The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.
Deep Brain Stimulation (DBS) kirurgi, målrettet forskellige områder i hjernen, som den basale ganglier, thalamus, og subthalamisk regioner, er en effektiv behandling for flere bevægelsesforstyrrelser, der ikke har reageret på medicin. Nylige fremskridt inden for DBS kirurgi er begyndt at udvide anvendelsen af denne kirurgisk teknik til andre forhold så forskellige som morbid fedme, depression og obsessiv-kompulsiv sygdom. På trods af disse ekspanderende indikationer, vides der kun lidt om de underliggende fysiologiske mekanismer, som letter de gavnlige virkninger af DBS kirurgi. En metode til dette spørgsmål er at udføre genekspressionsanalyse i neuroner, der modtager den elektriske stimulation. Tidligere undersøgelser har vist, at neurogenese i rotte gyrus dentatus fremkaldes i DBS målretning af den forreste kerne af thalamus 1. DBS kirurgi målretning ATN anvendes bredt til behandling refraktær epilepsi. Det er således af meget interest for os at udforske de transkriptionelle forandringer som følge af elektrisk stimulering af ATN. I dette manuskript, beskriver vi vores metoder til stereotaktisk guidet DBS operation rettet mod ATN hos voksne Wistar rotter. Vi diskuterer også de efterfølgende trin for væv dissektion, RNA isolering, cDNA forberedelse og kvantitativ RT-PCR til måling af genekspression ændringer. Denne metode kunne anvendes og modificeres til at stimulere basalganglierne og andre regioner af hjernen almindeligt klinisk målrettede. Den genekspression undersøgelse beskrevet her antager en kandidat målgen tilgang for at opdage molekylære spillere, der kunne dirigere mekanismen for DBS.
Historien bag udviklingen af Deep Brain Stimulation som neurokirurgisk teknik går tilbage til 1870'erne, hvor muligheden for elektrisk stimulere hjernen kredsløb blev udforsket 2. Brugen af kronisk højfrekvent stimulering som behandling for neuronale lidelser startede i 1960'erne 3. Senere i 1990'erne med fremkomsten af kronisk implantation DBS elektroder 4-6, antallet af neuronale lidelser, der blev behandlet af DBS fortsatte med at stige. Deep Brain Stimulation blev første gang brugt i USA til behandling af essentiel tremor 6. I dag operationen anvendes bredt til behandling af neuronale lidelser, der i øjeblikket uhelbredelige af farmakologisk intervention. DBS er i øjeblikket anvendes til behandling af bevægelsesforstyrrelser på Parkinsons sygdom og dystoni 7-9. Alzheimers demens, Huntingtons sygdom, epilepsi, smerte og neuropsykiatriske sygdomme, såsom depression, OCD, Tourette7; s syndrom og afhængighed er nogle af de betingelser, der er modtagelige for behandling af DBS 10-12. Mens DBS kirurgi er FDA godkendt til behandling af Parkinsons sygdom, dystoni og essentiel tremor, anvendelse af DBS til behandling af andre tilstande, der er nævnt ovenfor, er i forskellige stadier af lab og kliniske studier, der tilbyder meget løfte til patienter 13,14.
Klinisk er DBS operation udføres i to faser. Den første fase omfatter kirurgisk placering af DBS elektroderne på det målrettet anatomiske placering ved hjælp af en kombination af radiologisk positionering, CT, MR samt mikroelektrode aflæsninger for øget præcision. Det andet trin indebærer implantere en impulsgenerator i patientens øvre bryst og installere forlængerledninger fra hovedbunden til impulsgeneratoren. Baseret på den neurologiske tilstand har flere programmering ordninger for impulsgeneratoren blevet standardiseret og vil blive anvendt til at levere den ønskede spænding. Den endelige volTage er nået på en trinvis måde for at modtage den bedste kliniske respons med minimal spænding 15. Men i vores studier, i modsætning til de kroniske DBS implantater anvendes klinisk, for overskuelighedens skyld, har vi tyet til at studere en engangs-højfrekvent stimulering (1 time) i vores dyremodeller.
En del af vores gruppe forskning fokuserer på at undersøge brugen af DBS kirurgi til behandling-resistent epilepsi. Stereotaktisk kirurgiske metoder, der anvender højfrekvent stimulation er blevet undersøgt af mange andre som et effektivt alternativ til behandling af medicinsk refraktær epilepsi, som udgør omkring 30% af alle tilfælde af epilepsi 10,16,17. Cerebellare stimulation målrette kortikale overflade samt de dybe cerebellare kerner er blevet anvendt i fortiden som mål til behandling af epilepsi 10,18,19. Derudover har hippocampus stimulation også været forsøgt, men med blandede resultater 20,21. Nogle af de andre undersøgteDBS mål for epilepsi omfatter cerebral cortex, thalamus, subthalamisk kerne og vagus nerve 8. Men følgende resultater fra flere studier i de seneste par år, har den forreste thalamiske kerne (ATN) vist sig som den mest almindelige DBS mål for epilepsi behandling 10,22. Baseret på viden om neuroanatomiske kredsløb og resultater fra dyremodeller, har flere undersøgelser fokuseret på den terapeutiske virkning af deep brain stimulation af ATN behandling af epilepsi 23-26. ATN er en del af det limbiske kredsløb og er placeret i området af hjernen, der påvirker hyppigheden af anfald. Undersøgelser foretaget af Hamani et al., Har testet effekten af ATN-DBS i en pilocarpin-induceret epilepsi model og fandt, at den bilaterale ATN stimulation forlænget latenstider for pilocarpin-inducerede anfald og status epilepticus 24. Endvidere blev højfrekvent stimulering af ATN sig at reducere hyppigheden af anfald i en pentylentetrazol (PTZ) model af epilepsy 25,27-29. Lee et al., Har rapporteret en gennemsnitlig reduktion i anfaldshyppighed med omkring 75% ved kronisk dyb brain stimulation af ATN i behandling refraktær partiel epilepsi 30.
En nylig klinisk undersøgelse af behandling-resistent epilepsi har vist lovende resultater efter DBS operation rettet mod forreste thalamiske kerne (ATN) 22. En multicenter randomiseret klinisk forsøg med 110 patienter, der gennemgik bilateral DBS for ATN til behandling ildfast epilepsi (SANTE forsøg) viste en nedgang i hyppigheden af anfald med ca. 40% 31. Resultaterne fra denne undersøgelse også antydet på en forsinket optimal antiepileptisk effekt observeret ved 2-3 måneder postoperativt. Yderligere undersøgelser af Toda et al., Bekræftede med disse resultater, hvor de demonstrerede neurogenese sker på et senere tidspunkt post DBS (dage 3-5) i dyremodeller 1. Desuden Encinas et al., Har rapporteret hippocampus neurogenesis i voksne mus gyrus dentatus efter højfrekvent stimulering af ATN 32. Tidligere undersøgelser 33-35 har rapporteret faldende hippocampus neurogenese i visse epileptiske tilfælde som kronisk FLE og en forening med læring underskud, hukommelsessvækkelse og spontane tilbagevendende motoriske anfald. Desuden var der en reduktion i neurale stamceller progenitor faktorer såsom FGF2 og IGF-1 i kronisk epileptiske hippocampus i dyremodeller 33. I betragtning af dette, interventionelle strategier såsom DBS, der viser en forøgelse af neurogenese i den tandede gyrus er spændende muligheder for forskning. Disse resultater har tilskyndet os til at udforske yderligere dybt ind i mekanismen underliggende neurogenese efter DBS behandling for epilepsi. Vi har målrettet den ATN både ensidigt (data ikke rapporteret) samt bilateralt (i repræsentative resultater) og set forhøjede neurotrofin (BDNF) udtryk i rotte gyrus dentatus. Vores cNUVÆRENDE hypotese er, at BDNF udtryk initierer en genekspression kaskade, der kulminerer i neurogenese, der oversætter til den anti-epileptiske virkning DBS kirurgi. I denne artikel præsenterer vi vores metoder til DBS kirurgi målretning ATN hos rotter efterfulgt af genekspression analyse som en attraktiv tilgang til at undersøge den mekanisme, der ligger til grund fordelene ved DBS.
Efter den skelsættende arbejde af Benabid et al. I at bruge deep brain stimulation til behandling af Parkinsons sygdom og essentiel tremor har DBS kirurgiske teknik blevet undersøgt med stor interesse i det seneste årti til at behandle mange neurologiske lidelser 6,10,43. DBS undersøgelser er rettet mod forskellige neuro-anatomiske områder af hjernen kredsløb i øjeblikket udføres af mange grupper til at løfte større neuronale sygdomme og er i forskellige stadier af kliniske forsøg. Stimule…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful for the support of the NREF foundation.
Deep Brain Stimulation Surgery | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
Stereotactic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Drill | Dremmel | 7700, 7.2 V | |
Scalpel | BD | 372610 | |
Ketamine | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | |
Buprenorphine | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
Surgical staples | ConMed Corporation | 8035 | |
Sutures (3-0) | Harvard Apparatus | 72-3333 | |
Syringe (1 ml, 29 1/2 G) | BD | 329464 | Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally |
Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously |
Needles | BD | 305761 | Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes |
Ethanol | Fisher Scientific | S25309B | Use for general sterilization |
Eye Lubricant | Fisher Scientific | 19-898-350 | |
Stimulator | Medtronic | Model 3628 | |
DBS electrodes | Rhodes Medical Instruments, CA | SNEX100x-100mm | Electrodes are platinum, concentric and bipolar |
Betadine (Povidone-Iodine) | PDI | S23125 | Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision |
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
Acrylic Rodent Brain Matrix | Electron Microscopy Sciences | 175-300 | www.emsdiasum.com |
Razor Blade | V W R | 55411-050 | |
Guillotine Scissors | Clauss | 18039 | For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition |
Scissors | Codman Classic | 34-4098 | Use for removing the brain from the skull |
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72957-06 | Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection |
Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
RNA Extraction and cDNA Preparation | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
Tri Reagent | Sigma | T9424 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Use for tissue homogenization |
Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-1 | |
Glycogen | Thermo Scientific | R0561 | |
Dnase I Kit | Ambion | AM1906 | |
Superscript First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 11904-018 | |
Tabletop Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
Quantitative PCR | |||
Reagent/Equipment | Vendor Name | Catalog No. | Comments |
SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | |
Custom Oligos | Invitrogen | 10668051 | |
PCR Plates (96 wells) | Denville Scientific | C18080-10 | |
Optical Adhesive Sheets | Thermo Scientific | AB1170 | |
Nuclease free Water | Thermo Scientific | SH30538-02 | |
Real Time PCR Machine | Applied Biosystems | 7500 |