Abstract
Stimolazione cerebrale profonda (DBS) Chirurgia, mira diverse regioni del cervello, come i gangli basali, talamo, e le regioni subtalamico, è un trattamento efficace per diversi disturbi del movimento che non sono riusciti a rispondere ai farmaci. I recenti progressi nel campo della chirurgia DBS ha iniziato a estendere l'applicazione di questa tecnica chirurgica per altre condizioni diverse come obesità patologica, depressione e disturbo ossessivo compulsivo. Nonostante queste indicazioni in espansione, si sa ancora poco sui meccanismi fisiologici di base che facilitano gli effetti benefici della chirurgia DBS. Un approccio a questa domanda è quello di eseguire analisi di espressione genica nei neuroni che ricevono la stimolazione elettrica. Precedenti studi hanno dimostrato che la neurogenesi nel giro dentato di ratto è suscitato in DBS mira del nucleo anteriore del talamo 1. Chirurgia DBS mira il ATN è ampiamente utilizzato per il trattamento di epilessia refrattaria. E 'quindi di molto interest per noi per esplorare i cambiamenti trascrizionali indotte stimolando elettricamente il ATN. In questo manoscritto, descriviamo le nostre metodologie per la chirurgia DBS stereotassica guidata mira la ATN in adulti ratti maschi Wistar. Discutiamo anche i passi successivi per la dissezione dei tessuti, l'isolamento di RNA, la preparazione cDNA e RT-PCR quantitativa per misurare i cambiamenti di espressione genica. Questo metodo può essere applicato e modificate per stimolare i gangli basali e altre regioni del cervello comunemente clinicamente mirata. Lo studio dell'espressione genica descritto qui assume un approccio del gene bersaglio candidato per scoprire attori molecolari che potrebbero essere dirigere il meccanismo di DBS.
Introduction
La storia dietro lo sviluppo di stimolazione cerebrale profonda come tecnica neurochirurgica risale al 1870, quando è stata esplorata la possibilità di stimolare elettricamente il circuito cerebrale 2. L'uso della stimolazione ad alta frequenza cronica come trattamento per disturbi neuronali iniziato nel 1960 3. Successivamente nel 1990 con l'avvento di impiantazione cronica DBS elettrodi 4-6, il numero di disturbi neuronali che sono stati trattati con DBS continuato ad aumentare. Stimolazione cerebrale profonda è stato utilizzato negli Stati Uniti come trattamento per il tremore essenziale 6. Oggi l'intervento è ampiamente utilizzato per il trattamento di disturbi neuronali che sono attualmente incurabili dall'intervento farmacologico. DBS è attualmente utilizzato per il trattamento di disturbi del movimento del morbo di Parkinson e distonia 7-9. Alzheimer tipo di demenza, la malattia, l'epilessia, il dolore e le malattie neuropsichiatriche come la depressione di Huntington, OCD, Tourette7; s sindrome e la dipendenza sono alcune delle condizioni suscettibili di trattamento con DBS 10-12. Mentre la chirurgia DBS è approvato dalla FDA per il trattamento del morbo di Parkinson, distonia e tremore essenziale, l'utilizzo di DBS per il trattamento di altre condizioni di cui sopra sono in varie fasi di laboratorio e studi clinici che offrono molte promesse ai pazienti 13,14.
Clinicamente, la chirurgia DBS viene eseguita in due fasi. La prima fase consiste chirurgicamente posizionamento degli elettrodi DBS nella posizione anatomica mirata utilizzando una combinazione di posizionamento radiologica, CT, MRI e letture di microelettrodi per una maggiore precisione. La seconda fase prevede l'impianto di un generatore di impulsi nella parte superiore del torace del paziente e l'estensione installazione conduce dal cuoio capelluto al generatore di impulsi. Sulla base della condizione neurologica, diversi schemi di programmazione per il generatore di impulsi sono stati standardizzati e vengono utilizzati per fornire la tensione desiderata. Il vol finaletage viene raggiunta in modo graduale in modo da ricevere la migliore risposta clinica con la minima tensione 15. Tuttavia, nei nostri studi, a differenza degli impianti croniche DBS usato in clinica, per semplicità, si è fatto ricorso a studiare una stimolazione ad alta frequenza di una volta (per 1 ora) nei nostri modelli animali.
Parte della ricerca del nostro gruppo si concentra sullo studio l'uso della chirurgia DBS per il trattamento-refrattaria epilessia. Approcci chirurgici stereotassica con stimolazione ad alta frequenza è stato esplorato da molti altri come un'opzione efficace per il trattamento dell'epilessia medico-refrattario che costituisce circa il 30% di tutti i casi di epilessia 10,16,17. Stimolazione cerebellare mira la superficie corticale, nonché i nuclei profondi del cervelletto sono stati utilizzati in passato come bersagli per il trattamento dell'epilessia 10,18,19. Inoltre, la stimolazione ippocampo è stato anche provato ma con risultati alterni 20,21. Alcuni degli altri indagatiObiettivi DBS per l'epilessia comprendono la corteccia cerebrale, nel talamo, nucleo subtalamico e nervo vago 8. Tuttavia, a seguito dei risultati di diversi studi negli ultimi anni, il nucleo del talamo anteriore (ATN) è emerso come la destinazione più comune DBS per il trattamento dell'epilessia 10,22. Sulla base delle conoscenze su circuiti neuroanatomici e risultati di modelli animali, molti studi si sono concentrati sull'effetto terapeutico di stimolazione cerebrale profonda del ATN nel trattamento dell'epilessia 23-26. La ATN è parte del circuito limbico e si trova nella regione del cervello che colpisce frequenza delle crisi. Gli studi di Hamani et al., Hanno testato l'efficacia di ATN-DBS in un pilocarpina indotta modello di epilessia e ha scoperto che la stimolazione bilaterale ATN latenze per convulsioni pilocarpina indotta e lo stato epilettico prolungato 24. Inoltre, la stimolazione ad alta frequenza della ATN è stato trovato per ridurre la frequenza delle crisi in un pentylenetetrazol (PTZ) il modello di epilepsy 25,27-29. Lee et al., Hanno riportato una riduzione media della frequenza delle crisi di circa il 75% al momento della stimolazione cerebrale profonda cronica della ATN nel trattamento epilessia parziale refrattaria 30.
Un recente studio clinico sul trattamento dell'epilessia refrattaria ha mostrato risultati promettenti dopo l'intervento chirurgico DBS rivolte al nucleo talamico anteriore (ATN) 22. Uno studio clinico multicentrico randomizzato con 110 pazienti sottoposti a DBS bilaterale del ATN per il trattamento dell'epilessia refrattaria (prova SANTE) ha indicato una diminuzione della frequenza delle crisi di circa il 40% 31. I risultati di questo studio ha anche accennato a un effetto anti-epilettico ottimale ritardo osservato 2-3 mesi dopo l'intervento chirurgico. Ulteriori studi di Toda et al., Corroborate con questi risultati in cui hanno dimostrato neurogenesi accadendo in un momento post successivo DBS (giorni 3-5) in modelli animali 1. Inoltre, Encinas et al., Hanno riportato neurogena hippocampalsis nel topo adulto giro dentato dopo stimolazione ad alta frequenza della ATN 32. Precedenti studi hanno segnalato in calo 33-35 neurogenesi ippocampale in alcuni casi di epilessia come l'epilessia del lobo temporale cronica e un'associazione con deficit di apprendimento, disturbi della memoria e spontanee crisi motorie ricorrenti. Inoltre, c'è stata una riduzione in fattori neurali progenitrici di cellule staminali, come FGF2 e IGF-1 nell'ippocampo cronicamente epilettico in modelli animali 33. Considerando questo, strategie di intervento come la DBS che mostrano un aumento della neurogenesi nel giro dentato sono strade interessanti per la ricerca. Questi risultati ci hanno incoraggiato a esplorare ulteriormente in profondità nel meccanismo sottostante trattamento neurogenesi post-DBS per l'epilessia. Abbiamo preso di mira il ATN sia unilateralmente (dati non riportati) e bilaterale (in risultati rappresentativi) e visto elevati neurotrofina (BDNF) espressione del giro dentato di ratto. Il nostro corrente ipotesi è che l'espressione di BDNF avvia una cascata di espressione genica che culmina in neurogenesi che traduce l'effetto anti-epilettico di chirurgia DBS. In questo articolo presentiamo i nostri metodi per la chirurgia DBS mira la ATN nei ratti seguita da analisi di espressione genica come approccio interessante per studiare il meccanismo alla base dei benefici di DBS.
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Protocol
NOTA: Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le linee guida NIH per la ricerca animale (Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio) e sono approvati dalla Scuola Medica Comitato IACUC Harvard.
Preparazione 1. Pre-chirurgica
- Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave sia o la pulizia con soluzione antisettica e / o etanolo, se necessario. Se possibile, utilizzare materiale monouso sterile come bisturi, aghi e siringhe.
- Coprire il banco di lavoro con teli chirurgici e garantire che vi sia un rischio biologico di smaltimento disponibili.
- Pesare il ratto e calcolare la dose di anestesia. Utilizzare un / Xilazina mix Ketamina (ketamina 75 mg / kg e Xilazina 10 mg / kg), per anestetizzare i topi.
NOTA: Tra 200-250 g è il peso ottimale per il corretto fissaggio dell'animale nel telaio stereotassico nonché per il targeting accurata della ATN. Isoflurane può essere utilizzato anche come agente anestetizzante. - Supporto e bloccare due elettrodi sterili (sterilizzato in autoclave o con ossido di etilene) sul supporto per elettrodi (Figura 2) di un telaio stereotassico chirurgica e con l'aiuto di un microscopio (10-40X ingrandimenti), ispezionare le punte dell'elettrodo per una corretta allineamento. Fissare i due elettrodi 3,0 millimetri di distanza.
NOTA: Fare attenzione a non danneggiare l'elettrodo toccando superfici dure.
2. DBS Chirurgia
- Iniettare la ketamina / Xilazina mix intraperitoneale all'animale e confermare che l'animale ha raggiunto un piano chirurgica di anestesia (controllando per la reflex toe-pizzico, la frequenza respiratoria e la profondità e la regolarità della respirazione). Rimuovere capelli dalla regione del cuoio capelluto che verrà incisa e disinfettare il cuoio capelluto con 3 scrub alternati ciascuno di betadine e alcole o soluzione fisiologica sterile. Sicuro e posizionare l'animale sul fram stereotassicae.
- Usa circolano pastiglie di acqua calda per mantenere la temperatura del corpo dell'animale ad un livello ottimale. Applicare il lubrificante occhio agli occhi dell'animale per proteggere dalla overdrying.
- Utilizzare i seguenti coordinate stereotassica per mira il ATN (anteriore nucleo del talamo): anterioposterior -1.6 mm, mediolaterale 1,5 mm dorsoventrale 5,2 millimetri 1.
NOTA: Le coordinate stereotassica si basano sulla Paxinos e Watson (6 ° edizione) Rat Brain atlas 36. - Fare un'incisione nel cuoio capelluto sagittalmente per rivelare il cranio. Utilizzando un paio di divaricatori fissare il cuoio inciso per esporre il cranio. Utilizzare soluzione salina sterile per irrigare l'incisione. Se incisione è troppo bagnato, usare tamponi di cotone sterili ad asciugare. Individuare il bregma e segnare con un pennarello nero. Per guidare la posizione dei fori di bave, rendono più due marchi in approssimativamente di 1,5 mm mediolaterally su entrambi i lati dalla sutura sagittale e 1,6 mm posteriormente al coronal sutura.
- Utilizzare un trapano a mano per fare i buchi bave. Assicurarsi che la punta del foro bava è sterile mediante sterilizzazione con etanolo. Tenere il trapano a circa 45 ° rispetto alla superficie del cranio durante la foratura. Cambiare spesso tra i due fori bave per evitare eccessivo calore nella posizione di qualsiasi foro cranico.
- Continuare fino a quando la perforazione dura è esposto. Utilizzando un ago con la punta piegata simile forma di 'L', rimuovere eventuali frammenti di osso che impedirebbero l'inserimento dell'elettrodo. Fare attenzione a non danneggiare la dura e / o cerebrale sottostante tessuto durante la rimozione di frammenti ossei utilizzando l'ago piegato.
NOTA: Utilizzando un ago smussato o pinza sottile contundenti è anche un'opzione. - Fissare il gruppo doppio elettrodo al manico girevole del telaio stereotassico e fissare il manico con un angolo di 90 °. Utilizzando le regolazioni del telaio stereotassico, posizionare l'elettrodo sinistra esattamente sopra il bregma.
- Utilizzando lo stereorettifiche tattiche di posizionamento mediolaterale, muovono precisamente l'elettrodo sinistra da 1,5 mm per il lato sinistro del bregma tale che vi sono due elettrodi perfettamente allineati lungo la sutura coronale ma distanziate a 1,5 millimetri mediolaterally dal bregma.
- Utilizzando le regolazioni stereotassica anterioposterior, spostare gli elettrodi 1,6 millimetri posteriormente al sutura coronale.
- Utilizzare le regolazioni dorsoventrale per abbassare gli elettrodi al primo controllo se i fori bave sono state effettuate nella posizione giusta in modo che gli elettrodi possono essere inseriti con facilità, senza toccare gli spigoli dei fori bave. Se è così, inserire gli elettrodi ad una profondità di 5,2 mm dalla superficie del cranio.
- Collegare gli elettrodi tramite porta ad uno stimolatore fissato a 130 Hz, 2,5 V e 90 msec pulsewidth 1.
- Invia stimolazione ad alta frequenza per un'ora (o per un periodo di tempo desiderato secondo apparato sperimentale). Nel corso della stimolazione, ricordarsi di assicurare proper profondità dell'anestesia regolarmente controllando l'assenza di recesso piede in risposta ad una presa punta. Supplemento anestesia con circa metà della dose iniziale usato per indurre anestesia. Evitare la contaminazione dei tuoi guanti sterili durante il controllo profondità dell'anestesia e modificarle, se necessario. Eseguire la stimolazione unilaterale o bilaterale in base alle esigenze sperimentali di uno. Includere controlli come la stimolazione a bassa frequenza (per es., 10 Hz) e gli animali non stimolate (inserimento elettrodi senza stimolazione successiva).
- Dopo la stimolazione è fatto, rimuovere con attenzione gli elettrodi e suturare l'incisione con 3-0 punti di sutura o con punti chirurgici sterili.
- Somministrare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea in analgesia. Monitorare l'animale fino a tornare alla normale attività e poi tornare alla struttura alloggiativa.
- Dopo un periodo di tempo sulla base del disegno sperimentale (per esempio, 0, 3, 6 o 12 ore dopo l'intervento chirurgico DBS), Eutanasia l'animale con overdose anestesia. Dopo aver confermato l'assenza di segni vitali, decapitare il animali.
- Sezionare il cervello prima di rimuovere la pelle con le forbici. Tagliare l'osso lungo la sutura sagittale con le forbici dissezione. Effettuare altre due incisioni (circa un pollice ciascuna) attraverso l'osso su entrambi i lati laterali. Utilizzando pinze, sollevare il pezzo di osso parzialmente reciso dalla sommità del cranio per esporre il cervello.
- Utilizzando forbici o pinze sottili, staccare il cervello dal cranio e trasferire ad una capsula di Petri con PBS freddo sul ghiaccio.
NOTA: Fare attenzione per evitare danni al cervello rendendo le incisioni attraverso l'osso.
3. Hippocampus Isolation
NOTA: Eseguire tutte le fasi successive di questa sezione sul ghiaccio.
- Posizionare il cervello su una matrice acrilica cerebrale pre-raffreddata in ghiaccio. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il cervello coronale a circa 7-8 mm dal antero-più edge del cervello. Fare un secondo taglio coronale e posteriore per il primo taglio in modo tale che una fetta cervello di circa 5 mm di spessore può essere rimosso.
- Trasferire la fetta cervello di una capsula di Petri con PBS freddo. Utilizzando lama di rasoio, tagliare le due sezioni emisferiche e prendersi cura notare che emisfero corrisponde, rispettivamente, ai lati sinistro e destro. Questo è particolarmente importante durante l'esecuzione stimolazioni unilaterali.
- Utilizzando una pinza sottile e forbici rimuovere con attenzione l'ippocampo.
- Flash congelare il tessuto dell'ippocampo in ghiaccio secco e conservare in freezer a -20 ° C fino al momento per le fasi di estrazione RNA successive.
NOTA: Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di conservare il tessuto in una -80 ° C freezer.
4. RNA Estrazione e PCR quantitativa
- Assicurarsi che il tessuto rimane congelato in ghiaccio secco fino al momento omogeneizzazione.
- NOTA: Eseguire questo passaggio nella cappa.
- Aggiungere 1 ml di Tri reagente Hipptessuto ocampal in una provetta da centrifuga da 1,5 ml ed omogeneizzare dal primo pipettaggio più volte fino a quando il tessuto è rotto in pezzi più piccoli. Ulteriori omogeneizzare il tessuto passando attraverso una siringa con un ago 25 G fino a quando nessun tessuto ininterrotta visibile. Eseguire le operazioni di omogeneizzazione sul ghiaccio.
- Dopo omogeneizzazione del tessuto, permette la sospensione cellulare a riposare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la lisi cellulare.
NOTA: Dopo questo punto la sospensione cellulare può essere veloce congelate e conservate a -70 ° C fino ad ulteriore lavorazione.
- Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare nel vortex per 20 secondi e lasciare la soluzione riposo a temperatura ambiente per 15 min.
- Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i tubi senza disturbare i tre strati separati che saranno visibili.
NOTA: La fase (rosso) in basso contiene proteine, mezzo fase nuvoloso contiene DNA e la fase superiore libero contiene RN / A. - Trasferire il top fase chiaro (RNA) in un nuovo 1,5 ml tubo da centrifuga (tipicamente 500 ml di RNA contenente fase si ottiene). Per questo aggiungere 0,5 ml di isopropanolo e mescolare nel vortex. A questo si aggiunge 2-3 glicogeno microlitri (20 mg / ml) come vettore per l'RNA. Lasciare il campione a riposo sul tavolo a temperatura ambiente per 10 min.
- Centrifugare il campione a 12.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Assicurarsi che il pellet di RNA è visibile nella parte inferiore del tubo.
- Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA aggiungendo 1 ml di etanolo al 75% (a base di acqua priva di nucleasi). Invertire le più volte campione finché il pellet dislodges dal fondo del tubo e galleggia nella soluzione. Centrifugare la soluzione a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C.
NOTA: Il precipitato in 75% etanolo può essere conservato a -20 ° C fino ulteriori passi. - Consentire il pellet di RNA asciugare lasciando le provette aperte per 5 min a temperatura ambiente. Prendere precauzioni per evitare over essiccazione del pellet in quanto questo potrebbe compromettere la dissoluzione in acqua nel passaggio successivo.
5. Rimozione DNA dal RNA Preparazione
- Aggiungere 9 ml di acqua priva di nucleasi al pellet di RNA e assicurarsi che il pellet viene sciolto prima di procedere vortex delicatamente il tubo. Per questo aggiungere 1 ml di 10x DNasi I Buffer e 1 ml DNasi ricombinante (da DNase kit I), mescolare delicatamente sfogliando i tubi, brevemente girare i tubi e incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per 30 minuti.
- Aggiungere 2 ml di reagente inattivazione DNasi (da DNasi kit I) al campione e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti e mescolare spesso muovendo delicatamente il tubo. Centrifugare a 12.000 xg per 10 minuti e il trasferimento di circa 10 ml di surnatante limpido di un nuovo 1,5 ml provetta da centrifuga.
- Misurare la concentrazione di RNA con un NanoDrop o spettrofotometro.
6. Fare cDNA da RNA
- Aggiungi th volumi richiestiin contiene 1 mg di RNA e portare il volume totale a 8 microlitri aggiungendo acqua priva di nucleasi. Per questo aggiungere dNTP 1 ml 10 mM mix e 1 ml di esameri casuali dal Kit Apice First Strand Synthesis. Mescolare delicatamente e incubare a 65 ° C per 5 minuti in una vasca di acqua o in un termociclatore pre-programmato.
- Fare un premiscelato contenente i seguenti reagenti: 2 ml di 10x RT Buffer, 4 ml di 25 M MgCl 2, 2 ml di 0,1 M DTT e 1 ml di RNAsi OUT (40 U / ml).
NOTA: I volumi indicati sono per reazione, l'utente avrebbe bisogno di scalare fino in base alle proprie esigenze sperimentali. - Dopo aver rimosso l'RNA contenente campioni da 65 ° C, impostare il tubo a temperatura ambiente per un minuto. Aggiungere la soluzione prediluita 9 ml e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Aggiungere 1 ml di Superscript II enzima trascrittasi inversa (50 U / mL) e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Incubare i campioni a 42 ° C per 50min per la trascrizione inversa a verificarsi.
- Incubare i campioni a 70 ° C per 15 minuti per terminare la reazione.
- Mettere i campioni in ghiaccio brevemente e aggiungere 1 ml RNaseH (2 U / ml) e incubare a 37 ° C per 20 min.
- Brevemente centrifugare le provette a 3000 xg per centrifugare il liquido di condensa.
NOTA: Questo è il cDNA che verrà utilizzato per la PCR quantitativa. cDNA può essere conservato in congelatore a -20 ° C finché configurazione PCR. cDNA può essere diluito con acqua priva di nucleasi prima di procedere alla PCR.
7. PCR quantitativa
- Fai un master mix contenente i seguenti reagenti (i volumi indicati sono per reazione): 6.3 ml di 2x Sybr verde Mix, 0,6 ml di Forward Primer (10 micron), 0,6 ml di Reverse Primer (10 micron) e 0,5 ml di acqua priva di nucleasi .
NOTA: il design Primer è stato fatto con il 'pick Primer' opzione nella pagina di sequenza nucleotidica del NCBI per il gene di interesse. - Aggiungere 10 microlitri mastermix a ciascun pozzetto di una piastra PCR 96 ben. Aggiungere 2,5 ml di cDNA fatte in precedenza per il pozzetto contenente il Mastermix. Assicurati di impostare reazioni PCR in triplicato per ogni campione.
- Dopo aver completato l'aggiunta di mastermix e cDNA, coprire la piastra PCR utilizzando un foglio adesivo ottico per sigillare i pozzetti. Spin brevemente la piastra per 5 minuti a 500 xg in una centrifuga da tavolo per risolvere tutto il liquido sul fondo del pozzo.
- Caricare la piastra PCR su una macchina di RT-PCR pre-programmato. Utilizzare i parametri PCR di cui alla tabella 1.
- Analisi dei dati: Utilizzare i valori C t dall'uscita qPCR per ulteriori calcoli. Insieme con il gene di prova, impostare reazioni PCR per i geni di controllo interno, 18S rRNA (garantire parità di ingresso) e β-actina (controllo negativo). Calcola modifiche piega secondari di ΔΔCt 37.
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Representative Results
Le figure 1A e 1B mostrano la relativa espressione di BDNF e GABRD rispetto al gene di controllo β-actina. BDNF, una neurotrofina è spesso associata a effetti neuroprotettivi in molte malattie neuronali 38-41. È quindi interessante analizzare il profilo di espressione di BDNF in risposta alla stimolazione della ATN che produce benefici terapeutici per pazienti epilettici. Nella figura 1A che mostra il profilo di espressione genica del BDNF attraverso i punti temporali indicati postare stimolazione DBS, BDNF up-regulation si osserva immediatamente (0 ore) dopo l'intervento chirurgico DBS con l'espressione di picco (3 volte maggiore di non stimolato) a 3 ore stimolazione posta. Questa osservazione suggerisce che l'espressione BDNF rafforzata e la neuroprotezione risultante potrebbe contribuire al beneficio terapeutico di DBS. Un'altra GABRD gene (Figura 1B) è stato anche studiato con il metodo qPCR. GABRD è un WHI recettore GABAch è uno dei potenziali bersagli per la progettazione di farmaci anti-epilessia 42. Il profilo di espressione di GABRD mostra anche una maggiore espressione in animali stimolati rispetto agli animali di controllo non stimolate a 3 ore post-DBS. Considerando che agonisti GABA sono usate come soppressori sequestro efficaci, è interessante osservare una maggiore GABRD post espressione DBS, implicando un possibile ruolo per GABA nella effetto anti-epilettico di DBS.
Il protocollo RT-PCR descritto produce risultati riproducibili e quantitativi che rivelano modelli di espressione genica e le differenze volte rispetto rispetto agli animali di controllo. L'analisi dei dati viene eseguita nel seguente modo: L'uscita qPCR fornisce il valore di soglia t C per il gene di prova per ciascun campione analizzato. I valori t C si ottengono anche per il gene di controllo β-actina e 18S rRNA (controllo di ingresso). Il metodo t ΔΔC sarà poi utilizzato per calcolare la expr geneProfilo ESSIONE utilizzando questi valori C t 37. Ad esempio, per calcolare le variazioni di espressione genica di BDNF, per un dato campione, la differenza tra il valore t C per BDNF e 18S rRNA è calcolata ed è il primo ΔC t. Per lo stesso campione, la differenza tra il valore t C per β-actina e 18S rRNA è calcolato per ottenere il secondo ΔC t. La differenza tra i due valori ΔC t è calcolata a dare ΔΔC t. Questo valore t ΔΔC viene utilizzato per calcolare 2 ^ (-ΔΔC t) che dà l'abbondanza relativa template per BDNF rispetto al β-actina. Tracciando questo valore tra i diversi punti temporali lungo il controllo non stimolato, i cambiamenti di espressione genica indotte dalla DBS attraverso punti temporali possono essere visualizzati. Il metodo sopra descritto potrebbe essere utilizzato in modo efficace per studiare i cambiamenti nell'espressione di altri geni che sono potenziali candidAtes che sono sensibili alla stimolazione DBS e per indagare alcuni degli effetti a valle di modulare l'espressione di questi geni.
Figura 1: (A) Tempo un'analisi corso di BDNF in risposta alla stimolazione ad alta frequenza del ATN. La raccolta dei tessuti, l'estrazione di RNA, la preparazione cDNA e q-PCR sono state eseguite come descritto nel protocollo. Cambiamenti relativi nell'espressione genica sono calcolati dopo aver normalizzato per l'ingresso (amplificando 18S rRNA) e un gene di controllo (β-actina). Valori t C ottenuti dal real-time PCR sono stati utilizzati per calcolare i livelli di espressione con il metodo t ΔΔ C 37. I punti temporali analizzati sono 0, 3, 6 e 12 ore dopo la stimolazione DBS. Nota: I punti temporali selezionati qui sono in relazione ad un particolare studio e sono soggette a modifiche in base alla hypothesis e piano sperimentale. (B) Tempo di analisi corso di GABA A subunità delta del recettore (GABRD) i livelli in risposta alla DBS a 130 Hz mira il ATN. Metodi e calcoli sono stati fatti come simile ai dati BDNF.
Figura 2: elettrodi DBS e stimolatore impostati.
| Cicli PCR | |||
| Fase 1: | Denaturazione iniziale | 95 ° C | 15 min |
| Fase 2: | Denaturazione | 95 ° C | 15 sec |
| Ricottura | 60 ° C | 30 sec | |
| Estensione | 72 ° C | 30 sec | |
| 40 cicli di Fase 2 | |||
| Nota: La temperatura di ricottura varia secondo la | |||
| temperatura di fusione primer. Primer sono in genere progettati | |||
| avere una temperatura di ricottura ottimale di 60 ° C | |||
Tabella 1: Parametri PCR.
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Discussion
Dopo il lavoro di riferimento per Benabid et al. Utilizzando la stimolazione cerebrale profonda per il trattamento di malattia di Parkinson e tremore essenziale, la tecnica chirurgica DBS è stata studiata con molto interesse negli ultimi dieci anni per il trattamento di molti disturbi neurologici 6,10,43. Studi DBS rivolti varie regioni neuro-anatomica del circuito cerebrale sono attualmente svolte da molti gruppi per affrontare le principali malattie neuronali e sono in varie fasi di sperimentazione clinica. La stimolazione del nucleo subtalamico (STN) o il segmento interna del globo pallido (GPI) è approvato dalla FDA e utilizzato nel trattamento di disturbi del movimento nella malattia di Parkinson 10. La sperimentazione clinica SANTE ha mostrato tendenze promettenti per i pazienti epilettici in trattamento ad alta stimolazione frequenza anteriore nucleo talamo 31. I risultati di uno studio clinico di fase I di stimolazione forniceal bilaterali hanno mostrato un ritardo nel tasso di declino cognitivo e un reversale della captazione del glucosio ipometabolico visto nella malattia di Alzheimer e l'attivazione dei circuiti di memoria 8,44. Inoltre, negli ultimi anni, i neurochirurghi hanno condotto studi di DBS per il trattamento di disturbi neuropsichiatrici come la OCD (disturbo ossessivo-compulsivo), depressione resistente al trattamento, la sindrome di Tourette e la dipendenza 10,45-55.
Oltre alle prove cliniche, negli ultimi anni, la chirurgia animale ci ha offerto grandi opportunità per studiare i cambiamenti fisiologici indotti dalla tecnica chirurgica in un animale vivo, in maniera ineguagliabile con qualsiasi tecnica in vitro. In questo manoscritto, abbiamo discusso i metodi usati per eseguire un intervento chirurgico di stimolazione cerebrale profonda nei roditori. Radiochirurgia stereotassica in roditori come qui descritto potrebbe essere utilizzato anche per potenziali DBS ricerche bersaglio e per testare l'efficacia della chirurgia utilizzando modelli animali di malattia. Una delle sfide per lo sperimentatore here è di essere in grado di indirizzare il locus anatomico corretto in modo riproducibile. È soprattutto la necessità di un tecnico specializzato per l'intervento chirurgico perché controllando il targeting corretta è possibile solo dopo la stimolazione è fatto e l'animale eutanasia. Inoltre, occasionalmente, si potrebbe accidentalmente danneggiare un vaso sanguigno chiave che potrebbe portare a una significativa perdita di sangue e talvolta anche la morte dell'animale. Inoltre, la necessità di sezionare l'ippocampo per ulteriori analisi biochimica limita la possibilità di verifica immunoistologico per dell'elettrodo rivolti nella stessa animale che necessita di un campione cerebrali intatte per sezionamento tessuto. Elettrodo corretta mirati potrebbe essere controllata su un animale diverso stimolato in modo identico. Tuttavia, questo non fornisce una prova per il targeting corretta nella prova animale e un limite di questo approccio. Recenti pubblicazioni hanno cercato di aggirare questo problema effettuando un intervento chirurgico DBS con simultaneous fMRI 56. Un possibile miglioramento della tecnica qui descritta potrebbe essere uno studio sugli effetti della stimolazione cronica con uno stimolatore impiantato nell'animale. Tuttavia, abbiamo limitato la nostra analisi per una singola dose (1 ora) della stimolazione ad alta frequenza come il primo passo per comprendere le variazioni indotte da DBS a livello cellulare.
Considerando l'uso della chirurgia DBS per una varietà di disturbi neuronali, è essenziale che conosciamo il meccanismo sottostante gli effetti benefici di DBS. Questa informazione è fondamentale per lo sviluppo di futuri miglioramenti nella chirurgia e anche per esplorare l'utilità di DBS come trattamento per altre condizioni che non sono stati indagati da esperti in DBS. Inoltre, le modifiche alla tecnica chirurgica possono essere implementate per evitare certe deleteri effetti collaterali della procedura e per affrontare efficacemente ricorrenza della condizione di malattia.
Un meccanicistico ana approfonditalisi di DBS è possibile esaminando i cambiamenti di espressione genica indotte dalla DBS. O un approccio del gene candidato basate sulle attuali conoscenze su percorsi neuronali che rispondono a stimoli depolarizzanti come la stimolazione ad alta frequenza, o un analisi del trascrittoma globale può dare importanti informazioni gli eventi molecolari innescati da DBS. Le tecniche di analisi di espressione genica (candidate gene approccio e metodo high-throughput) sono strumenti potenti che sono fondamentali per esplorare i meccanismi molecolari e cambiamenti cellulari associati alla chirurgia DBS. I recenti sviluppi in questo settore hanno reso possibile per noi per ottenere una ricchezza di informazioni su diversi aspetti della fisiologia cellulare in un tempo molto breve, che non era possibile a pochi anni fa. Con l'avvento della tecnologia sequenziamento rendimento come ChIPseq, è possibile caratterizzare la posizione genoma a livello di importanti fattori di trascrizione che rispondono alle DBS 57,58. Le recenti scoperte di collegamento non-coding RNA quali microRNA con malattie neurodegenerative, ci permettono di analizzare i possibili cambiamenti nei livelli di miRNA nei neuroni post-DBS con miRNA tecnologia di sequenziamento 59,60. Eventuali cambiamenti nelle firme epigenetiche quali DNA metilazione e istoni modifiche in risposta a DBS potrebbero anche essere esplorate. Tuttavia, nonostante i vantaggi, è importante riconoscere alcune delle limitazioni di queste tecniche e potenziali problemi che possono sorgere durante analisi. Una preoccupazione importante con l'espressione genica analisi è stata la riproducibilità e errori tecnici. È importante che lo sperimentatore prende atto e prevede di dover adeguato numero di ripetizioni per assicurare l'affidabilità. Un problema comune con alcuni degli studi di screening ad alta produttività è stata la difficoltà nella interpretazione della enorme quantità di dati che viene generato. A volte diventa importante determinare se i cambiamenti di espressione genica osservati sono dovuti all'effetto direttadel trattamento sperimentale o è un effetto a valle. Questo di solito richiede ulteriori studi che sono stati progettati per risolvere questo problema.
Oltre agli studi di genomica, un'ampia analisi immunoistochimica della localizzazione spazio-temporale dei principali attori che rispondono alla DBS e una quantificazione dei cambiamenti nei loro livelli nelle diverse regioni del cervello sarà una grande risorsa per i futuri sviluppi della DBS procedura chirurgica. I risultati cumulativi dovuti espressione genica analisi nonché gli studi immunoistochimici possono rivelare nuove interazioni tra fattori chiave così come eventi molecolari chiave che regolano processi cellulari quali neurogenesi o neurodegenerazione. L'identificazione di tali marcatori molecolari critici può anche consentire future scoperte di droga. Tali scoperte potrebbero far luce sul funzionamento generale del circuito cerebrale, che è informazioni preziose dal punto di vista di scienziati che lavorano per capire l'uomomalattie neuronali y. Direzione nostri sforzi futuri sull'integrazione ultimi progressi tecnologici compiuti nella clinica e il laboratorio può offrirci vantaggi sostanziali nella nostra lotta contro la malattia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Deep Brain Stimulation Surgery | |||
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Drill | Dremmel | 7700, 7.2 V | |
| Scalpel | BD | 372610 | |
| Ketamine | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
| Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | |
| Buprenorphine | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules |
| Surgical staples | ConMed Corporation | 8035 | |
| Sutures (3-0) | Harvard Apparatus | 72-3333 | |
| Syringe (1 ml, 29 1/2 G) | BD | 329464 | Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally |
| Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously |
| Needles | BD | 305761 | Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes |
| Ethanol | Fisher Scientific | S25309B | Use for general sterilization |
| Eye Lubricant | Fisher Scientific | 19-898-350 | |
| Stimulator | Medtronic | Model 3628 | |
| DBS electrodes | Rhodes Medical Instruments, CA | SNEX100x-100 mm | Electrodes are platinum, concentric and bipolar |
| Betadine (Povidone-Iodine) | PDI | S23125 | Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision |
| Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation | |||
| Acrylic Rodent Brain Matrix | Electron Microscopy Sciences | 175-300 | www.emsdiasum.com |
| Razor Blade | V W R | 55411-050 | |
| Guillotine Scissors | Clauss | 18039 | For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition |
| Scissors | Codman Classic | 34-4098 | Use for removing the brain from the skull |
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72957-06 | Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| RNA Extraction and cDNA Preparation | |||
| Tri Reagent | Sigma | T9424 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
| Syringe (3 ml, 25 G) | BD | 309570 | Use for tissue homogenization |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416-1 | |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0561 | |
| Dnase I Kit | Ambion | AM1906 | |
| Superscript First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 11904-018 | |
| Tabletop Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Quantitative PCR | |||
| SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | |
| Custom Oligos | Invitrogen | 10668051 | |
| PCR Plates (96 wells) | Denville Scientific | C18080-10 | |
| Optical Adhesive Sheets | Thermo Scientific | AB1170 | |
| Nuclease free Water | Thermo Scientific | SH30538-02 | |
| Real Time PCR Machine | Applied Biosystems | 7500 |
References
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