Analys av genuttryck Förändringar i Rat Hippocampus Efter Deep Brain Stimulation av Anterior Thalamic Nucleus

Summary

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Abstract

Djup hjärnstimulering (DBS) kirurgi, med inriktning olika regioner i hjärnan som de basala ganglierna, thalamus och subtalamiska regioner, är en effektiv behandling för flera rörelsestörningar som inte har lyckats svara på medicinering. Senaste framstegen inom området för DBS kirurgi har börjat utvidga tillämpningen av denna kirurgisk teknik till andra villkor så olika som sjuklig fetma, depression och tvångssyndrom. Trots dessa expanderande indikationer, är lite känt om de underliggande fysiologiska mekanismer som underlättar de gynnsamma effekterna av DBS kirurgi. Ett sätt på denna fråga är att utföra genuttrycksanalys i nervceller som tar emot den elektriska stimuleringen. Tidigare studier har visat att neurogenes i råtta gyrus dentatus framkallas i DBS inriktning av den främre kärnan i thalamus ^1. DBS kirurgi med inriktning på ATN används i stor utsträckning för behandling refraktär epilepsi. Det är därför av mycket interest för oss att utforska de transkription förändringar som induceras av elektriskt stimulera ATN. I detta manuskript, beskriver vi våra metoder för stereotaktiskt guidad DBS kirurgi med inriktning på ATN hos vuxna Wistar råttor. Vi diskuterar också de efterföljande stegen för vävnads dissektion, RNA isolering, cDNA förberedelse och kvantitativ RT-PCR för att mäta genuttryck förändringar. Denna metod skulle kunna tillämpas och ändras för att stimulera de basala ganglierna och andra regioner i hjärnan som vanligen kliniskt inriktade. Den genuttryck studie beskrivs här förutsätter en kandidat målgen tillvägagångssätt för att upptäcka molekylära spelare som kan styra mekanismen för DBS.

Introduction

Historien bakom utvecklingen av Deep Brain Stimulation som en neurokirurgisk teknik går tillbaka till 1870-talet då möjligheten att elektriskt stimulera hjärnan kretsar undersöktes ^2. Användningen av kronisk högfrekvent stimulering som behandling för neuronala sjukdomar startade under 1960-talet ^3. Senare under 1990-talet med tillkomsten av kronisk implantation DBS elektroder ^4-6, antalet neuronala sjukdomar som behandlades av DBS fortsatt att öka. Deep Brain Stimulation användes först i USA som en behandling av essentiell tremor ^6. Idag operationen används i stor utsträckning för att behandla neuronala sjukdomar som för närvarande untreatable genom farmakologisk intervention. DBS används idag för att behandla rörelserubbningar vid Parkinsons sjukdom och dystoni ^7-9. Alzheimerstyp demens, Huntingtons sjukdom, epilepsi, smärta och neuropsykiatriska sjukdomar såsom depression, OCD, Tourettes7; s syndrom och missbruk är några av de villkor mottagliga för behandling av DBS ^10-12. Medan DBS operation FDA godkänt för behandling av Parkinsons sjukdom, dystoni och essentiell tremor, användning av DBS för att behandla andra villkor som nämns ovan är i olika stadier av lab och kliniska studier som erbjuder mycket löfte till patienter ^13,14.

Kliniskt är DBS operation utförs i två steg. Den första etappen innebär kirurgiskt positionera DBS elektroder vid riktad anatomiska läge med hjälp av en kombination av radiologisk positionering, CT, MR samt mikroelektrod avläsningar för ökad precision. Det andra steget involverar att implantera en pulsgenerator i patientens övre bröstet och installera förlängningen leder från hårbotten till pulsgeneratorn. Baserat på den neurologiskt tillstånd har flera programmeringssystem för pulsgeneratorn standardiserats och kommer att användas för att leverera den önskade spänningen. Den slutliga volTage nås stegvis så att få bästa kliniska svaret med minimal spänning ^15. Men i våra studier, till skillnad från de kroniska DBS implantat används kliniskt, för enkelhetens skull har vi tillgripit studera en engångs högfrekvent stimulering (1 timme) i våra djurmodeller.

En del av vår grupps forskning fokuserar på att undersöka användningen av DBS operation för behandlingsresistent epilepsi. Stereotaktiska kirurgiska tillvägagångssätt med högfrekvent stimulering har undersökts av många andra som ett effektivt alternativ för att behandla medicinskt refraktär epilepsi som utgör ca 30% av alla fall av epilepsi ^10,16,17. Cerebellär stimulering inriktning kortikala ytan samt de djupa cerebellära kärnorna har använts tidigare som mål att behandla epilepsi ^10,18,19. Dessutom har hippocampus stimulering också prövats men med blandade resultat ^20,21. Några av de andra undersöktaDBS mål för epilepsi inkluderar hjärnbarken, thalamus, nucleus subthalamicus och vagusnerven ^8. Men följande resultat från flera studier under de senaste åren, har den främre talamisk kärnan (ATN) fram som den vanligaste DBS mål för behandling av epilepsi ^10,22. Utifrån kunskap om neuroanatomiska kretsar och fynd från djurmodeller, har flera studier fokuserat på den terapeutiska effekten av djup hjärnstimulering av ATN vid behandling av epilepsi ^23-26. ATN är en del av det limbiska kretsen och är belägen i den region av hjärnan som påverkar anfallsfrekvens. Studier av Hamani et al., Har testat effekten av ATN-DBS i en pilokarpin inducerade epilepsi modell och fann att bilaterala ATN stimulering långvarig latenser för pilokarpin-inducerad kramper och status epilepticus ^24. Vidare högfrekvent stimulering av ATN fann att minska anfallsfrekvensen i en pentylentetrazol (PTZ) modell av epilepsy ^25,27-29. Lee et al., Har rapporterat en genomsnittlig minskning av anfallsfrekvensen med cirka 75% vid kronisk djup hjärnstimulering av ATN vid behandling eldfast partiell epilepsi ^30.

En ny klinisk studie på behandlingsresistent epilepsi har visat lovande resultat efter DBS operation riktar den främre talamisk kärnan (ATN) ^22. En multicenter randomiserad klinisk studie med 110 patienter som genomgick bilateral DBS av ATN för behandling refraktär epilepsi (SANTE rättegång) indikerade en nedgång i anfallsfrekvensen med cirka 40% ^31. Resultaten från denna studie antydde också på en fördröjd optimal antiepileptiska effekt observerades vid 2-3 månader efter operationen. Ytterligare studier av Toda et al., Som bekräftas med dessa fynd där de visade neurogenes händer vid ett senare tillfälle inlägg DBS (dag 3-5) i djurmodeller ^1. Dessutom Encinas et al., Har rapporterat hippocampus neurogenesis i vuxen mus gyrus dentatus efter högfrekvent stimulering av ATN ^32. Tidigare studier ^33-35 har rapporterat sjunkande hippocampus neurogenes i vissa epileptiska fall såsom kronisk tinningloben epilepsi och en förening med inlärnings underskott, försämrat minne och spontana återkommande motoriska anfall. Dessutom fanns det en minskning av neurala stamcells progenitor faktorer såsom FGF2 och IGF-1 i den kroniskt epileptiska hippocampus i djurmodeller ^33. Med tanke på detta, interventionell strategier såsom DBS som visar en ökning av neurogenes i gyrus dentatus är spännande vägar för forskning. Dessa upptäckter har uppmuntrat oss att utforska ytterligare djupt in i mekanismen underliggande neurogenes efter DBS behandling för epilepsi. Vi har riktat ATN både ensidigt (data inte rapporterats) samt bilateralt (i representativa resultat) och sett förhöjda neurotrofin (BDNF) uttryck i rått gyrus dentatus. Vår cktuellt hypotes är att BDNF uttryck initierar en genexpression kaskad som kulminerar i neurogenes som översätter till det antiepileptiska effekten av DBS kirurgi. I detta papper presenterar vi våra metoder för DBS kirurgi med inriktning på ATN hos råttor följt av genuttrycksanalys som en attraktiv metod för att studera mekanismen bakom fördelarna med DBS.

Protocol

OBS: Etik Uttalande: Alla procedurer diskuteras i detta manuskript är i överensstämmelse med NIH riktlinjer för Animal Research (Guide för skötsel och användning av försöksdjur) och är godkända av Harvard Medical School IACUC kommittén. 1. Förhands kirurgisk Förberedelse Se till att alla kirurgiska instrument är steriliserade antingen autoklave eller rengöra med antiseptisk lösning och / eller etanol som behövs. Om möjligt, använd sterila engångs utrustning s?…

Representative Results

Figurerna 1A och 1B visar det relativa uttrycket av BDNF och GABRD relativt styr genen β-aktin. BDNF, är en neurotrofin ofta förknippas med nervskyddande effekter i många neuronala sjukdomar 38-41. Det är därför intressant att analysera uttrycksprofilen av BDNF som svar på stimulering av ATN vilket ger terapeutiska fördelar för patienter med epilepsi. I Figur 1A som visar genuttryck profil BDNF över de angivna tidspunkter posta DBS stimulering, BDN…

Discussion

Efter landmärket arbete av Benabid et al. I att använda djup hjärnstimulering för behandling av Parkinsons sjukdom och essentiell tremor har DBS kirurgisk teknik undersökts med stort intresse under det senaste decenniet för att behandla många neurologiska sjukdomar ^6,10,43. DBS studier är inriktade på olika neuro anatomiska regioner i hjärnan kretsar för närvarande utförs av många grupper att ta upp viktiga neuronala sjukdomar och är i olika stadier av kliniska prövningar. Stimulering…

Materials

Deep Brain Stimulation Surgery
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Stereotactic frame	Kopf Instruments	Model 900
Drill	Dremmel	7700, 7.2 V
Scalpel	BD	372610
Ketamine	Patterson Veterinary	07-803-6637	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Xylazine	Patterson Veterinary	07-808-1947
Buprenorphine	Patterson Veterinary	07-850-2280	Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules
Surgical staples	ConMed Corporation	8035
Sutures (3-0)	Harvard Apparatus	72-3333
Syringe (1 ml, 29 1/2 G)	BD	329464	Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously
Needles	BD	305761	Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes
Ethanol	Fisher Scientific	S25309B	Use for general sterilization
Eye Lubricant	Fisher Scientific	19-898-350
Stimulator	Medtronic	Model 3628
DBS electrodes	Rhodes Medical Instruments, CA	SNEX100x-100mm	Electrodes are platinum, concentric and bipolar
Betadine (Povidone-Iodine)	PDI	S23125	Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision
Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Acrylic Rodent Brain Matrix	Electron Microscopy Sciences	175-300	www.emsdiasum.com
Razor Blade	V W R	55411-050
Guillotine Scissors	Clauss	18039	For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition
Scissors	Codman Classic	34-4098	Use for removing the brain from the skull
Forceps	Electron Microscopy Sciences	72957-06	Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection
Phosphate Buffered Saline	Boston Bioproducts	BM-220
RNA Extraction and cDNA Preparation
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
Tri Reagent	Sigma	T9424	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Syringe (3 ml, 25 G)	BD	309570	Use for tissue homogenization
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1	Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin
Isopropanol	Fisher Scientific	A416-1
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Dnase I Kit	Ambion	AM1906
Superscript First Strand Synthesis Kit	Invitrogen	11904-018
Tabletop Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
Quantitative PCR
Reagent/Equipment	Vendor Name	Catalog No.	Comments
SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204143
Custom Oligos	Invitrogen	10668051
PCR Plates (96 wells)	Denville Scientific	C18080-10
Optical Adhesive Sheets	Thermo Scientific	AB1170
Nuclease free Water	Thermo Scientific	SH30538-02
Real Time PCR Machine	Applied Biosystems	7500