Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80

Published: May 3, 2015 doi: 10.3791/52482
Automatic Translation
1, 1, 1
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

Summary

כתב יד זה מתאר את הגילוי של sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בcerevisiae Saccharomyces שמרי ניצנים.

Abstract

לאחר translational שינויים (PTMs), כגון זרחון, מתילציה, acetylation, ubiquitination, וsumoylation, להסדיר את תפקידם של חלבונים רבים. PTMs של חלבוני קינטוכור שמקשרים עם DNA centromeric לתווך הפרדת כרומוזום נאמן לשמור על יציבות הגנום. גישות ביוכימיות כגון ספקטרומטר מסה וניתוח כתם המערבי הנפוצות ביותר לזיהוי PTMs. הנה, שיטת טיהור חלבון מתוארת המאפשרת זיהוי של שני sumoylation וubiquitination של חלבוני קינטוכור, Ndc10 וNdc80, בSaccharomyces cerevisiae. מתח שמבטא Smt3 מתויג polyhistidine-הדגל (HF-Smt3) וmyc-מתויג Ndc10 או Ndc80 נבנה ומשמש למחקרים שלנו. לגילוי של sumoylation, אנחנו המצאנו פרוטוקול לזיקה לטהר מתויגים חלבוני sumoylated באמצעות חרוזים ניקל ושימוש בניתוח כתם מערבי עם אנטי-Myc נוגדנים לזהות Ndc10 sumoylatedND Ndc80. לגילוי של ubiquitination, אנחנו המצאנו פרוטוקול לimmunoprecipitation של חלבוני myc-מתויגים ושימוש בניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי-UB להראות שNdc10 וNdc80 הם ubiquitinated. התוצאות שלנו מראות כי epitope מתויג חלבון עניין בו-הדגל מתויג מתח Smt3 מאפשר זיהוי של PTMs מרובה. מחקרים עתידיים צריכים לאפשר ניצול של טכניקה זו כדי לזהות ולאפיין אינטראקציות חלבון שתלויות בPTM ספציפי.

Introduction

Ubiquitination וsumoylation לאפשר נטיה של היוביקוויטין ומשתנה כמו-יוביקוויטין הקטן (SUMO; Smt3 בcerevisiae ס 1) לחלבון מטרה, בהתאמה. PTMs של חלבוני קינטוכור להשפיע על הרמות הסלולריות שלהם ואינטראקציות בין חלבונים במהלך שלבי מחזור התא שונים על מנת להבטיח הפרדת כרומוזומים נאמן. לדוגמא, רמות סלולריות של Cse4 / CENP-וחלבון קינטוכור החיצוני Dsn1 מוסדרות על ידי proteolysis בתיווך היוביקוויטין להבטחת יציבות הגנום 2-5. יציבות של קבצים מצורפים קינטוכור-microtubule שגויים דורשת B קינאז Ipl1 / אורורה, שphosphorylates מתחמי Dam1 וNdc80 ישירות אינטראקציה עם microtubules 6-8. למרות זיהוי של למעלה משבעים חלבוני קינטוכור, יש מעט מאוד מחקרים שיבדקו את השינויים של חלבונים אלה עם PTMs, למשל, יוביקוויטין וסומו. מגבלה עיקרית היא היכולת לשמור על PTMים במהלך טיהור והמיעוט של נוגדנים מותאמים אישית עבור זיהוי של PTMs כגון sumoylation, זרחון, מתילציה, ואחרים. אפיון של חלבוני קינטוכור sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, וNdc80 מנוצל נוגדן מותאם אישית 9. בנוסף, Ndc10 היה מעורב כמצע לubiquitination 10. האדם Hec1 (Ndc80 בcerevisiae ס) הוא גם מצע עבור ubiquitination, מוסדר על ידי האנזים APC / C-hCdh1 E3 11. לכן, Ndc10 וNdc80 הם מועמדים טובים לאופטימיזציה של הפרוטוקול לזהות שני sumoylation וubiquitination בס cerevisiae.

כדי להקל על זיהוי של sumoylation, בנינו זנים המבטאים HF-Smt3 וNdc10 מתויג Myc או Ndc80. השימוש בתגי epitope (HF: His6-הדגל) ממזער את הרקע בשל תגובה צולבת הנצפה לעתים קרובות בסרום polyclonal הועלה נגד חלבון מועמד. אנחנו המצאנו פרוטוקול לזיקהלטהר conjugates HF-Smt3 ולאחר מכן השתמש באנטי-דגל מסחרי ואנטי-Myc נוגדנים כדי לזהות הנוכחות של Ndc10 sumolyated וNdc80 בהכנת Smt3 מטוהרת. לubiquitination, אנחנו המצאנו פרוטוקול immunoprecipitation שונה המשמר ubiquitination של חלבוני קינטוכור myc-מתויגים וביצעו ניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי-UB מסחרי כדי לזהות ubiquitination של Ndc10 וNdc80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צמיחה של תאי שמרים

  1. לחסן שמרי תאים ב 30 מיליליטר של YPD (טבלה 1) בבקבוק קטן. לדגור על 30 מעלות צלזיוס הלילה עם רועד.
  2. לדלל את התאים לצפיפות אופטית של 0.2 ב 600 ננומטר (OD 600 = 0.2) ב -50 מיליליטר של YPD לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם רעד.
  3. לגדול התרבות לצפיפות אופטית של 1.0 ב 600 ננומטר (OD 600 = 1.0).
  4. תאי צנטריפוגות במשך 5 דקות XG ב 2000 וזורקים supernatant.
  5. Resuspend התא גלולה במים סטריליים 40 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות XG ב 2000 לשטוף את התאים. בטל supernatant ולאחסן את התא גלולה ב -20 ° C.

2. הפקה של חלבונים

  1. תאי Resuspend ב 0.5 מיליליטר של חיץ guanidine קר כקרח (טבלה 1) עבור assay הנפתח באמצעות חרוזים superflow Ni-נת"ע או חיץ (טבלה 1) לimmunoprecipitation. שמור צינורות על קרח בכל העת.
  2. העבר את 2 מ 'צינור כובע בורג l.
  3. להוסיף את אותו הנפח של חרוזי זכוכית (טבלה של חומרים).
  4. חרוזים לנצח את התאים במקצף חרוז מיני (טבלה של חומרים) למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר, ואז מניח על קרח במשך 2-3 דקות. חזור על זה שלוש פעמים.
  5. מערבולת במהירות גבוהה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. בדקו את התאים על ידי הדמיה תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שתאי lysed.
    הערה: תאי lysed יופיעו רוחות כהות וחסרות גבול או צורה מוגדרת. בצורה אופטימלית לפחות 80% מהתאים יש lysed.
  6. לנקב חור בחלק התחתון של הצינור באמצעות סיכת דחיפה ומקום באוסף צינור חרוטי 15 מיליליטר (כובע בורג צריך להיות משוחרר).
  7. צנטריפוגה XG ב 1000 דקות 1 כדי לאסוף את lysate.
  8. העבר את lysate לצינור צנטריפוגות מיקרו.
  9. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את החלבונים שחולצו.
  10. למדוד את הריכוז של החלבונים המופקים באמצעות אסא החלבוןערכת y (טבלה של חומרים) ולנרמל את כל התמציות להכיל את אותה הכמות של חלבון. תביא את הנפח הכולל למ"ל 1 עם חיץ מתאים.
    הערה: בסביבות 5 מ"ג של חלבון כולל מתקבל 50 OD 600 תאים.
  11. לחסוך 50 μl (חלבון מיקרוגרם 250 אם החלבון הכולל שחולץ מהצעד 2.10 הוא 5 מ"ג) כתמצית כל תא (WCE). הוסף 50 μl של חיץ 2x Laemmli מדגם (טבלת 1) ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. עומס 10 μl של כל דגימה בג'ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי).

3. טיהור של HF-Smt3 conjugates

  1. השג את חרוזים Ni-נת"ע superflow (הטבלה של חומרים) נחוצים לניסויים על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (800-1,500 XG) דקות 1 (של חרוזים לדגימה 100 μl). הסר את supernatant.
  2. לשטוף חרוזים 5x עם 1 מיליליטר של PBS (טבלה של חומרים): היפוך העליון יתרתחתון עד חרוזים הם resuspended, לאסוף החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant.
  3. להשעות חרוזים ב 1 מיליליטר של חיץ guanidine (טבלה 1) וaliquot אותם למספר הצינורות המתאימים לדגימות להיות מעובד. לאסוף החרוזים על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant. מערבבים את חרוזים גם על ידי היפוך העליון על חלק תחתון.
    הערה: מערבבים חרוזים גם על ידי היפוך תחתון העליון מעל.
  4. עבור כל דגימה, להוסיף 950 μl של WCE הנותר (משלב 2.11: הפקה של חלבונים) לחרוזי superflow Ni-נת"ע 100 μl.
  5. דגירה על פלטפורמת נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות או למשך הלילה.
  6. צנטריפוגה ב XG 800-1,500 דקות 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. לחסוך 50 μl כsupernatant (SUP). הוסף 50 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. עומס 10 μl של כל דגימה בג'ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: אנאלי כתם מערבייסיס).
  8. לשטוף חרוזים פעם עם 1 מיליליטר של חיץ guanidine למשך 5-10 דקות על פלטפורמת נדנדה.
  9. לשטוף חרוזים 5x עם 1 מיליליטר של שבירת חיץ (טבלת 1) למשך 5-10 דקות על פלטפורמת נדנדה.
  10. חרוזים Resuspend ב 90 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x.
  11. הוסף 10 μl של imidazole 1 M.
    הערה: Imidazole מסייע לנתק את החלבון שלו מתויג מחרוזי Ni-נת"ע בשל אינטראקציה מתחרה בין imidazole והחרוזים.
  12. לדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות.
  13. וורטקס, אז צנטריפוגות ב13,000 XG במשך 30 שניות. מעבירים את supernatant לצינור טרי.
  14. μl 10-20 העומס של כל דגימה בג'ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי).
    הערה: 10-20 μl מתאים ל0.5-1.0 מ"ג הקלט, אם 5 מ"ג של WCE משמש.

4. Immunoprecipitation של חלבונים קינטוכור מתויג Myc

  1. להשיג ג'ל אנטי-ג-Myc זיקת agarosetibody (טבלה של חומרים) נחוץ לניסויים (25 μl של שרף לדגימה) על ידי צנטריפוגה הנמוכה מהירות (800-1,500 XG). הסר את supernatant.
  2. 5x השרף לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ: על-תחתון העליונה היפוך עד השרף resuspended, לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant.
  3. להשעות שרף ב 1 מיליליטר של החיץ וaliquot אותם למספר הצינורות המתאימים לדגימות להיות מעובד. לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant.
    הערה: מערבבים את השרף גם על ידי היפוך על-תחתון-עליונה.
  4. להוסיף 950 μl של WCE הנותר (משלב 2.11: הפקה של חלבונים) עד 25 μl של שרף.
  5. דגירה על פלטפורמת נדנדה ב 4 ° C למשך הלילה.
  6. צנטריפוגה ב XG 800-1,500 דקות 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. לחסוך 50 μl כsupernatant (SUP). הוסף 50 μl של חיץ מדגם Laemmli 2x ולדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות. Loמודעה 10 μl של כל דגימה בג'ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי).
  8. 5x השרף לשטוף עם 1 מיליליטר של חיץ: על-תחתון העליונה היפוך עד השרף resuspended, לאסוף שרף על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה, ולהסיר את supernatant.
  9. Resuspend השרף במדגם של חיץ SUMEB (טבלת 1) 100 μl.
    הערה: מאגר מדגם SUMEB מכיל 8 M אוריאה ו -1% SDS (מצב denaturing חזק).
  10. לדגור על 100 מעלות צלזיוס בגוש חום במשך 3-5 דקות.
  11. וורטקס, אז צנטריפוגות ב13,000 XG במשך 30 שניות. מעבירים את supernatant לצינור טרי.
  12. μl 10-20 העומס של כל דגימה בג'ל SDS-עמוד לניתוח מערבי כתם (סעיף 5: ניתוח כתם מערבי).
    הערה: 10-20 μl מתאים ל0.5-1.0 מ"ג הקלט, אם 5 מ"ג של WCE משמש.

5. ניתוח כתם המערבי

  1. טען את תמציות חלבון על 4-12% Bis-טריס ג'לי (טבלה של חומרים) וPerfאלקטרופורזה ORM ב 120 V 90 דקות (ריצת חיץ: טבלה של חומרים).
  2. העבר את החלבונים מג'ל לקרום nitrocellulose (טבלה של חומרים) באמצעות מנגנון העברה ליום 30 בV עבור 90 דק '(העברת חיץ: טבלה של חומרים).
  3. לחסום את הקרום ב5% חלב / 1x TBST (טבלת 1) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  4. דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני (טבלה של חומרים) 5% חלב / C הלילה ב 4 ° 1x TBST. לנוגדנים עיקריים, השתמש דילול של 1: 1,000 (נוגדנים נגד דגל ואנטי-UB) או 1: 5,000 (נוגדן אנטי-Myc).
  5. לשטוף 3x קרום במשך 10 דקות כל אחד עם 1x TBST.
  6. דגירה קרום עם נוגדנים משני (טבלה של חומרים) 5% חלב / 1x TBST עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש דילול 1: 5000 של נוגדנים משני.
  7. לשטוף 3x קרום במשך 10 דקות כל אחד עם 1x TBST.
  8. דגירה קרום עם worki ECLפתרון ng (טבלה של חומרים) במשך 5 דקות.
  9. לחשוף את הקרום לסרט X-Ray הכחול רגיש (טבלה של חומרים) ולפתח באמצעות מפתח אוטומטי (טבלה של חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לזהות sumoylation של חלבוני קינטוכור Ndc80 וNdc10, זנים עם HF-Smt3 וחלבונים מתוייגים Myc קינטוכור (Ndc80 או Ndc10) נבנו (טבלה 2), כפי שתוארו בעבר 9,12. conjugates HF-Smt3 היו מטוהר זיקה באמצעות חרוזים Ni-נת"ע. ניתוח מערבי כתם של מטוהר HF-Smt3 עם גילוי אפשר נוגדן אנטי הדגל של צורות sumoylated של מצעי SUMO שנעדרו במתח השליטה ללא HF-Smt3 (איור 1 א ו -1 B, פנל משמאל). כצפוי, צורות רבות של מצעי SUMO אותרו במתח HF-Smt3. אנחנו הבאים נקבעו אם Ndc80 וNdc10 נמצאים בהמצומד HF-Smt3 מטוהר על ידי עושה ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-Myc. להקות רבות שהיו של משקל מולקולרי גבוה יותר מזה של Ndc80 או Ndc10 בבירור התגלו (איור 1 א ו -1 B, פנל מימין). יתר על כן, להקות מרובות של שני Ndc80 וNdc10הופחתו בתאי nocodazole טופלו (איור 1 ג ו1D). תוצאות אלו מראות כי טיהור חלבון וניתוח כתם המערבי מתוארות כאן מאפשרות זיהוי של sumoylation של Ndc80 וNdc10, כפי שתוארו בעבר 9.

כדי לזהות ubiquitination של Ndc80 וNdc10, myc-מתויג Ndc80 או Ndc10 היה immunoprecipitated (IP) וניתוח כתם המערבי בוצע עם אנטי-Myc ואנטי-UB נוגדנים (איור 2). ניתוח של תמציות כל תא (WCE) וsupernatant (SUP) אישר את הביטוי של Ndc80-Myc וNdc10-Myc (איור 2 א). להקות המשקל מולקולריות נמוכות יותר בWCE עשויות לייצג מוצרים פגומים. דגימות IP מששו עם אנטי-Myc הראו להקות משקל מולקולריות גבוהות מרובות, המצביע על כך Ndc80 וNdc10 מכילים PTMs. דפוס laddering של דגימות ה- IP מששו עם נוגדן אנטי-UB הראה כי Ndc80 וNdc10 הם ubiquitinated (איור 2 א, α-UB). דפוס laddering של Ndc80 וNdc10 היה מוגבר על ידי טיפול במעכבי פרוטאזום (MG132) (איור 2, α-UB), המאשר נוסף שהלהקות האלה מייצגות פולי-ubiqutination. תוצאות הנציג עולות כי שני Ndc80 וNdc10 הם מצעים לsumoylation וubiquitination בס cerevisiae וכי שיטות טיהור החלבון תיארו שימושיות לזיהוי של PTMs כגון sumoylation וubiquitination. על פי מיטב ידיעתנו, זה הדיווח הראשון שNdc80 בס cerevisiae הוא מצע לubiquitination, למרות proteolysis היוביקוויטין תיווך של homolog אדם Hec1 כבר פורסם בעבר 11.

איור 1
איור 1: טיהור של מצעי sumolyated מאפשרת זיהוי של חלבוני קינטוכור Ndc80 וNdc10 כמו מצעי SUMO Pr.oteins חולצו וconjugates HF-Smt3 הוכן ונותח על ידי ניתוח כתם מערבי לאחר הפרדת SDS-עמוד. (A ו- B) Ndc80 וNdc10 הם sumoylated. חלבונים שהופקו מהתאים גדלו בטור הלוגריתמים בYPD. לוח שמאלי: מצעי SUMO סה"כ אותרו עם נוגדן אנטי דגל. פנל ימני: Sumoylated Ndc80 או Ndc10 זוהה בconjugates HF-Smt3 כאשר חקר עם נוגדן אנטי-Myc. (C ו- D) Sumoylation של Ndc80 וNdc10 מצטמצם בתאים שטופלו nocodazole. בטור לוגריתמים תאים גדלו בYPD טופלו בDMSO (-) או DMSO + 20 מיקרוגרם / מיליליטר nocodazole (+) לשעה 2 ב 30 מעלות צלזיוס. conjugates HF-Smt3 נותח על ידי ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדן אנטי-Myc. זני שמרי Isogenic משמשים הם (A ו- C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (-הדגל-SMT3 Ndc80-Myc) ו- (B ו- D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (-פלורידהAG-SMT3 Ndc10-Myc).

איור 2
איור 2:. Ubiquitination של חלבוני קינטוכור Ndc80 וNdc10 הפקת החלבון וimmunoprecipitation בוצע כמתואר בפרוטוקול. () Ndc80 וNdc10 הם ubiquitinated. חלבונים שהופקו מהתאים גדלו בטור הלוגריתמים בYPD. תמצית תא כולו (WCE), supernatant (SUP), ושברי immunoprecipitated (IP) היו נתונים לSDS-עמוד. כתמים מערביים שמשו לזיהוי חלבוני myc-מתויגים וubiquitinated עם אנטי-Myc ונוגדנים-UB אנטי, בהתאמה. (ב) Ubiquitination של Ndc80 וNdc10 מוגבר בתאים שטופלו MG132 מעכבי פרוטאזום. תאים גדלו בטור לוגריתמים בYPD טופלו בDMSO (-) או DMSO + 50 מיקרומטר MG132 (+) בנוכחות 0.003% מSDS ל3 שעות על 30 מעלות צלזיוס, כפי שתואר בעבר 13

פתרון רכיבים
YPD 1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, גלוקוז 2%
מאגר guanidine 0.1 M טריס- HCl pH 8.0, 6 M כלוריד guanidine, 0.5 M NaCl
מאגר 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.5, 50 מ"מ NaCl,, מעכבי 0.2% Triton X-100 1x פרוטאז
מאגר שבירה 0.1 M טריס- HCl pH 8.0, 20% גליצרול, 1 מ"מ PMSF
מאגר מדגם SUMEB 1% SDS, 8 M אוריאה, 10 מ"מ מגבים pH 6.8, 10 מ"מ EDTA, 0.01% bromophenol כחול
מאגר מדגם 2x Laemmli 100 מ"מ טריס-HClpH 6.8, 4% SDS, גליצרול 20%, 0.2% bromophenol כחולים (לפני שימוש: להוסיף ב-mercaptoethanol (BME) לריכוז סופי של 200 מ"מ)
1x TBST 137 מ"מ נתרן כלוריד, pH 20 מ"מ טריס-HCL 7.5, 0.1% Tween-20

טבלת 1: פתרונות.

2. זני שמרי שולחן משמשים ב* מחקר זה.
זנים הורה גנוטיפ התייחסות
BY4741 מאטה his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Biosystems הפתוח
BY4742 מאטה his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Biosystems הפתוח
YMB7278 BY4741 / BY4742 מאטה his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 מחקר זה
YPH1734 מאטה ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit et al., 2006
YPH1800 מאטה ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 His3MX6 מאטה his3 LEU2 URA3 ade2 TRP1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: מחקר זה
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 מאטה his3 LEU2 URA3 TRP1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 מחקר זה
* כל שמרי הזנים נגזרים מSaccharomyces cerevisiae S288C.
טבלה 2: זני שמרים המשמשים במחקר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תגי epitope כגון HA, Myc, דגל, וGST נמצאים בשימוש נרחב לאנליזה ביוכימית של חלבונים. בנייה של זנים עם HF-Smt3 וחלבוני קינטוכור מתויג Myc, כגון Ndc10 וNdc80, מאפשרת זיהוי של PTMs כגון sumoylation וubiquitination. HF-Smt3 ניתץ assay מאפשר זיהוי של חלבוני קינטוכור sumoylated, Ndc10 וNdc80 (איור 1). פרוטוקול טיהור הזיקה וניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי הדגל להקים את הספציפיות של אינטראקציה בין HF-Smt3 וחלבוני יעד, כמו חלבונים שונה שלא זוהו בזן השליטה ללא HF-Smt3. השימוש בתג Myc על מצעי החלבון מאמת את הנוכחות של Ndc10 sumoylated וNdc80 בconjugates HF-Smt3. יתר על כן, sumoylation של שני Ndc10 וNdc80 הופחת בתאי nocodazole טופלו (איור 1 ג ו1D). ירידת sumoylation של Ndc10 בתגובה לtreatmen nocodazoleלא, אבל לא Ndc80, דווח בעבר על ידי et al Montpetit. 9. זה יכול להיות בגלל הבדלים בפרוטוקול ושימוש בנוגדן אנטי-SUMO מותאם אישית ניסיוניים. התוצאות שלנו לsumoylation של מצעי קינטוכור מצביעות על כך שפרוטוקול דומה יכול לשמש כדי לחקור מצעי SUMO המועמד אחרים.

כדי לזהות ubiquitination, חלבוני קינטוכור myc-tagged היו immunoprecipitated הראשון ושברי IP נבדקו עם נוגדן אנטי-UB (איור 2). דפוס laddering של Ndc10 וNdc80 הוגדל כאשר טופלו תאים עם MG132 לעכב פונקצית פרוטאזום (איור 2), המציין כי חלבונים אלה הם מצעים של פרוטאזום. שברי IP לא הצליחו לזהות sumoylation של Ndc10 או Ndc80 בניתוח כתם מערבי עם אנטי-דגל או אנטי-Smt3 נוגדנים (מידע לא מוצג). זה יכול להיות בגלל סיבות טכניות, כגון רמות של מצע sumoylated בשבריר IP או interferencדואר מתגי epitope. אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול ה- IP כגון ריכוז מלחים ותנאים מערביים סופג צריכה להקל על זיהוי של PTMs מרובה של כל חלבון של עניין. נכון לעכשיו, sumoylation מזוהה הטוב ביותר על ידי HF-Smt3 ניתץ assay אחרי כתמים מערביים של מצעי SUMO המועמד (איור 1).

כמה פרטים להשפיע על היעילות של טיהור חלבון ואת היכולת לזהות PTMs. ראשית, כל הצינורות צריכים להיות כל הזמן על קרח כדי לעכב את פרוטאזות למעט כמפורט. שנית, יחס של 1: 1 של השעיה תא חרוזי זכוכית הוא קריטי כדי לשבש את התאים על ידי מקצף חרוז ו / או vortexer. תמוגה תא צריך להיות במעקב על ידי בדיקה של התאים תחת מיקרוסקופ. שלישית, חשוב מאוד להכין lysate הבהיר לassay למשוך למטה או IP. צנטריפוגה במהירות קצרה או נמוכה יכולה לתרום לזיהום של פסולת תא בlysate וזה משפיע על יכולת DeteCT PTMs. לבסוף, טלטול נמרץ של חרוזים עם נפח גדול של lysate ברור (כ 1 מיליליטר) בצינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר מיקרו מבטיח כי חרוזים מושעים באופן מלא עבור assay או כתובות IP לנתץ. לסיכום, טיהור חלבון וזיהוי טכניקות כגון זה שתואר כאן לספק תובנות מכניסטית חשובות לאיך PTM של חלבוני קינטוכור להשפיע על המבנה וההרכבה שלהם להפרדה כרומוזום נאמן 14, 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

Tags

מיקרוביולוגיה גיליון 99, חלבון קינטוכור Ndc10 Ndc80 Sumoylation Ubiquitination לאחר translational שינויים תמציות חלבון
טכניקת טיהור חלבון המאפשרת איתור של Sumoylation וUbiquitination של שמרים להנץ החלבונים קינטוכור Ndc10 וNdc80
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai,… More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter