Abstract
В большинстве позвоночных, печень вырабатывает желчь, которая необходима для эмульгирования всасываться жиры и позволяют переваривание липидов в тонком кишечнике, а также выводить билирубин и другие продукты обмена веществ. В печени, экспериментальный обструкция внепеченочных билиарной системы инициирует сложный каскад патологических событий, что приводит к холестаз и воспаление в результате сильного фиброзной реакцией, происходящих из перипортальных полей. Таким образом, хирургическая перевязка общего желчного протока стала наиболее часто используемая модель, чтобы вызвать обструктивного холестатическое травмы у грызунов и изучать молекулярные и клеточные события, лежащие в основе этих патофизиологических механизмов, вызванные неадекватной желчи. В последние годы, различные хирургические методы были описаны, что либо позволить повторное соединение или reanastomosis после лигирования желчного протока (BDL), например, частичное BDL или другие микрохирургические методы для конкретных исследовательских вопросов, Тем не менее, наиболее часто используется модель полной обструкции общего желчного протока, который вызывает сильное фиброзной ответ после 21 до 28 дней. Смертность может быть высокой из-за инфекционных осложнений или технических неточностей. Здесь мы предлагаем подробную хирургическую процедуру для модели BDL у мышей, которые вызывают весьма воспроизводимый фиброзной ответ в соответствии с правилом 3R защиты животных постулированному Рассел и Берч в 1959 году.
Introduction
Фиброз печени определяется как чрезмерное производство и накопление внеклеточного матрикса (ЕСМ), который происходит из сложной сети взаимодействий матричных по производству звездчатых клеток печени и широкого круга печени-резидентов и проникают клетки клеток крови 1,2. Хотя фиброз печени может быть вызвана множеством различных раздражителей молекулярные механизмы, лежащие в основе фиброза как правило, очень похожи. После поражения печени, очень организованная программа молекулярных и клеточных изменений инициируется. В этой программе тесное взаимодействие между воспалительных сигналов, моноцитов / макрофагов и звездчатых клеток печени происходит, что в конечном итоге приводит к активации звездчатых клеток и трансдифференцировки к миофибробластов, отложение ECM и последовательных анатомических и функциональных изменений в печени целостности тканей 3. Активация звездчатых клеток печени, в частности, обусловлено воспалительными сигналов и взаимодействия с заболеваниями печениЖилой макрофаги (т.е. клеток Купфера). Возбудитель связанные молекулярные модели признаны специализированных распознающих рецепторов, таких как Toll-подобных рецепторов, которые при активации сигнала через сложную сеть различных путей, которые вызывают экспрессию и секрецию множества воспалительных цитокинов и хемокинов, которые приводят в воспалительный процесс 3. Воспалительная реакция и образуется в печени оскорбление только временно, когда фактор болезни производстве удаляется. В отличие от этого, если травма сохраняется, хроническое воспаление развивается в печени и экспрессии и накопления ECM толпы на переднем плане в результате прогрессирующей замещения нормальной паренхимы печени путем образования рубцовой ткани.
С печени фиброгенез у людей во всем мире клиническая проблема, несколько экспериментальных моделей на грызунах острой и хронической печеночной недостаточности были созданы в течение последних десятилетий. В мюСистема Rine например, общие модели введение множества различных гепатотоксины, лигирование общего желчного протока, индукция повреждений печени иммуно-опосредованной и целевые введение генных дефектов или наоборот избыточная экспрессия трансгенов, которые влияют на критическое сигнальных путей, вовлеченных в патогенез фиброза печени 4.
Лигирование общего желчного протока у грызунов была проведена в качестве экспериментальной процедурой, описанной в исследований в течение многих лет 5-8. Первый высокую воспроизводимость протокол для длительной желчных протоков лигирования (BDL) у грызунов уже была представлена в настоящее время более чем три десятилетия назад 9. В этом протоколе как катетеризации / обструкции и сшивка улучшает высокий выход цирроза у крыс с морфологических изменений, которые были сравнимы с наблюдаемыми в билиарный цирроз печени человека 9. Соответствующий протокол является простым, хирургическая процедура относительно быстро применимо, А выживаемость животных высокие и более 95%. В классической протокола крысы катетеризации / препятствий, короткий разрез 2 см производится чуть ниже мечевидного отростка. После этого канюли вставляется в проксимальной части желчного протока и фиксируется в своей позиции с шелковыми швами. На следующем этапе, дистальная часть канюли затруднен 3 узлов, положить через нижний конец срединный разрез и захоронены подкожно в правом нижнем квадранте 9. В конце концов, живот закрыты, и животным позволяют восстановиться. В протоколе лигирования, крыс подвергают двойной перевязки общего желчного протока с или без вскрытия желчного протока между лигатурами 9.
Это экспериментальная модель хорошо принята и используется во всем мире в сотнях лабораторий, чтобы вызвать холестаз и фиброза печени. Это вызывает внутрипеченочный билиарный пролиферации эпителиальных клеток, миофибробластической differentiatioп портальных фибробластов вокруг пролиферирующих желчных эпителиальных клеток, что приводит к высокой воспроизводимостью, массивной экспрессии и осаждения ECM 10,11. Таким образом, применение этой модели у крыс и мышей, чтобы быть популярным среди ученых, которые стремятся понять патогенез печеночной воспаления и фиброза.
В нашей лаборатории, мы широко использовали этот протокол в прошлом у крыс в нескольких экспериментальных исследований, направленных на исследование специальных молекулярных и клеточных аспекты печеночной фиброгенезе и проверить новые антифиброзных понятия и наркотики 12-15.
Недавно мы приспособлены эту методику в мышиной системе и обнаружили, что лигирование желчного протока хирургии также является привлекательным для установления среднего времени в зависимости от фиброза с низкой вариации и смертности у мышей 16-18. Из-за меньшего размера животных, однако, некоторые важные изменения в отношении к анестезии, хирургических ПЕРИОДention и наблюдение после лечения необходимы для получения надежных и воспроизводимых результатов в этой модели. Полная адаптация приведены в следующей протокола и в сопроводительном видео документации.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были одобрены официальной государственной уходу и использованию животных комитета (LANUV, Реклингхаузен, Германия). Мышей содержали в конкретных патогенов условиях без соответствии с руководящими принципами Федерации для лабораторных животных науки ассоциаций (FELASA). Все эксперименты были проведены в соответствии с немецким федеральным законом о защите животных и «Руководство по уходу и использованию лабораторных животных" (Национальные институты здравоохранения публикация 8-го издания, 2011).
1. предоперационной подготовки
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры, предусмотренные чистый, но нестерильных условиях. Все инструменты и другое оборудование многократного использования, такие как хирургические щипцы, ножницы, Colibri втягивающим, которые используются для выполнения операции необходимо стерилизовать перед использованием в соответствии с протоколами, которые находятся в строгом соответствии с ведомственным руководящим принципам для выполнения операций на животных.; Для детального перечня необходимых реагентов, материалов и оборудования, пожалуйста, обратитесь к списку конкретных материалов / Оборудование.
- Во время полного экспериментов, держать животное на разогрев пластины при температуре 37 ° С, постоянно подключен к системе анестезии, и крышка рабочей площади в целом с непроницаемая для жидкости, самоклеющихся шторы. Правильно организовать все контрольно-измерительные приборы и решения, которые используются во время экспериментов до операции (рисунок 1).
- Обезболить мышь с вдыханием 4% по объему изофлуран в 100% кислорода со скоростью потока 4 л / мин для индукции анестезии. Глубина анестезии достаточно, если выполняются следующие важные критерии достиг: Стабильный спонтанное дыхание, не рефлекс после установки болевые раздражения между пальцами, и нет ответа на боль.
- Бритье животе шерсть мыши с электрическим меха бритвы и защищают глаза от высыхания на использование глаз и пOSE мазь.
- Наведите на 37 ° C нагретого горячей плите, вставьте морду мыши в маске Fluovac системы анестезии Fluovac, и исправить ноги животного с полосами шелка ленты.
- Поддержание анестезии мыши при вдыхании 1,5-3 объемных% изофлуран в 100% кислорода со скоростью потока 1 л / мин и индукцию периоперационный обезболивание с помощью внутрибрюшинной инъекции бупренорфина раствора (0,1 мг / кг массы тела, растворенного в 0,9% -ном растворе NaCl) ,
- Стерилизовать побрился кожи живота марлей тампоном, смоченной в стандарте антисептическим, готов к использованию спиртовой раствор для предварительного оперативного лечения кожи. Примечание: В наших протоколов мы используем antisepticum кожи поли-алкоголя. Это находится в полном соответствии с немецким федеральным законом о защите животных, а также рекомендациями Федерации для лабораторных животных науки ассоциаций. Это антисептическое содержит 70% (об / об) 2-пропанол, бутан-1,3.diol и следы хинолиновый желтый, и парфюме.
2. Хирургические процедуры
- Открыть живота с срединной лапаротомии из длиной около 2 см, разрезав кутис плюс панель одновременно с 11,5 см хирургического ножницами.
- Рассеките соединительной ткани в верхней части брюшной полости с помощью ножниц как расширитель.
- Вырезать брюшины вдоль белой линии, чтобы открыть в брюшную полость.
- Увеличить полость, вставив удержания шовного материала в грудине, в результате чего нити шовного материала, и фиксации его в верхней части маски Fluovac.
- Распространение рабочей зоне, вставив втягивающим Colibri в брюшной полости (рис 2).
- Поднимите печень с увлажненной (0,9% NaCl раствор) ватным тампоном, чтобы брюшная сторона он прилипает к диафрагме и рубчик четко виден.
- Expose желчный проток по хвостового движения кишечника (рис 3).
- Отделите тщательно желчный проток отфланговые воротной вены и печеночной артерии с помощью микро-зубцы, щипцы (рис 4а).
- Поместите 5-0 шва вокруг желчных протоков и закрепите его с двух хирургических узлов. При вязании узлы увеличить тяговое усилие непрерывно для обеспечения эффективного препятствия без отсечения желчного протока (рис 4б).
- Добавить второй черепной лигирование таким же образом, но не рассекают желчный проток между ними (фиг.4С). В противном случае существует значительный риск того, что утечки желчи, если узел не является безопасным, и животные не испытывают холестаз, но развиваются тяжелые перитонит.
- Отрежьте концы швов (рис 4D), опустите грудную клетку, и снимите натяжитель.
- Промыть брюшную полость с 0,9% раствором NaCl и заменить органы брюшной полости физиологическим позиций.
- Закройте оба брюшной слои (брюшины и кутис плюс часть приборной панели) с отдельными ходовыми швами с 6-0 Mersilk.
- Отрежьте еNDS из швов и стерилизовать рабочей зоны с марлевой тампоном, смоченным антисептическим раствором.
Примечание: При выполнении операции впервые, выполнить все процедуры в соответствии с операционного микроскопа при увеличении 16Х-20Х. Это позволяет лучше признание желчного протока и четко отличает его от воротной вены и печеночной артерии (фиг.5 и 6). Некоторые лаборатории рекомендуем вскрытие желчного протока между двумя лигатурами. Оставьте желчный проток нетронутыми, поскольку потенциальные утечки в одном из узлов приведет к тяжелым острым перитонитом, асцит, и системной эндотоксемии при желчных протоков рассечена.
3. послеоперационного лечения и последующая деятельность
- Разрешить мыши, чтобы оправиться в клетке нагреть с помощью инфракрасной лампы, пока мышь не полностью проснулся и активным.
- После этого переместите мышь к нормальной клетке и обеспечивают вволю доступ к воде и пище.
- осле операции, контролировать животных через регулярные промежутки времени и осуществлять наблюдение до послеоперационного лечения с помощью подходящего обезболивания (например, бупренорфин раствора) в местном рекомендации внутреннего ухода за животными и использовать комитета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните обезболивающее терапию в течение 3 дней. Любое неправильное поведение может свидетельствовать о редких осложнений, таких как перитонит, сепсис или внутреннего кровотечения и следует обращаться как с человеческой конечной прекратить эксперимент. - Животные содержатся с бесплатным доступом к пище и воде без ограничений до конца эксперимента. Там нет необходимости для взятия крови с постоянной фиброгенез указывается желтухи.
- Когда животные приносятся в жертву, собирают кровь для измерения клинических параметров химия (АСТ, АЛТ, билирубин и т.д.) и печени извлекается для гистохимических и биохимического анализа.
Representative Results
В типичном экспериментов BDL проводили в 40 самцов мышей линии C57BL / 6 дикого типа массой около 18-20 грамм. Этот эксперимент был сделать, чтобы исследовать печени фиброгенез в фазе инициации (3 и 7 дней), во время прогрессирования (10, 14 и 20 дней), а при длительном (30 и 60 дней) 16. В этой модели, persinusoidal фиброз уже разработан на 10-й день после операции, в то время как перипортальный фиброз, что постоянно увеличивается до конца эксперимента был полностью разработан после 20 дней. В указанном эксперименте все животные, получившие простую ложной операции выжили, и только два из 40 мышей (5%), получавших BDL разработаны плохой общее состояние, и поэтому они преждевременно умерщвляли до запланированного конечной точки эксперимента. Деятельность ложнооперированных животных было без исключения уже нормально на следующий день после лапаротомии, а большинство животных, подвергнутых BDL показали снижение активности в течение первых трех дней. Jaundiced кожа была уже очевидна во всех BDL животных одного или двух дней после установки в BDL 16.
Значения обоих аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартаттрансаминазу (AST), которые представляют хорошо зарекомендовавшие себя в сыворотке крови маркеров повреждения печени быстро увеличивается и достиг в период с 7 дня и 20 дней после BDL (таблица 1). После этого, АЛТ и АСТ не постоянно снижается до 30 дня и оставалась стабильной до 60 дней после операции. В соответствии с холестатической травмы, концентрации в сыворотке крови общего билирубина были постоянно увеличены и достигли плато после 7 дней 16. Аналогичная время курс АЛТ и АСТ в сыворотке крови деятельности были также зарегистрированы у крыс, подвергшихся BDL. В недавнем исследовании было продемонстрировать, что сыворотка АСТ и АЛТ, вырос до 5 или 10 раз от нормы на первой неделе после операции BDL и уменьшается после двух недель 19.
Как правило, печень ложнооперированных животных по-прежнему выглядят Смутч в конце эксперимента, в то время как печень животных, которые получали BDL показать архитектурные изменения, которые в основном характеризуется образованием отека и фиброзных узелков на поверхности соответствующих печень и водянка желчного пузыря, который заполняется с большим количеством желчь (Рисунок 7). Характерные морфологические изменения печени, индуцированные операции BDL также доказуемо в стандартном гистологического анализа (рисунок 8).
В то же серии экспериментов, развитие фиброза печени была полу-количественно оценивается на основе гистологии печени оценивали слепым патологоанатомом с использованием системы баллов, в которой перипортальный фиброз был поставлен из 0-4 и перисинусоидальный фиброза от 0-2, давая максимум Значение, которое было эквивалентно цирроза 6. Как и ожидалось, фиброзе среднее в группе ложнооперированных животных было 0,00 ± 0,00. В противоположность этому, в группе животных, тшлем, полученные BDL, оценка не постоянно увеличивается до 60 суток до значения 4,83 ± 0,17. Максимум 3 для перипортальной фиброза была достигнута на 20-й день во всех анализируемых животных, перисинусоидальный фиброз отсутствовал в течение первых 10 дней эксперимента и был заметен во-первых, через две недели. После этого, он постоянно увеличивается до конца эксперимента до значений 1,8 ± 0,17 (табл.1).
Кроме того, в некоторых других независимых экспериментах на животных, которые были выполнены, было отмечено, что формирование фиброза была высокой воспроизводимостью, показывающий зависит от времени увеличение внутрипеченочного экспрессии коллагена и осаждения в результате непрерывного фиброгенеза (фиг.9). Аналогичным образом, процесс постоянной фиброгенеза заметно в повышенной экспрессии α-актина гладкой мышцы (α-SMA), что представляет собой маркер фибробластов клеток, то есть активированный звездчатых клеток печени и портальные миофибробласты,и печени гидроксипролина, аминокислота в изобилии найти в коллагеновые матрицы 18 (фиг.9). Кроме того, выражение виментина, что указывает на увеличение количества миофибробластами или фибробластов увеличивается после установки операции BDL 20. Сопутствование воспаления в поврежденных печени дополнительно отражается повышенной экспрессией Липокалин 2 (LCN2), сильно индуцированной во время острой и хронической травмы печени и развивается печеночно-защитные эффекты во время острого повреждения печени 21,22.
Воспалительные клетки, которые проникают в печени животных, получавших BDL могут быть обнаружены с помощью специфического окрашивания с использованием антитела, специфичные для CD45 (рисунок 10). Это сотовой поверхностный маркер, который также известен как PTPRC (протеин-тирозин-фосфатазы, типа рецептора) специфически экспрессируется во всех дифференцированных гематопоэтических клеток, за исключением эритроцитов и плазмы клеток.
| Время после желчных протоков лигирования (дней) | Общий билирубин | АСТ (ед / л) | ALT (U / L) | Портальный фиброз | Перисинусоидальный фиброз | Общий счет |
| (Мг / дл) | ||||||
| 0 (п = 3) | 0,17 ± 0,06 | 192,67 ± 30,50 | 50.33 ± 6.03 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 |
| 3 (N = 5) | 6,85 ± 2,21 | 1159,25 ± 319,27 | 566,50 ± 335,25 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 |
| 7 (N = 5) | <TD> 14.38 ± 2.14 ±976,60 ± 477,16 | 448.20 ± 259,47 | 0,60 ± 0,25 | 0,0 ± 0,0 | 0,60 ± 0,25 | |
| 10 (N = 5) | 15.92 ± 2.60 | 1916,60 ± 868,25 | 560,40 ± 80,88 | 1.40 ± 0.25 | 0,25 ± 0,25 | 1,67 ± 0,25 |
| 14 (N = 5) | 17.90 ± 3.84 | 1088,60 ± 276,32 | 505.00 ± 96.15 ± | 2,4 ± 0,25 | 1,0 ± 0,0 | 3.40 ± 0.24 |
| 20 (N = 4) | 18.00 ± 2.12 | 1072,67 ± 364,27 | 404.00 ± 195,48 | 3,0 ± 0,0 | 1,0 ± 0,0 | 4,0 ± 0,0 |
| 30 (N = 5) | 16.04 ± 4.79 | 446.40 ± 169,75 | 260,20 ± 126,97 | 2,8 ±; 0,2 | 1,4 ± 0,25 | 4.20 ± 0,20 |
| 60 (N = 6) | 16.02 ± 1.19 | 484,67 ± 117,79 | 257,17 ± 50,97 | 3,0 ± 0,0 | 1,8 ± 0,17 | 4.83 ± 0.17 |
Сокращения, используемые являются: ALT, аланинаминотрансферазы; АСТ, аспартатаминотрансферазы.
Таблица 1: фиброз совершение в типичном эксперименте Данные этой таблицы был воспроизведен из исследования, в котором фиброз печени индуцировали лигированием желчных протоков в C57BL / 6 мышей 16.. В этом исследовании, смертность после операции BDL было 5% (2 из 40 животных были досрочно в жертву, потому что плохие условия для животных разработке).
Рисунок 1: Экспериментальная установка для выполнения желчьканал перевязки. животное держали на разогрев пластины при температуре 37 о С и оперативно территория покрыта целом с непроницаемая для жидкости, самоклеющихся шторы. В полной операции, животное постоянно подключен к системе анестезии. Все измерительные приборы и решения (анальгетики, анестетики, антисептический раствор, 0,9% NaCl) расположены ясно.
Рисунок 2:. Получение области хирургии До открытия брюшной полости, брюшной кожи должны быть выбриты с электрическим меха бритвы и дезинфекции с антисептическим марлевой тампоном. Площадь хирургия затем покрывается непроницаемая для жидкости, самоклеющихся шторы. Живот открылся срединной лапаротомии (~ 2 см в длину). Полость увеличивается, вставив холдинговой шов в грудине и область работы, распространеннуювставки втягивающим Colibri, позволяющий беспрепятственный экспериментов во время операции.
Рисунок 3: Воздействие желчного протока. () Для проведения желчных протоков лигирования, брюшная сторона печени поднимается так, что он может придерживаться диафрагмы и печени воротах становится отчетливо видна. (B) лучше выставить желчный проток, кишка каудально переехал с увлажненный ватный тампон. Желчных протоков отмечен стрелкой.
Рисунок 4: лигирования желчного протока. (А) В качестве первого шага, желчных протоков, тщательно отделить от фланкирующей воротной вены и печеночной артерии с помощью микро-насечкой щипцов. (В) В дальнейшем шов размещены вокругжелчных протоков и закреплены с хирургическим узлом. (С) После второго шва помещают в непосредственной близости от первого шва и узлом вокруг желчного протока. (D) шовный сокращается, полость промывают 0,9% -ным раствором NaCl и все органы заменены на их физиологическом положении.
Рисунок 5:.. Точное представление завязывания Для документирования размещение швов и установку двух узлов, которые препятствуют желчи, же процедура, описанная в рисунке 4 был зарегистрирован под бинокулярным () помещение желчного протока с первый шов. (В) Заузливание первого шва. (С) Удержание желчного протока со вторым швом. (D) Заузливание второй нити. (Е) Дважды лигировали желчи DUCT после сокращения избыточных швов. (Е ') Эта панель изображает эскиз (Е). Позиции права (RL), справа налево (LL) и средний (мл) долей печени, а также желчных протоков, желудка, двенадцатиперстной кишки и обозначены буквами. В эскизе желчных проток дважды лигировали двумя швами.
Рис. 6: анатомия желчного протока, воротной вены и печеночной артерии у мышей Для лучшего анатомического расположения общего желчного протока, воротной вены и печеночной артерии изображены в виде схемы. Отмечены также позиции правого (RL), слева (LL) Средний (мл) и хвостатого (CL) долей печени.
Рисунок 7: Представитель appearaсть из печени через 2 недели после имитации операции и BDL. C57BL / 6 мышей подвергали симуляции операции или операции BDL. Через две недели висцерального полости была открыта. В то время как печень Животных с ложной операцией не показывал никаких признаков фиброза, печень животных, получавших лигирование желчного протока была нерегулярную структуру поверхности с образованием отека и фиброзных узелков на поверхности соответствующих печени.
Фигура 8:. Гематоксилином и эозином пятно срезов печени были получены из C57BL / 6 дикого типа животных, которые были с ложной операцией (А) или полученных BDL в течение трех недель (B). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином следующих стандартных процедур. Пожалуйста, обратите внимание на типичные изменения в печени BDL, которые включают признаки воспаления (проникают клетки), паренхиматозные (печеночноцит) некроз, и распространение желчных протоков. Бар масштаб в каждой фигуре панели представляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 9: гистологические и биохимические показания по печени фиброгенезе. (A) печени срезы получают из животных, получавших имитации операции или BDL в течение 2 недель и окрашивали Sirius Red (верхней панели, коллагеновых волокон в красный цвет), или анализировали на экспрессию α-актин гладких мышц (α-SMA) (нижняя панель , α-SMA-позитивных клеток в коричневый) с помощью иммуногистохимии. Бар масштаб в каждой фигуре панели представляет 100 мкм. (B) белковых экстрактов из печени были подвергнуты вестерн-блоттинга и анализировали на expreделения коллагена типа I, α-SMA и Виментин, которые хорошо установленном маркеры печеночного фиброгенеза. Выражение Липокалин-2 (LCN2) указывает на воспалительный ответ, связанный с постоянной фиброгенеза. В этом анализе, равно белка погрузки была продемонстрирована зондирования кляксы с антителом, специфичным для β-актина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 10:. Иммунологические окрашивание проникновения воспалительных клеток Серийные срезы печени были получены из печени животного, получившего желчных перевязки в течение 3 недель. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (А) или с антителом, которое специфично для CD45 (B). Пожалуйста, обратите внимание,Большое количество CD45-положительных клеток, окружающих желчные протоки. Эти массовые инфильтраты, которые указывают воспаление не видны в срезов печени, полученных из Животных с ложной операцией (не показан). Бар масштаб в каждой фигуре панели представляет 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Discussion
Cholestatic поражение печени является одним из основных причинных факторов для развития фиброза и цирроза печени у пациентов с хроническими заболеваниями печени. Исходя из того, что эти заболевания производить невесомых расходов на здравоохранение, то понятно, что многие исследователи пытаются понять патогенетические механизмы постоянного фиброза печени. Таким образом, экспериментальные модели были получены, которые имитируют различные аспекты сложных механизмов, которые приводят к печеночной воспаление, фиброз и цирроз печени 1.
Хирургический BDL является одним из самых распространенных экспериментальных моделей, которые используются, чтобы вызвать обструктивного холестатическое травмы у мышей и крыс 4,23,24. В большинстве протоколов, животных анестезируют и мидель лапаротомии выполняется. Впоследствии, желчных протоков раскрыта из брюшной полости и лигировали в два раза с помощью хирургического шпагат. Как следствие, у мышей и крыс, которые получили эту операцию Develop сильный фиброзная реакция, которая в первую очередь исходят из перипортальных полей 25. За годы несколько различных хирургических методов и модификации были описаны. Специальные процедуры даже позволить повторное подключение или reanastomosis после BDL 23. Другие методы основаны на частичном BDL, в результате чего значительно меньше образованием некроза и, следовательно, пролиферации гепатоцитов 24. Частичное BDL в сочетании с последующим удалением желчного пузыря (холецистэктомии), что предотвращает образование холецистита также представляет собой отличную экспериментальную модель для острого холестаза. Было предложено, чтобы быть моделью, которая находится ближе к человеческой ситуации 24. И действительно, во время установления этой модели, было уже продемонстрировал, что воспроизводимо вызывает холестаза при минимальном травмы гистологического ткани и не перейти к хронической холестаза 25. Таким образом, было отмечено, что эта модель идеально подходит для изучения лате эффекты обратной холестаза 24. Еще более сложные методы основаны на микрохирургии и позволяют быстро и воспроизводимым способом, чтобы причинить холестатическая поражения печени только в отдельных частях печени 26.
Хотя эти сложные модификации от оригинального протокола BDL, как было доказано быть очень полезным в расследовании конкретных исследовательских вопросов, многие лаборатории во всем мире в основном направлены на использовании модели BDL как высоко воспроизводимым и надежная модель для холестатическом фиброза печени. Тем не менее, многие осложнения могут возникнуть, которые могли бы существенно изменить воспроизводимость и надежность полученных результатов в рамках этой модели, если технические неточности не избежать. Например, кровотечений, связанных с повреждением кровеносных сосудов, сопровождающих желчный проток (см фиг.3 - 4) может произойти во время или после операции быстро. Передозировка анестезии с последующим cardiodepression или Respiratory отказ также можно избежать осложнения процедуры. Тяжелые инфекции, начиная от перитонита, сепсиса, может произойти в течение всего периода эксперимента, если швы не выполняется точно и утечки желчи в брюшную полость. Случайные травмы кишечника во время операции может привести к перитониту. Таким образом, очевидно, что стандартизированные протоколы, которые в соответствии со строгими руководящими принципами обработки сильно требуется. Это условие также недавно потребовало в странах Европейского Союза, который внедрил новые правила защиты животных в 2013 году 1. Соответствующие требования, связанные с этим Правилам, не являются новыми и уже предложил в 1959 году, когда Рассел и Берч предложили этические рамки для проведения научных экспериментов с животными, главным образом на основе замены, изысканность и восстановление (3R) Принцип 27.
Когда после outlinПротокол ред Есть только несколько осложнений, которые могут возникнуть в результате технических погрешностей. Три конкретные вопросы могут возникнуть в довольно низкой частоты.
Как и во всех хирургических процедур, передозировка анестетика является потенциальным источником опасности для животных, особенно в сочетании с гипотермией. Если во время операции сердечно-сосудистые осложнения возникают, поставка анестетиков следует немедленно прекратить и оператор должен попытаться обеспечить максимально кислорода к мыши. Это может быть сделано с помощью небольшой пластиковый шприц, наполненный воздухом и закачивается в устье нарушенной животного. Кроме того, использование небольшого Peleusball для вентиляции пораженного животного часто бывает полезно для процесса активизации.
Проблемы в заживлении ран
После операции BDL, мыши могут укусить свои собственные швы болят или у других животных. Если это происходит, соответствующие мышей должно быть отдельнов клетке. Животные с открытых ран должны быть под наркозом, область вокруг раны слегка стерилизуют стандартным антисептик, и рана должна быть зашита снова. В течение следующих 3 дней, рана этих животных должны регулярно проверяться (два-три раза в день).
Distensions живота или формирование асцита указывают на бактериальных инфекций. Это может произойти из-за нестерильных работы во время операции. Все виды инфекций следует обращаться без исключения, как гуманной конечной точки и пострадавшие животные должны быть принесены в жертву.
Мы предоставили легко следовать протокол, который позволяет производительность BDL у мышей, которое является простым в реализации и вызывает только низкая смертность животных в сочетании с высокой воспроизводимостью. Все хирургические протоколов можно быстро задержаны квалифицированных ученых. В полной экспериментов животных содержали при потепления пластины при температуре 37 ° С и постоянно подключенк системе анестезии минимизации боли и страдания. Для хирургии брюшной полости открывается с срединной лапаротомии и желчных протоков дважды лигированного, не рассекая ее. Представительные результаты, которые были обсуждены здесь, показывают, что фенотипические изменения в отношении морфологии печени (воспаление, фиброз, цирроз) высокой воспроизводимостью и позволяют изучать различные аспекты фиброгенеза (например., Начало, воспаление, прогрессирование, терминальной стадии болезни) в определенных временных точках.
Мы надеемся, что резюме нашего протокола поможет сократить кривую обучения, которые необходимы, чтобы успешно установить эту фиброз модель в других лабораториях и гарантировать надежные и воспроизводимые результаты в разных местах. Таким образом, мы думаем, что представлено протокол поддерживает принцип 3R, который должен был Рассел и Берч в 1959 году и представляет собой основу новых правил по защите животных, которые в настоящее внедрены во многих странах Wiтонкий Европейская рамочная.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за финансовую поддержку Немецкого исследовательского фонда (SFB / TRR57, Q3 и Q2). Авторы благодарят Mareike Шульц, Pascal Paschenda и Klaudia Warzecha за помощь в подготовке фотографий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
References
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The Principles of Humane Experimental Technique. , London, Methuen. (1959).
