Abstract
I de flesta ryggradsdjur producerar levern galla som är nödvändig för att emulgera absorberade fetter och möjliggöra nedbrytning av lipider i tunntarmen såväl som att utsöndra bilirubin och andra metaboliska produkter. I levern, den experimentella obstruktion av extrahepatisk biliär systemet initierar en komplex kaskad av patologiska händelser som leder till kolestas och inflammation som resulterar i en stark fibrotisk reaktion härrör från de periportala fälten. Därför har kirurgisk ligering av gallgången blivit den mest använda modellen för att inducera obstruktiv kolestatisk skador hos gnagare och studera de molekylära och cellulära händelser som ligger bakom dessa patofysiologiska mekanismer inducerade av olämpligt gallflöde. Under senare år har olika kirurgiska tekniker beskrivits som antingen tillåter återanslutning eller reanastomosis efter gallgången tion (BDL), t.ex. partiell BDL eller andra mikrometoder för specifika forskningsfrågor. Emellertid är den mest använda modellen för fullständig obstruktion av den gemensamma gallgången som inducerar en stark fibrotisk respons efter 21-28 dagar. Dödligheten kan vara hög på grund av infektiösa komplikationer eller tekniska felaktigheter. Här ger vi en detaljerad kirurgiskt ingrepp för BDL modellen i möss som inducerar en mycket reproducerbar fibrotiskt svar i enlighet med 3R regeln för djurskydd postulerade av Russel och Burch 1959.
Introduction
Leverfibros definieras som överdriven produktion och ackumulering av extracellulär matrix (ECM) som härstammar från ett komplext nätverk av interaktioner av matrisproducerande lever stellatceller och ett brett utbud av lever bosatt och infiltrerande celler blodkroppar 1,2. Även leverfibros kan orsakas av en mängd olika stimuli de molekylära mekanismerna bakom fibros är generellt mycket lika. Efter leverskada, är en mycket iscensatt program av molekylära och cellulära förändringar initieras. I detta program sker en nära samverkan mellan inflammatoriska signaler, monocyter / makrofager och lever stellatceller att vid slutresultatet i stelcellsaktivering och transdifferentiering till myofibroblaster, ECM nedfall och på varandra följande anatomiska och funktionella förändringar av levervävnad integritet 3. Aktivering av lever stellatceller är särskilt driven av inflammatoriska signaler och interaktioner med leverresidental makrofager (dvs. Kupffer-celler). Patogen associerade molekylära mönster känns igen av specialiserade mönsterigenkänningsreceptorer såsom Toll-liknande receptorer som när den aktiveras signalen genom ett komplext nätverk av olika vägar som utlöser uttryck och sekretion av en mängd inflammatoriska cytokiner och kemokiner som driver den inflammatoriska processen 3. Den inflammatoriska svaret och bildade lever förolämpning är bara tillfälligt när sjukdomen producerande faktorn avlägsnas. Däremot om skadan kvarstår, utvecklas kronisk inflammation i levern och uttrycket och ackumulering av ECM folkmassor i förgrunden vilket resulterar i progressiv substitution av normal leverparenkym av ärrvävnad.
Eftersom lever fibrogenes hos människor är ett globalt kliniskt problem, har flera experimentella gnagarmodeller av akut och kronisk leversvikt etablerats under de senaste decennierna. I MURine system för exempelvis vanliga modeller är administrationen av en mängd olika hepatotoxiner, ligering av gallgången, induktion av immunmedierad leverskada, och målinriktad införandet av gendefekter eller tvärtom överuttryck av transgener som påverkar kritiska signalvägar som är involverade i patogenesen av leverfibros 4.
Ligering av den gemensamma gallgången hos gnagare har utförts som ett experimentellt förfarande i forskning under många år 5-8. En första mycket reproducerbar protokoll för långvarig gallgången tion (BDL) hos gnagare var redan presenterade nu mer än tre decennier sedan 9. I detta protokoll både kanyle / obstruktion och ligering inducerade ett högt utbyte av cirros hos råttor med morfologiska förändringar som var jämförbara med de som observerats hos människa biliär cirros 9. Respektive protokollet är enkel, det kirurgiska ingreppet är relativt snabbt tillämpligtOch överlevnaden hos djuren är höga med över 95%. I den klassiska råttkanyler / obstruktion protokollet, är en kort snitt i 2 cm gjordes strax nedanför xiphoid processen. Därefter görs en kanyl insatt i den proximala delen av gallgången och fixeras i sin position med silkessuturer. I ett nästa steg, är den distala delen av kanylen hindras med tre knutar, satte genom den nedre änden av mittlinjen snitt och begravd subkutant i den högra nedre kvadranten 9. I slutet, är buken stängd och djur får återhämta sig. I ligeringen protokollet råttorna kastades dubbel ligering av den gemensamma gallgången antingen med eller utan dissektion av gallgången mellan ligaturerna 9.
Denna experimentella modell är väl accepterat och används över hela världen i hundratals laboratorier för att framkalla lever kolestas och fibros. Det inducerar intrahepatisk galla epitelcellproliferation, myofibroblastic differentiation portal fibroblaster runt prolifererande gall epitelceller, vilket resulterar i ett mycket reproducerbart, massiva uttryck och deposition av ECM 10,11. Därför är tillämpningen av denna modell på råttor och möss är populär bland forskare som syftar till att förstå patogenesen för leverinflammation och fibros.
I vårt laboratorium har vi flitigt detta protokoll i det förflutna hos råttor i flera experimentella studier som syftar till att undersöka särskilda molekylära och cellulära aspekter av lever fibrogenes och testa nya antifibrotisk koncept och droger 12-15.
Nyligen, anpassade vi denna metod på murinsystemet och fann att gallgången tion kirurgi är också en attraktiv medelvärde att etablera tidsberoende fibros med låg variation och dödlighet hos möss 16-18. På grund av den mindre storleken av djuren, dock några viktiga förändringar när det gäller narkos, kirurgiska intervention och efterbehandling observation är nödvändig för att erhålla tillförlitliga och reproducerbara resultat i denna modell. Den fullständiga anpassning sammanfattas i följande protokoll och i den åtföljande videodokumentation.
Protocol
OBS: Alla experiment har godkänts av den officiella statliga djurvård och användning kommittén (LANUV, Recklinghausen, Tyskland). Mössen är inrymda i specifik patogenfria villkor enligt riktlinjerna i federationen för försöksdjursvetenskap föreningar (FELASA). Alla experiment utfördes i enlighet med den tyska federala lagen om skydd av djur och "Guide för skötsel och användning av försöksdjur" (National Institutes of Health publikation 8: e upplagan, 2011).
1. Presurgical Framställning
OBS: Utför alla moment i rena men icke-sterila förhållanden. Alla instrument och annan återanvändbar utrustning såsom kirurgiska pincett, sax och Colibri upprullningsdon som används för att utföra operationen måste steriliseras före användning enligt protokoll som är i strikt överensstämmelse med de institutionella riktlinjer för utförande av operationer hos djur.; För en detaljerad lista över nödvändiga reagenser, material och utrustning, se listan över specifika material / utrustning.
- Under hela experimenterande, hålla djuret på en värmeplatta vid en temperatur på 37 ° C, fast ansluten till en anestesisystemet, och locket verksamhetsområdet övergripande med vätsketäta, självhäftande draperier. Korrekt ordna alla besättningar och lösningar som används under experimenterande före operation (Figur 1).
- Bedöva musen med inandning av 4 vol-% isofluran i 100% syre vid en flödeshastighet av 4 liter / min för induktion av anestesi. Djupet av anesthetization räcker när följande vitala kriterier uppnås: regelbunden spontan andning, ingen reflex efter inställning av smärtstimuli mellan tårna, och inget svar på smärta.
- Raka buken päls av musen med en elektrisk päls rakapparat och skydda ögonen från att torka ut genom användning av ögat och nOSE salva.
- Placera musen på en 37 ° C upphettad värmeplatta, sätt musen nosen i Fluovac masken av Fluovac anestesisystemet, och fixa benen på djuret med ränder av sidenbandet.
- Upprätthålla anestesi av musen genom inhalation av 1,5-3 volym-% isofluran i 100% syre vid en flödeshastighet av 1 l / min och induct perioperativ analgesi via intraperitoneal injektion av buprenorfin-lösning (0,1 mg / kg kroppsvikt upplöst i 0,9% NaCl-lösning) .
- Sterilisera rakade buken huden med en gasbinda pinne som fuktats med en standard antiseptisk, redo att använda alkohollösning för preoperativ behandling av huden. Obs: I våra protokoll använder vi en poly-alkohol huden antisepticum. Detta är helt i enlighet med den tyska federala lagen om skydd av djur och riktlinjerna i federationen för försöksdjursvetenskap föreningar. Denna antiseptisk innehåller 70% (volym / volym) 2-propanol, butan-1,3.diol och spår av kinolingult och perfume.
2. kirurgiska ingrepp
- Öppna buken med en mittlinje laparotomi av en längd av ca 2 cm genom att skära cutis plus fascia samtidigt med en 11,5 cm kirurgisk sax.
- Dissekera bindväv ovanpå bukhinnan med hjälp av sax som en spridare.
- Skär bukhinnan längs linea alba att öppna den peritoneala kaviteten.
- Förstora kaviteten genom att sätta in ett innehav sutur i bröstbenet, höja glödtråden av suturen, och fixera den ovanpå Fluovac masken.
- Sprid operationsområdet genom att sätta in en Colibri sårhake i bukhålan (figur 2).
- Lyft levern med en återfuktad (0,9% NaCl-lösning) bomullspinne så att den ventrala sidan av det fastnar på membranet och hilum syns tydligt.
- Exponera gallgången genom kaudal rörelse av tarmen (figur 3).
- Separera försiktigt gallgången frånflankerande portven och leverartären med hjälp av en mikro-sågtänder pincett (Figur 4A).
- Placera 5-0 sutur runt gallgången och fäst den med två kirurgiska knutar. När knyta knutar ökar dragkraften kontinuerligt för att säkerställa en effektiv obstruktion utan bryta gallgången (Figur 4B).
- Lägg ett andra kraniell ligering på samma sätt men inte dissekera gallgången däremellan (figur 4C). Annars finns det en stor risk att galla läckor om en knut inte är säkert, och djuren upplever ingen kolestas men utvecklar allvarliga peritonit.
- Skär ändarna av suturer (Figur 4D), sänk bröstbenet, och ta bort upprullningsdonet.
- Skölj den peritoneala håligheten med 0,9% NaCl-lösning och ersätta bukorganen till de fysiologiska positioner.
- Stäng både buken lager (bukhinnan och cutis plus facia) med separata löpande suturer med 6-0 Mersilk.
- Skär ends av suturer och sterilisera operationsområdet med en gasbinda pinne fuktad med antiseptisk lösning.
OBS: När du utför operationen för första gången, utför alla moment i ett operationsmikroskop vid en förstoring av 16X-20X. Detta möjliggör bättre erkännande av gallgången och tydligt skiljer den från portalen ven och leverartären (figur 5 och 6). Vissa laboratorier rekommenderar dissektion av gallgången i mellan de två ligaturer. Lämna gallgången intakt eftersom potentiella läckor i någon av de knutar kommer att resultera i allvarlig akut bukhinneinflammation, ascites, och systemisk endotoxemi när gallgången dissekeras.
3. Postoperativ behandling och uppföljning
- Låt musen för att återhämta sig i en bur värmas upp av en infraröd lampa tills musen är helt vaken och aktiv.
- Efteråt flytta musen till en normal bur och ge fri tillgång till vatten och mat.
- ENfter operationen, övervaka djuren regelbundet och genomföra uppföljande postoperativ behandling med lämplig smärtlindring (t.ex. buprenorfin lösning) efter lokal rekommendation av den inre djurvård och använda kommittéer.
OBS: Utför analgetisk terapi i 3 dagar. Varje onormalt beteende kan tyda sällsynta komplikationer såsom peritonit, sepsis eller inre blödningar och ska hanteras som mänsklig endpoint att avsluta experimentet. - Djuren hålls med fri tillgång till mat och vatten ad libitum fram till slutet av experimentet. Det finns inget behov av blodprov eftersom pågående fibrogenes indikeras av gulsot.
- När djuren avlivas, är blod samlas in för mätning av klinisk kemi parametrar (ASAT, ALAT, bilirubin etc.) och levern hämtas för histokemisk och biokemisk analys.
Representative Results
I ett typiskt experiment BDL utfördes i 40 manliga C57BL / 6 vildtyp möss vikt cirka 18-20 gram. Detta experiment gjordes för att undersöka lever fibrogenes i initieringsfasen (3 och 7 dagar), under progression (10, 14, och 20 dagar), och under långtids (30 och 60 dagar) 16. I denna modell har persinusoidal fibros redan utvecklat på dag 10 efter operationen, medan periportal fibros som permanent ökas upp till slutet av försöket var fullt utvecklad efter 20 dagar. I det nämnda experimentet, alla djur som fick en enkel sham-operation levde, och endast två av de 40 möss (5%) som fick BDL utvecklat ett dåligt allmäntillstånd och var därför i förtid offras innan det planerade slutpunkten för experimentet. Aktiviteten av skenopererade djur var utan undantag redan normalt en dag efter laparotomi, medan de flesta av de djur som utsatts för BDL visade minskad aktivitet under de första tre dagarna. Jaundiced hud hade varit redan i alla BDL djur en eller två dagar efter inställning av BDL 16.
Värdena för både alaninaminotransferas (ALAT) och aspartataminotransferas (AST) som representerar väletablerade serummarkörer av leverskada snabbt ökat och var som högst under dagen 7 och dag 20 efter BDL (tabell 1). Därefter ALT och AST minskade stadigt fram till dag 30 och förblev stabil fram 60 dagar efter operationen. I linje med kolestatisk skada, nivåer av totalt bilirubin var stadigt förhöjda och nådde en platå efter 7 dagar 16. Liknande tidsförloppet för ALAT och ASAT serumverksamheten noterades även för råttor som genomgick BDL. I en färsk undersökning demonstrerade att serum ASAT och ALAT ökat upp till 5 eller 10 gånger av normal vid den första veckan efter BDL kirurgi och minskade efter två veckor 19.
Normalt lever av skenopererade djur ser fortfarande Smooth vid slutet av experimentet, medan levern hos djur som erhöll BDL visar arkitektoniska förändringar som huvudsakligen kännetecknas av bildningen av ödem och fibrotiska knölar på ytan av motsvarande levrar och hydrops i gallblåsan som är fylld med stora mängder galla (Figur 7). De karakteristiska morfologiska förändringar i levern som induceras av BDL kirurgi är också påvisbara i standard histologisk analys (figur 8).
I samma serie experiment, utveckling av leverfibros var halv kvantitativt bedömas utifrån leverhistologi utvärderas av en blindad patolog med hjälp av ett poängsystem där periportal fibros var iscensatt 0-4 och perisinusoidal fibros 0-2, vilket ger en maximal värde som motsvarade cirros av 6. Som väntat medel fibros poäng i gruppen av skenopererade djur var 0,00 ± 0,00. Däremot i den grupp av djur thatt fått BDL, ökade poängen stadigt fram till dag 60 till ett värde av 4,83 ± 0,17. Den högst 3 för periportal fibros nåddes vid dag 20. I alla djur analyserade, perisinusoidal fibros var frånvarande under de första 10 dagarna av försöket och var först märkbar efter två veckor. Därefter ökade den stadigt fram till slutet av försöket till värden av 1,8 ± 0,17 (tabell 1).
Även i flera andra oberoende djurförsök som utfördes, observerades det att bildandet av fibros var mycket reproducerbar visar tidsberoende ökning av intrahepatisk kollagen uttryck och nedfall som en följd av pågående fibrogenes (Figur 9). På samma sätt är märkbar i förhöjd uttryck av α-glattmuskelaktin (α-SMA) som representerar en markör för fibroblastceller processen med pågående fibrogenes, dvs aktiverade lever stellatceller och portal myofibroblaster,och lever hydroxyprolin, en aminosyra rikligt finns i kollagenmatriser 18 (figur 9). Dessutom är ett uttryck för vimentin som indikerar ökande mängder av myofibroblaster eller fibroblaster ökat efter inställning av BDL kirurgi 20. Den samtidighets av inflammation i skadade lever vidare reflekteras av ökat uttryck av lipokalin 2 (LCN2) som starkt induceras under akut och kronisk leverskada och utvecklas Lever och skyddande effekter under akut leverskada 21,22.
Inflammatoriska celler som infiltrerar levrarna hos djur som erhöll BDL kan detekteras genom specifik färgning med en antikropp som är specifik för CD45 (figur 10). Denna cellulära ytmarkör som också är känd som PTPRC (proteintyrosinfosfatas, receptortyp) uttrycks specifikt i alla differentierade hematopoietiska celler utom erytrocyter och plasmaceller.
| Tid efter gallgången tion (dagar) | Totalt bilirubin | ASAT (U / L) | ALT (U / L) | Portal fibros | Perisinusoidal fibros | Total poäng |
| (Mg / dl) | ||||||
| 0 (n = 3) | 0,17 ± 0,06 | 192,67 ± 30,50 | 50,33 ± 6,03 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 |
| 3 (n = 5) | 6,85 ± 2,21 | 1159,25 ± 319,27 | 566,50 ± 335,25 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 | 0,0 ± 0,0 |
| 7 (n = 5) | <td> 14.38 ± 2,14 ±976,60 ± 477,16 | 448,20 ± 259,47 | 0,60 ± 0,25 | 0,0 ± 0,0 | 0,60 ± 0,25 | |
| 10 (n = 5) | 15,92 ± 2,60 | 1916,60 ± 868,25 | 560,40 ± 80,88 | 1,40 ± 0,25 | 0,25 ± 0,25 | 1,67 ± 0,25 |
| 14 (n = 5) | 17,90 ± 3,84 | 1088,60 ± 276,32 | 505,00 ± 96,15 ± | 2,4 ± 0,25 | 1,0 ± 0,0 | 3,40 ± 0,24 |
| 20 (n = 4) | 18,00 ± 2,12 | 1072,67 ± 364,27 | 404,00 ± 195,48 | 3,0 ± 0,0 | 1,0 ± 0,0 | 4,0 ± 0,0 |
| 30 (n = 5) | 16,04 ± 4,79 | 446,40 ± 169,75 | 260,20 ± 126,97 | 2,8 ±; 0,2 | 1,4 ± 0,25 | 4,20 ± 0,20 |
| 60 (n = 6) | 16,02 ± 1,19 | 484,67 ± 117,79 | 257,17 ± 50,97 | 3,0 ± 0,0 | 1,8 ± 0,17 | 4,83 ± 0,17 |
Förkortningar som används är: ALT, alaninaminotransferas; AST, aspartataminotransferas.
Tabell 1: Fibros scoring i ett representativt experiment Uppgifterna i denna tabell reproducerades från en studie där leverfibros inducerades genom gallgången tion i C57BL / 6 möss 16.. I denna studie, dödligheten efter BDL operationen var 5% (2 av 40 djur i förtid offras eftersom dåliga djurförhållanden utvecklas).
Figur 1: Experimentell setup för att utföra en gallakanal ligatur. Djuret hålls på en värmeplatta vid en temperatur på 37 ° C och verksamhetsområdet är täckt övergripande med vätsketäta, självhäftande draperier. Under den fullständiga kirurgi, är djuret permanent kopplad till en anestesisystem. Alla besättningar och lösningar (analgetika, anestetika, antiseptisk lösning, 0,9% NaCl) arrangeras tydligt.
Figur 2:. Beredning av kirurgi området Före öppning av bukhålan, bör bukhuden rakas med en elektrisk päls rakapparat och desinficeras med en antiseptisk kompress pinne. Operationen Området täcks sedan med vätsketäta, självhäftande draperier. Buken öppnas med en mittlinjen laparotomi (~ 2 cm i längd). Hålrummet förstoras genom att sätta in ett holdingbolag sutur i bröstbenet och operationsområdet sprids avatt sätta in en Colibri upprullningsdon möjliggör obehindrad experimenterande under operationen.
Figur 3: Exponering av gallgången. (A) För att genomföra gallgången ligation, är den ventrala sidan av levern lyfts så att den kan hålla sig till membranet och lever hilus blir tydligt synliga. (B) För att bättre exponera gallgången, är tarmen kaudalt flyttat med en fuktad bomullspinne. Gallgången är markerad med en pil.
Figur 4: ligering gallgången. (A) I ett första steg gallgången separeras försiktigt från flankerande portavenen och leverartären med hjälp av en mikroserra pincett. (B) Därefter en sutur placeras runtgallgången och säkras med en kirurgisk knut. (C) Därefter en andra sutur placeras i omedelbar närhet till den första suturen och knutna runt gallgången. (D) Suturen förkortas, kaviteten sköljdes med 0,9% NaCl-lösning och alla organ ersätts till deras fysiologiska position.
Figur 5:.. Exakt återgivning av knyta Att dokumentera placeringen av suturer och inställningen av de två knop som förhindrar galla flöde, var det samma procedur som beskrivs i Figur 4 dokumenterat i en kikare (A) Inneslutning av gallgången med första sutur. (B) knut av den första suturen. (C) Inneslutning av gallgången med den andra sutur. (D) knut av den andra sutur. (E) Dubbel ligerade galla ddukt efter förkortning av överskott suturer. (E ') Denna panel visar en skiss av (E). Positionerna för höger (rl), vänster (LL) och median (ml) lober i levern liksom gallgången, mage och tolvfingertarmen är bokstäverna. I skissen gallgången är dubbelt ligeras med två suturer.
Figur 6:. Anatomy of gallgången, portådern och leverartären hos möss För bättre anatomisk placering av den gemensamma gallgången, är portalen ven och leverartären skildras som ett system. Markerade är också positionerna för höger (rl), vänster (ll) median (ml) och caudatus (CL) lober i levern.
Figur 7: Representant framtrIOU av levrar 2 veckor efter skenoperation och BDL. C57BL / 6-möss utsattes för simulerad operation eller BDL kirurgi. Efter två veckor den viscerala hålrum öppnades. Medan levern hos skenopererade djur uppvisade inga tecken på fibros, levrarna hos djur som fick ligering av biliär kanalen hade en oregelbunden ytstruktur med bildning av ödem och fibrotiska knölar på ytan av motsvarande levrar.
Figur 8:. Hematoxylin och eosin stain Lever sektioner preparerades från C57BL / 6 vildtyp djur som var skenopererade (A) eller mottagna BDL för tre veckor (B). Snitten färgades med hematoxylin och eosin enligt standardförfaranden. Observera de typiska förändringar inom BDL levern som inkluderar tecken på inflammation (infiltrera celler), parenkymal (levernscyte) nekros, och spridning av gallgångarna. Skalan bar i varje figur panel representerar 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Histologiska och biokemiska avläsning för lever fibrogenes. (A) leversnitt framställdes från djur som fick skenoperation eller BDL för två veckor och färgades med Sirius Red (övre panel, kollagenfibrer i rött) eller analyserades för expression av α-glattmuskelaktin (α-SMA) (lägre panelen , α-SMA-positiva celler i brunt) genom immunohistokemi. Skalan bar i varje figur panel representerar 100 nm. (B) Proteinextrakt från levrar utsattes för Western blot och analyseras för expression av kollagen typ I, α-SMA, och Vimentin som är väl etablerade markörer för lever fibrogenes. Uttrycket av lipokalin-2 (LCN2) indikerar det inflammatoriska svaret som är associerad med pågående fibrogenes. I denna analys var lika protein lastning demonstreras genom sondering blottarna med en antikropp specifik för β-aktin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10:. Immunologisk färgning av infiltrerande inflammatoriska celler Seriella leversnitt framställdes från en lever av ett djur som mottog gallgången ligering för 3 veckor. Snitten färgades med hematoxylin och eosin (A) eller med en antikropp som är specifik för CD45 (B). Observera,det höga antalet CD45 positiva celler som omger gallgångarna. Dessa massiva infiltrat som indikerar inflammation syns inte i leversnitt härledda från skenopererade djur (visas ej). Skalan bar i varje figur panel representerar 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kolestatisk leverskada är en av de viktigaste orsaksfaktorer för utvecklingen av leverfibros och cirros hos patienter med kronisk leversjukdom. Baserat på det faktum att dessa sjukdomar producerar imponderable vårdkostnader, är det begripligt att många forskare försöker förstå de patogena mekanismerna hos pågående leverfibros. Därför har experimentmodeller genererats som efterliknar olika aspekter av de komplexa mekanismer som leder till leverinflammation, fibros och cirros 1.
Kirurgisk BDL är en av de mest utbredda experimentella modeller som används för att framkalla obstruktiv kolestatisk skador hos möss och råttor 4,23,24. I de flesta av de protokoll djuren bedövas och en mittsektion laparotomi utförs. Därefter gallgången avtäckt från bukhålan och ligerades dubbelt med användning kirurgisk garn. Som en följd av de möss och råttor som fått denna operation develop en stark fibrotisk reaktion som vid första härstammar från de periportala fält 25. Under årens lopp har flera olika kirurgiska tekniker och modifieringar har beskrivits. Särskilda rutiner gör att även återanslutning eller reanastomosis efter BDL 23. Andra tekniker är baserade på partiell BDL vilket resulterar i betydligt mindre nekros bildningen och därmed hepatocytproliferation 24. Partiell BDL i kombination med efterföljande avlägsnande av gallblåsan (kolecystektomi) som förhindrar bildning av cholecystit också representerar en utmärkt experimentell modell för akut kolestas. Det föreslogs att vara en modell som ligger närmare den mänskliga situationen 24. Och faktiskt, under upprättandet av denna modell, det var redan visat att den reproducerbart orsakar kolestas med endast minimal histologiska vävnadsskada och inte fortsätta till kronisk kolestas 25. Därför föreslogs det att denna modell är idealisk för att studera late effekter av omvänd kolestas 24. Ännu mer sofistikerade metoder är baserade på mikrokirurgi och möjliggöra en snabb och reproducerbart sätt att orsaka kolestatisk leverskada endast i utvalda delar av levern 26.
Även dessa sofistikerade modifieringar från den ursprungliga BDL-protokollet har visat sig vara mycket användbart för att utreda specifika forskningsfrågor, många laboratorier över hela världen i grunden syftar till att använda den BDL modellen som en mycket reproducerbar och tillförlitlig modell för kolestatisk leverfibros. Däremot kan många komplikationer uppstå som kan väsentligt förändrar reproducerbarhet och tillförlitlighet de resultat som denna modell, om tekniska felaktigheter inte undviks. Till exempel, blödningskomplikationer i samband med skador på blodkärlen som åtföljer gallgången (se figur 3-4) kan uppträda under eller snabbt efter operationen. Överdosering av anestesi med efterföljande cardiodepression eller respiratory misslyckande är också påverkbara komplikationer av förfarandet. Svåra infektioner, alltifrån peritonit till sepsis, kan förekomma under hela perioden av experimentet, om suturerna inte korrekt utfört och galla läcker in i bukhålan. Oavsiktliga skador på tarmen under operationen kan också leda till peritonit. Därför är det självklart att standardiserade protokoll som är i överensstämmelse med strikta riktlinjer hanterings är starkt krävs. Denna bestämmelse har också nyligen krävde inom länderna i Europeiska unionen, som genomförde nya djurskyddsbestämmelser under 2013 1. Respektive krav som är förknippade med denna förordning är inte nya och redan föreslagit 1959, när Russell och Burch föreslog en etisk ramverk för vetenskapliga experiment med djur som främst bygger på en ersättare, förfining och minskning (3R) principen 27.
När man följer outlined-protokollet finns det bara ett fåtal komplikationer som kan uppstå från tekniska felaktigheter. Tre specifika frågor kan uppstå i ganska låg frekvens.
Som med alla kirurgiska ingrepp, är överdos av narkos en potentiell källa till fara för djuren, särskilt i kombination med hypotermi. Om kardiovaskulära komplikationer under operation uppträder bör tillförseln av bedövningsmedel omedelbart avbrytas och operatören ska försöka ge mycket som möjligt syre till musen. Detta kan göras med hjälp av en liten plastspruta som är fylld med luft och pumpas in i mynningen av nedsatt djuret. Alternativt är ofta till hjälp för vitalisering processen användning av en liten Peleusball för ventilation av det drabbade djuret.
Problem i sårläkning
Efter BDL kirurgi, kan möss bita sina egna ömma sömmar eller de av andra djur. Om detta inträffar bör respektive möss vara separatcaged. Djur med öppna sår bör bedövas, regionen runt såret försiktigt steriliseras med en standard antiseptisk, och såret bör sys upp igen. Under de kommande tre dagarna, bör såret av dessa djur inspekteras regelbundet (två till tre gånger om dagen).
Distensions av buken eller bildning av ascites är vägledande för bakterieinfektioner. Dessa kan uppstå på grund av icke-sterila arbetande under operationen. Alla slags infektioner bör hanteras utan undantag som ett humant endpoint och de drabbade djuren ska offras.
Vi gav en lätt att följa protokoll som gör prestanda BDL i möss som är enkel att implementera och väcker bara låg djurdödlighet i kombination med en hög reproducerbarhet. Alla de kirurgiska protokoll kan snabbt uppfattas av skickliga vetenskapsmän. Under hela experimenterande djuren hålls på en värmeplatta vid 37 ° C och permanent anslutnatill ett anestesisystem minimerar smärta och ångest. För operation, är buken öppnas med en mittlinje laparotomi och gallgången dubbel ligerad utan dissekera den. De representativa resultat som diskuterades här visar att de fenotypiska förändringar i fråga om lever morfologi (inflammation, fibros, cirros) är mycket reproducerbar och tillåta att studera olika aspekter av fibrogenes (t.ex.., Initiering, inflammation, progression, slutstadiet sjukdom) vid definierade tidpunkter.
Vi hoppas att sammanfattningen av våra protokoll kommer att bidra till att förkorta inlärningskurva som är nödvändigt för att framgångsrikt etablera denna fibros modell i andra laboratorier och garantera tillförlitliga och reproducerbara resultat på olika platser. Därmed tror vi att den presenterade protokollet stöder 3R-principen som var tänkt från Russell och Burch 1959 och utgör grunden för nya välfärdsregler djur som för närvarande genomförs i många länder witunn den europeiska referensramen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för det ekonomiska stödet från den tyska Research Foundation (SFB / TRR57, Q3 och Q2). Författarna tackar Mareike Schulz, Pascal Paschenda och Klaudia Warzecha för deras hjälp att förbereda fotografierna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
References
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W.
- Cameron, G. R., Oakley, C. L.
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. The Principles of Humane Experimental Technique. , London, Methuen. (1959).
