Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.
I de flesta ryggradsdjur producerar levern galla som är nödvändig för att emulgera absorberade fetter och möjliggöra nedbrytning av lipider i tunntarmen såväl som att utsöndra bilirubin och andra metaboliska produkter. I levern, den experimentella obstruktion av extrahepatisk biliär systemet initierar en komplex kaskad av patologiska händelser som leder till kolestas och inflammation som resulterar i en stark fibrotisk reaktion härrör från de periportala fälten. Därför har kirurgisk ligering av gallgången blivit den mest använda modellen för att inducera obstruktiv kolestatisk skador hos gnagare och studera de molekylära och cellulära händelser som ligger bakom dessa patofysiologiska mekanismer inducerade av olämpligt gallflöde. Under senare år har olika kirurgiska tekniker beskrivits som antingen tillåter återanslutning eller reanastomosis efter gallgången tion (BDL), t.ex. partiell BDL eller andra mikrometoder för specifika forskningsfrågor. Emellertid är den mest använda modellen för fullständig obstruktion av den gemensamma gallgången som inducerar en stark fibrotisk respons efter 21-28 dagar. Dödligheten kan vara hög på grund av infektiösa komplikationer eller tekniska felaktigheter. Här ger vi en detaljerad kirurgiskt ingrepp för BDL modellen i möss som inducerar en mycket reproducerbar fibrotiskt svar i enlighet med 3R regeln för djurskydd postulerade av Russel och Burch 1959.
Leverfibros definieras som överdriven produktion och ackumulering av extracellulär matrix (ECM) som härstammar från ett komplext nätverk av interaktioner av matrisproducerande lever stellatceller och ett brett utbud av lever bosatt och infiltrerande celler blodkroppar 1,2. Även leverfibros kan orsakas av en mängd olika stimuli de molekylära mekanismerna bakom fibros är generellt mycket lika. Efter leverskada, är en mycket iscensatt program av molekylära och cellulära förändringar initieras. I detta program sker en nära samverkan mellan inflammatoriska signaler, monocyter / makrofager och lever stellatceller att vid slutresultatet i stelcellsaktivering och transdifferentiering till myofibroblaster, ECM nedfall och på varandra följande anatomiska och funktionella förändringar av levervävnad integritet 3. Aktivering av lever stellatceller är särskilt driven av inflammatoriska signaler och interaktioner med leverresidental makrofager (dvs. Kupffer-celler). Patogen associerade molekylära mönster känns igen av specialiserade mönsterigenkänningsreceptorer såsom Toll-liknande receptorer som när den aktiveras signalen genom ett komplext nätverk av olika vägar som utlöser uttryck och sekretion av en mängd inflammatoriska cytokiner och kemokiner som driver den inflammatoriska processen 3. Den inflammatoriska svaret och bildade lever förolämpning är bara tillfälligt när sjukdomen producerande faktorn avlägsnas. Däremot om skadan kvarstår, utvecklas kronisk inflammation i levern och uttrycket och ackumulering av ECM folkmassor i förgrunden vilket resulterar i progressiv substitution av normal leverparenkym av ärrvävnad.
Eftersom lever fibrogenes hos människor är ett globalt kliniskt problem, har flera experimentella gnagarmodeller av akut och kronisk leversvikt etablerats under de senaste decennierna. I MURine system för exempelvis vanliga modeller är administrationen av en mängd olika hepatotoxiner, ligering av gallgången, induktion av immunmedierad leverskada, och målinriktad införandet av gendefekter eller tvärtom överuttryck av transgener som påverkar kritiska signalvägar som är involverade i patogenesen av leverfibros 4.
Ligering av den gemensamma gallgången hos gnagare har utförts som ett experimentellt förfarande i forskning under många år 5-8. En första mycket reproducerbar protokoll för långvarig gallgången tion (BDL) hos gnagare var redan presenterade nu mer än tre decennier sedan 9. I detta protokoll både kanyle / obstruktion och ligering inducerade ett högt utbyte av cirros hos råttor med morfologiska förändringar som var jämförbara med de som observerats hos människa biliär cirros 9. Respektive protokollet är enkel, det kirurgiska ingreppet är relativt snabbt tillämpligtOch överlevnaden hos djuren är höga med över 95%. I den klassiska råttkanyler / obstruktion protokollet, är en kort snitt i 2 cm gjordes strax nedanför xiphoid processen. Därefter görs en kanyl insatt i den proximala delen av gallgången och fixeras i sin position med silkessuturer. I ett nästa steg, är den distala delen av kanylen hindras med tre knutar, satte genom den nedre änden av mittlinjen snitt och begravd subkutant i den högra nedre kvadranten 9. I slutet, är buken stängd och djur får återhämta sig. I ligeringen protokollet råttorna kastades dubbel ligering av den gemensamma gallgången antingen med eller utan dissektion av gallgången mellan ligaturerna 9.
Denna experimentella modell är väl accepterat och används över hela världen i hundratals laboratorier för att framkalla lever kolestas och fibros. Det inducerar intrahepatisk galla epitelcellproliferation, myofibroblastic differentiation portal fibroblaster runt prolifererande gall epitelceller, vilket resulterar i ett mycket reproducerbart, massiva uttryck och deposition av ECM 10,11. Därför är tillämpningen av denna modell på råttor och möss är populär bland forskare som syftar till att förstå patogenesen för leverinflammation och fibros.
I vårt laboratorium har vi flitigt detta protokoll i det förflutna hos råttor i flera experimentella studier som syftar till att undersöka särskilda molekylära och cellulära aspekter av lever fibrogenes och testa nya antifibrotisk koncept och droger 12-15.
Nyligen, anpassade vi denna metod på murinsystemet och fann att gallgången tion kirurgi är också en attraktiv medelvärde att etablera tidsberoende fibros med låg variation och dödlighet hos möss 16-18. På grund av den mindre storleken av djuren, dock några viktiga förändringar när det gäller narkos, kirurgiska intervention och efterbehandling observation är nödvändig för att erhålla tillförlitliga och reproducerbara resultat i denna modell. Den fullständiga anpassning sammanfattas i följande protokoll och i den åtföljande videodokumentation.
Kolestatisk leverskada är en av de viktigaste orsaksfaktorer för utvecklingen av leverfibros och cirros hos patienter med kronisk leversjukdom. Baserat på det faktum att dessa sjukdomar producerar imponderable vårdkostnader, är det begripligt att många forskare försöker förstå de patogena mekanismerna hos pågående leverfibros. Därför har experimentmodeller genererats som efterliknar olika aspekter av de komplexa mekanismer som leder till leverinflammation, fibros och cirros 1.
Kirurgisk BDL är en av de mest utbredda experimentella modeller som används för att framkalla obstruktiv kolestatisk skador hos möss och råttor 4,23,24. I de flesta av de protokoll djuren bedövas och en mittsektion laparotomi utförs. Därefter gallgången avtäckt från bukhålan och ligerades dubbelt med användning kirurgisk garn. Som en följd av de möss och råttor som fått denna operation develop en stark fibrotisk reaktion som vid första härstammar från de periportala fält 25. Under årens lopp har flera olika kirurgiska tekniker och modifieringar har beskrivits. Särskilda rutiner gör att även återanslutning eller reanastomosis efter BDL 23. Andra tekniker är baserade på partiell BDL vilket resulterar i betydligt mindre nekros bildningen och därmed hepatocytproliferation 24. Partiell BDL i kombination med efterföljande avlägsnande av gallblåsan (kolecystektomi) som förhindrar bildning av cholecystit också representerar en utmärkt experimentell modell för akut kolestas. Det föreslogs att vara en modell som ligger närmare den mänskliga situationen 24. Och faktiskt, under upprättandet av denna modell, det var redan visat att den reproducerbart orsakar kolestas med endast minimal histologiska vävnadsskada och inte fortsätta till kronisk kolestas 25. Därför föreslogs det att denna modell är idealisk för att studera late effekter av omvänd kolestas 24. Ännu mer sofistikerade metoder är baserade på mikrokirurgi och möjliggöra en snabb och reproducerbart sätt att orsaka kolestatisk leverskada endast i utvalda delar av levern 26.
Även dessa sofistikerade modifieringar från den ursprungliga BDL-protokollet har visat sig vara mycket användbart för att utreda specifika forskningsfrågor, många laboratorier över hela världen i grunden syftar till att använda den BDL modellen som en mycket reproducerbar och tillförlitlig modell för kolestatisk leverfibros. Däremot kan många komplikationer uppstå som kan väsentligt förändrar reproducerbarhet och tillförlitlighet de resultat som denna modell, om tekniska felaktigheter inte undviks. Till exempel, blödningskomplikationer i samband med skador på blodkärlen som åtföljer gallgången (se figur 3-4) kan uppträda under eller snabbt efter operationen. Överdosering av anestesi med efterföljande cardiodepression eller respiratory misslyckande är också påverkbara komplikationer av förfarandet. Svåra infektioner, alltifrån peritonit till sepsis, kan förekomma under hela perioden av experimentet, om suturerna inte korrekt utfört och galla läcker in i bukhålan. Oavsiktliga skador på tarmen under operationen kan också leda till peritonit. Därför är det självklart att standardiserade protokoll som är i överensstämmelse med strikta riktlinjer hanterings är starkt krävs. Denna bestämmelse har också nyligen krävde inom länderna i Europeiska unionen, som genomförde nya djurskyddsbestämmelser under 2013 1. Respektive krav som är förknippade med denna förordning är inte nya och redan föreslagit 1959, när Russell och Burch föreslog en etisk ramverk för vetenskapliga experiment med djur som främst bygger på en ersättare, förfining och minskning (3R) principen 27.
När man följer outlined-protokollet finns det bara ett fåtal komplikationer som kan uppstå från tekniska felaktigheter. Tre specifika frågor kan uppstå i ganska låg frekvens.
Som med alla kirurgiska ingrepp, är överdos av narkos en potentiell källa till fara för djuren, särskilt i kombination med hypotermi. Om kardiovaskulära komplikationer under operation uppträder bör tillförseln av bedövningsmedel omedelbart avbrytas och operatören ska försöka ge mycket som möjligt syre till musen. Detta kan göras med hjälp av en liten plastspruta som är fylld med luft och pumpas in i mynningen av nedsatt djuret. Alternativt är ofta till hjälp för vitalisering processen användning av en liten Peleusball för ventilation av det drabbade djuret.
Problem i sårläkning
Efter BDL kirurgi, kan möss bita sina egna ömma sömmar eller de av andra djur. Om detta inträffar bör respektive möss vara separatcaged. Djur med öppna sår bör bedövas, regionen runt såret försiktigt steriliseras med en standard antiseptisk, och såret bör sys upp igen. Under de kommande tre dagarna, bör såret av dessa djur inspekteras regelbundet (två till tre gånger om dagen).
Distensions av buken eller bildning av ascites är vägledande för bakterieinfektioner. Dessa kan uppstå på grund av icke-sterila arbetande under operationen. Alla slags infektioner bör hanteras utan undantag som ett humant endpoint och de drabbade djuren ska offras.
Vi gav en lätt att följa protokoll som gör prestanda BDL i möss som är enkel att implementera och väcker bara låg djurdödlighet i kombination med en hög reproducerbarhet. Alla de kirurgiska protokoll kan snabbt uppfattas av skickliga vetenskapsmän. Under hela experimenterande djuren hålls på en värmeplatta vid 37 ° C och permanent anslutnatill ett anestesisystem minimerar smärta och ångest. För operation, är buken öppnas med en mittlinje laparotomi och gallgången dubbel ligerad utan dissekera den. De representativa resultat som diskuterades här visar att de fenotypiska förändringar i fråga om lever morfologi (inflammation, fibros, cirros) är mycket reproducerbar och tillåta att studera olika aspekter av fibrogenes (t.ex.., Initiering, inflammation, progression, slutstadiet sjukdom) vid definierade tidpunkter.
Vi hoppas att sammanfattningen av våra protokoll kommer att bidra till att förkorta inlärningskurva som är nödvändigt för att framgångsrikt etablera denna fibros modell i andra laboratorier och garantera tillförlitliga och reproducerbara resultat på olika platser. Därmed tror vi att den presenterade protokollet stöder 3R-principen som var tänkt från Russell och Burch 1959 och utgör grunden för nya välfärdsregler djur som för närvarande genomförs i många länder witunn den europeiska referensramen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka för det ekonomiska stödet från den tyska Research Foundation (SFB / TRR57, Q3 och Q2). Författarna tackar Mareike Schulz, Pascal Paschenda och Klaudia Warzecha för deras hjälp att förbereda fotografierna.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
Scotch Tape | commercially available | ||
Tissue paper | commercially available | ||
Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |