出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術
Summary
この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。
Abstract
このようなリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、およびSUMO化などの翻訳後修飾（PTMを）は、多くのタンパク質の細胞機能を調節します。動原体DNAに関連付ける動原体タンパク質のPTMを、ゲノムの安定性を維持するために忠実な染色体分離を媒介します。このような質量分析およびウェスタンブロット分析のような生化学的アプローチは、最も一般的のPTMの同定のために使用されます。ここで、タンパク質精製法は、サッカロミセス·セレビシエに、Ndc10とNdc80、動原体タンパク質のSUMO化及びユビキチン化の両方の検出を可能にすることが記載されています。ポリヒスチジンFlagタグ付きSMT3（HF-SMT3）およびMyc標識Ndc10またはNdc80を発現株を構築し、私たちの研究のために使用しました。 SUMO化の検出のために、我々は、ニッケルビーズを用いて、HisタグSUMO化タンパク質をアフィニティー精製するためのプロトコルを考案し、SUMO化Ndc10 Aを検出するために抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用しましたND Ndc80。ユビキチン化の検出のために、我々はMyc標識タンパク質の免疫沈降のためのプロトコルを考案し、Ndc10とNdc80がユビキチン化されていることを示すために抗Ubの抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用していました。我々の結果は、彼のフラッグで目的のエピトープタグ化タンパク質はSMT3株は、複数のPTMの検出を容易にタグ付けされたことを示しています。今後の研究では、この技術の利用は、特定のPTMに依存しているタンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために許可する必要があります。
Introduction
それぞれ、標的タンパク質へ;（S.セレビシエ 1 SMT3 SUMO）ユビキチンとSUMO化は、ユビキチンと小さなユビキチン様修飾剤の結合を可能にします。動原体蛋白質のPTMは、忠実な染色体の分離を確実にするために、異なる細胞周期の段階でそれらの細胞レベルおよびタンパク質 – タンパク質相互作用に影響を与えます。例えば、Cse4 / CENP-Aと外側動原体タンパク質DSN1の細胞レベルは、ゲノムの安定性2-5を確保するためのユビキチンを介したタンパク質分解によって調節されています。不正な動原体微小管の添付ファイルの不安定化は、直接微小管6-8と対話DAM1とNdc80複合体をリン酸化するIPL1 /オーロラBキナーゼを必要とします。 70以上の動原体タンパク質の同定にもかかわらず、PTMを、 例えば 、ユビキチンおよびSUMOとのこれらのタンパク質の修飾を調査する非常に少数の研究があります。主な制限は、PTMを維持する能力であります精製およびそのようなSUMO化、リン酸化、メチル化、および他のようなPTMを検出するためのカスタム抗体の不足時にS。 SUMO化動原体タンパク質の特性はNdc10、Cep3は、BIR1、およびNdc80カスタム抗体9を利用しました。さらに、Ndc10は、ユビキチン化10の基質として関与しています。ヒトHec1（S. cerevisiaeにおけるNdc80）も、APC / C-hCdh1 E3リガーゼ11によって規制、ユビキチン化の基質です。したがって、Ndc10とNdc80はSにSUMO化とユビキチン化の両方を検出するためのプロトコルの最適化のための良好な候補でありますセレビシエ 。
SUMO化の識別を容易にするために、我々は、HF-SMT3とMyc標識Ndc10またはNdc80を発現する株を構築しました。エピトープタグ（HF：のHis6フラッグ）の使用は、頻繁に候補タンパク質に対するポリクローナル血清で観察された交差反応性に背景を最小限に抑えることができます。私たちは、親和性のプロトコルを考案しましたHF-SMT3複合体を精製した後、精製SMT3準備にsumolyated Ndc10とNdc80の存在を検出するために、市販の抗フラッグ及び抗Myc抗体を用いました。ユビキチン化のために、我々はmycタグ動原体タンパク質のユビキチン化を保持する修飾された免疫沈降プロトコルを考案し、Ndc10とNdc80のユビキチン化を検出するために、市販の抗Ubの抗体を用いたウエスタンブロット分析を行いました。
Protocol
Representative Results
Discussion
そのようなHA、Mycの、フラグ、GSTなどのエピトープタグは、広くタンパク質の生化学的分析のために使用されます。 HF-SMT3などNdc10やNdc80としてMyc標識動原体タンパク質、を有する株の構築は、SUMO化およびユビキチン化などのPTMの検出を容易にしています。 HF-SMT3アッセイをプルダウンNdc10とNdc80（ 図1）、SUMO化動原体タンパク質の検出を可能にします。修飾タンパク質は、HF-SMT3な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
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