لإنشاء بنجاح هذا النموذج التليف في غيرها من المختبرات وضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في مواقع مختلفة. وبالتالي نعتقد أن البروتوكول المقدمة تؤيد مبدأ 3R التي كان من المفترض من قبل راسيل وبورتش في عام 1959 ويمثل أساس قواعد الرفق بالحيوان الجديدة التي يتم تنفيذها حاليا في العديد من البلدان وايرقيقة الإطار الأوروبي.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم مالي من مؤسسة البحوث الألمانية (SFB / TRR57، وQ3 Q2). الكتاب أشكر ماركيه شولتز، باسكال Paschenda، وكلاوديا Warzecha لمساعدتهم في إعداد الصور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
References
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The Principles of Humane Experimental Technique. , London, Methuen. (1959).
