Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.
I de fleste hvirveldyr, leveren producerer galde, som er nødvendig for at emulgere absorberede fedtstoffer og muliggøre fordøjelse af lipider i tyndtarmen samt at udskille bilirubin og andre metaboliske produkter. I leveren, den eksperimentelle obstruktion af ekstrahepatisk galdeveje initierer en kompleks kaskade af patologiske begivenheder, der fører til cholestasis og inflammation resulterer i en stærk fibrotisk reaktion, der stammer fra de periportale områder. Derfor har kirurgisk ligering af den fælles galdegang blevet den mest anvendte model til at fremkalde obstruktiv kolestatisk skade hos gnavere og undersøge de molekylære og cellulære begivenheder, der ligger til grund for disse patofysiologiske mekanismer fremkaldt af uhensigtsmæssig galde flow. I de senere år har forskellige kirurgiske teknikker blevet beskrevet som enten tillader gentilslutning eller reanastomosis efter galdegang ligering (BDL), fx delvis BDL eller andre mikrokirurgiske metoder til specifikke forskningsspørgsmål. Den hyppigst anvendte model er den komplette obstruktion af den fælles galdegang, der inducerer et stærkt fibrotisk respons efter 21 til 28 dage. Dødeligheden kan være høj på grund af infektiøse komplikationer eller tekniske unøjagtigheder. Her giver vi en detaljeret kirurgisk procedure for BDL model i mus, der inducerer en meget reproducerbar fibrotisk reaktion i overensstemmelse med 3R reglen for dyrevelfærd postuleret af Russel og Burch i 1959.
Lever fibrose er defineret som den overdrevne produktion og akkumulering af ekstracellulær matrix (ECM), der stammer fra et komplekst netværk af interaktioner af matrix-producerende hepatiske stjerneformige celler og en bred vifte af lever-resident og infiltrerende celler blodceller 1,2. Selv leverfibrose kan være forårsaget af en lang række forskellige stimuli de molekylære mekanismer, der ligger fibrose er generelt meget ens. Efter leverskade, er et stærkt orkestreret program af molekylære og cellulære forandringer initieres. I dette program opstår et tæt samspil mellem inflammatoriske signaler, monocytter / makrofager og hepatiske stjerneformige celler, der på de endelige resultater i stjerneformet celle aktivering og transdifferentiering til myofibroblaster, ECM deposition og på hinanden følgende anatomiske og funktionelle ændringer af levervæv integritet 3. Aktivering af hepatiske stjerneformige celler er især drevet af inflammatoriske signaler og interaktioner med leverenresidental makrofager (dvs. Kupffer-celler). Patogen forbundet molekylære mønstre er anerkendt af specialiserede receptorer mønstergenkendelse såsom toll-lignende receptorer, som, når det aktiveres signal gennem et komplekst netværk af forskellige veje, der udløser ekspressionen og sekretionen af et væld af inflammatoriske cytokiner og chemokiner, der driver den inflammatoriske proces 3. Den inflammatoriske reaktion, og det dannede hepatisk insult er kun midlertidig, når sygdommen-producerende faktor fjernes. I modsætning, hvis skaden fortsætter, kronisk inflammation udvikler i leveren og ekspression og akkumulering af ECM skarer i forgrunden resulterer i progressiv substitution af normal leverparenkym af arvævsdannelse.
Da nedsat fibrogenese hos mennesker er et verdensomspændende klinisk problem, har flere eksperimentelle gnavermodeller for akut og kronisk leversvigt blevet etableret i løbet af de seneste årtier. I muRine for eksempel almindelige modeller er administration af en række forskellige hepatotoxins, ligering af den fælles galdegang, induktion af immun-medieret leverskade og målrettet indførelse af gendefekter eller omvendt overekspression af transgener, der påvirker kritisk signalveje, der er involveret i patogenesen af leverfibrose 4.
Ligering af den fælles galdegang hos gnavere er udført som en eksperimentel procedure i forskning i mange år 5-8. En første meget reproducerbar protokol for langvarig galdegang ligation (BDL) i gnavere blev allerede fremlagt nu mere end tre årtier siden 9. I denne protokol både kanylering / obstruktion og ligering inducerede et højt udbytte af skrumpelever i rotter med morfologiske ændringer, der var sammenlignelig med det i human biliær cirrose 9. De respektive protokol er enkel, den kirurgiske procedure er relativt hurtigt umiddelbartOg af overlevelsesprocenten for dyrene er høj med over 95%. I den klassiske rotte kanylering / obstruktion protokollen, er en kort indsnit i 2 cm lavet lige under formet som et sværd proces. Derefter er en kanyle indsat i den proximale del af galdegangen og fikseret i sin position med silkesuturer. I et næste trin er den distale del af kanylen blokeret med 3 knob, ført gennem den nedre ende af midterlinjen indsnit og begravet subkutant i den højre nedre kvadrant 9. Ved afslutningen er maven lukket, og dyrene får lov til at komme sig. I ligering protokol rotterne underkastet dobbelt ligering af den fælles galdegang enten med eller uden dissektion af galdegangen mellem ligaturer 9.
Denne eksperimentelle model er blevet godt modtaget, og anvendes i hele verden i hundredvis af laboratorier til at fremkalde liver kolestase og fibrose. Det inducerer intrahepatisk galde epitelcelleproliferation, myofibroblastisk differentiation portal fibroblaster rundt prolifererende biliære epithelceller, hvilket resulterer i en meget reproducerbar, massiv ekspression og aflejring af ECM 10,11. Derfor er anvendelsen af denne model i rotter og mus er populær blandt forskere, der har til formål at forstå patogenesen af hepatisk inflammation og fibrose.
I vores laboratorium har vi flittigt brugt denne protokol i fortiden hos rotter i flere eksperimentelle undersøgelser har til formål at undersøge særlige molekylære og cellulære aspekter af hepatisk fibrogenese og afprøve nye antifibrotiske begreber og narkotika 12-15.
For nylig har vi tilpasset denne metode til det murine system, og fandt, at galdegang ligation kirurgi er også en attraktiv middel til at etablere tidsafhængig fibrose med lav variation og dødelighed i mus 16-18. På grund af den mindre størrelse af dyrene dog nogle vigtige ændringer med hensyn til anæstesi, kirurgisk interventionention og efterbehandling observation er nødvendige for at få pålidelige og reproducerbare resultater i denne model. Den komplette tilpasning er opsummeret i den følgende protokol og i den ledsagende video dokumentation.
Cholestatisk leverskade er en af de vigtigste kausale faktorer for udvikling af leverfibrose og cirrose i patienter med kronisk leversygdom. Baseret på det faktum, at disse sygdomme producere ubestemmelighed omkostninger sundhedspleje, er det forståeligt, at mange forskere forsøger at forstå de patogene mekanismer igangværende leverfibrose. Derfor har eksperimentelle modeller blevet genereret, der efterligner forskellige aspekter af de komplekse mekanismer, der fører til nedsat inflammation, fibrose og cirrose 1.
Kirurgisk BDL er en af de mest udbredte eksperimentelle modeller, der anvendes til at inducere obstruktiv cholestatisk skade i mus og rotter 4,23,24. I de fleste af de protokoller, der er dyr bedøvet, og en midtersektion laparotomi udføres. Efterfølgende galdegangen afdækket fra bughulen og ligeret to gange ved hjælp af kirurgisk sejlgarn. Som følge heraf er de mus og rotter, der fik denne operation develop en stærk fibrøs reaktion som ved første stammer fra periportale felter 25. I årene er blevet beskrevet flere forskellige kirurgiske teknikker og modifikationer. Særlige procedurer tillader endda gentilslutning eller reanastomosis efter BDL 23. Andre teknikker er baseret på delvis BDL resulterer i betydeligt mindre nekrose dannelse og dermed hepatocytproliferation 24. Delvis BDL i kombination med efterfølgende fjernelse af galdeblæren (kolecystektomi), som forhindrer dannelsen af cholecystitis repræsenterer også en fremragende eksperimentel model for akut cholestase. Det blev foreslået at være en model, der er tættere på den menneskelige situation 24. Og ja, i oprettelsen af denne model, blev det allerede vist, at det reproducerbart forårsager kolestase med kun minimal histologisk vævsskade og undersøger ikke til kronisk kolestase 25. Derfor blev det foreslået, at denne model er ideel til at studere late virkninger af omvendt cholestasis 24. Endnu mere sofistikerede metoder er baseret på mikrokirurgi og tillade en hurtig og reproducerbar måde at påføre kolestatisk leverskade kun i udvalgte dele af leveren 26.
Selv om disse sofistikerede ændringer fra den oprindelige BDL-protokollen har vist sig meget nyttige i at undersøge konkrete forskningsspørgsmål, mange laboratorier verden over grundlæggende sigte på at ansætte den BDL-modellen som en meget reproducerbar og pålidelig model for kolestatisk liver fibrose. Dog kan mange komplikationer forekomme, at væsentlig grad kunne ændre reproducerbarhed og pålideligheden af de resultater, som denne model, hvis tekniske unøjagtigheder ikke undgås. For eksempel blødende komplikationer relateret til skade på blodkarrene ledsager galdegangen (se figur 3 – 4) kan forekomme under eller hurtigt efter operationen. Overdosering af anæstesi med efterfølgende kardiodepression eller respiratory fiasko er også undgåelige komplikationer af proceduren. Alvorlige infektioner, lige fra peritonitis til sepsis, kan forekomme i hele perioden af forsøget, hvis suturerne ikke nøjagtigt udført, og galde lækager i bughulen. Tilskadekomster til tarmen under kirurgi kan også føre til bughindebetændelse. Derfor er det indlysende, at standardiserede protokoller, der er i overensstemmelse med strenge retningslinjer håndtering er stærkt påkrævet. Denne bestemmelse blev også for nylig krævet inden for landene i Den Europæiske Union, som implementeret nye regler for dyrevelfærd i 2013 1. De respektive krav, der er forbundet med denne forordning, er ikke nye og allerede blev foreslået i 1959, da Russell og Burch foreslog en etisk ramme for udførelse af videnskabelige forsøg med dyr, der primært er baseret på en erstatning, forbedring og reducering (3R) princip 27.
Når efter outlined protokol er der kun et par komplikationer, der kan opstå som følge af tekniske unøjagtigheder. Tre specifikke spørgsmål kan opstå i temmelig lav frekvens.
Som med alle kirurgiske procedurer, overdosis af bedøvelsesmiddel er en potentiel kilde til fare for dyr, navnlig i kombination med hypotermi. Hvis kardiovaskulære komplikationer under operationen opstår, bør udbuddet af bedøvelsesmidler stoppes omgående, og operatøren skal forsøge at give mest muligt ilt til musen. Dette kan gøres ved hjælp af en lille plastsprøjte, der er fyldt med luft og pumpes ind i mundingen af Hæmmede dyr. Alternativt brug af en lille Peleusball til ventilation af det angrebne dyr er ofte nyttigt for revitalisering proces.
Problemer i sårheling
Efter BDL operation, kan mus bide deres egne ømme sømme eller de andre dyr. Hvis dette sker, bør respektive mus være særskiltbur. Dyr med åbne sår bør bedøvet området omkring såret forsigtigt steriliseret med en standard antiseptisk, og såret skal syes op igen. I løbet af de næste 3 dage, bør såret af disse dyr skal regelmæssigt (to til tre gange om dagen).
Udspilinger i maven eller dannelse af ascites er vejledende for bakterielle infektioner. Disse kan forekomme på grund af ikke-sterile bearbejdning under operationen. Alle slags infektioner skal håndteres uden undtagelse som en human endepunkt og de berørte dyr bør aflives.
Vi gav en let at følge protokollen, der tillader udførelsen af BDL i mus, der er enkel at implementere og fremkalder kun ringe Dyremortalitet kombineret med en høj reproducerbarhed. Alle kirurgiske protokoller kan hurtigt pågrebet af dygtige forskere. Under den fuldstændige eksperimenteren dyrene holdes på en varmeplade ved 37 ° C og permanent forbundettil et anæstesi-system minimerer smerte og lidelse. For kirurgi, er maven åbnes med en midterlinje laparotomi og galdegangen med dobbelt ligeret uden dissekere den. De repræsentative resultater, der blev diskuteret her viser, at de fænotypiske ændringer i forbindelse med leveren morfologi (inflammation, fibrose, cirrose) er meget reproducerbar og tillade at studere forskellige aspekter af fibrogenese (f.eks., Indledning, inflammation, progression, slutstadiet sygdom) ved definerede tidspunkter.
Vi håber, at resuméet af vores protokol vil bidrage til at forkorte indlæringskurve, der er nødvendig for at kunne etablere denne fibrose model i andre laboratorier og garantere pålidelige og reproducerbare resultater på forskellige lokaliteter. Derved mener vi, at det fremlagte protokol understøtter 3R princip, der skulle af Russell og Burch i 1959 og udgør grundlaget for nye dyrevelfærdsregler, der i øjeblikket gennemføres i mange lande witynd den europæiske referenceramme.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende den økonomiske støtte for den tyske Research Foundation (SFB / TRR57, Q3 og Q2). Forfatterne takker Mareike Schulz, Pascal Paschenda og Klaudia Warzecha for deres hjælp ved udarbejdelsen af fotografier.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
Scotch Tape | commercially available | ||
Tissue paper | commercially available | ||
Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |