Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sumoylation और नवोदित खमीर Kinetochore प्रोटीन Ndc10 और Ndc80 की Ubiquitination की जांच की अनुमति देता है कि प्रोटीन शोधन तकनीक

Published: May 3, 2015 doi: 10.3791/52482
Automatic Translation
1, 1, 1
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

Summary

इस पांडुलिपि नवोदित खमीर में, sumoylation और kinetochore प्रोटीन, Ndc10 और Ndc80 की ubiquitination का पता लगाने का वर्णन है।

Abstract

इस तरह के फास्फारिलीकरण, मेथिलिकरण, एसिटिलीकरण, ubiquitination, और sumoylation के रूप में बाद translational संशोधनों (PTMs), कई प्रोटीन के सेलुलर समारोह को विनियमित। Centromeric डीएनए के साथ संबद्ध है कि kinetochore प्रोटीन की PTMs जीनोम स्थिरता बनाए रखने के लिए वफादार गुणसूत्र अलगाव मध्यस्थता। ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के रूप में जैव रासायनिक दृष्टिकोण आमतौर पर सबसे अधिक PTMs की पहचान के लिए किया जाता है। इधर, एक प्रोटीन शोधन विधि Saccharomyces cerevisiae में kinetochore प्रोटीन, Ndc10 और Ndc80 के sumoylation और ubiquitination दोनों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है कि वर्णित है। Ndc10 Myc टैग या Ndc80 निर्माण किया है और हमारे अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था व्यक्त करता polyhistidine फ्लैग टैग Smt3 (HF-Smt3) और कहा कि एक तनाव। Sumoylation का पता लगाने के लिए, हम निकल मोती का उपयोग करके अपने टैग sumoylated प्रोटीन शुद्ध आत्मीयता के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और sumoylated Ndc10 एक का पता लगाने के विरोधी Myc एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इस्तेमाल कियाएन डी Ndc80। Ubiquitination का पता लगाने के लिए, हम Myc टैग प्रोटीन की immunoprecipitation के लिए एक प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और Ndc10 और Ndc80 ubiquitinated कर रहे हैं दिखाने के लिए कि विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इस्तेमाल किया। हमारे परिणाम उनकी फ्लैग में रुचि के मिलान में चिह्नित प्रोटीन Smt3 तनाव कई PTMs का पता लगाने की सुविधा में चिह्नित है दिखाते हैं। भविष्य के अध्ययन के लिए इस तकनीक का शोषण एक विशिष्ट PTM पर निर्भर कर रहे हैं कि प्रोटीन बातचीत की पहचान करने और चिह्नित करने के लिए अनुमति चाहिए।

Introduction

क्रमश: एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए, (एस cerevisiae 1 में Smt3 सूमो) Ubiquitination और sumoylation ubiquitin और लघु Ubiquitin की तरह संशोधक का संयुग्मन अनुमति देते हैं। Kinetochore प्रोटीन की PTMs वफादार गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के लिए अलग सेल चक्र चरणों के दौरान उनके सेलुलर स्तर और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, Cse4 / CENP-ए और बाहरी kinetochore प्रोटीन Dsn1 की सेलुलर स्तर जीनोम स्थिरता 2-5 सुनिश्चित करने के लिए ubiquitin की मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस द्वारा विनियमित रहे हैं। गलत kinetochore-सूक्ष्मनलिका अनुलग्नकों की अस्थिरता सीधे सूक्ष्मनलिकाएं 6-8 के साथ बातचीत कि Dam1 और Ndc80 परिसरों phosphorylates जो Ipl1 / अरोड़ा बी काइनेज की आवश्यकता है। सत्तर से अधिक kinetochore प्रोटीन की पहचान के बावजूद, PTMs, जैसे, Ubiquitin और सूमो के साथ इन प्रोटीनों की संशोधनों की जांच है कि बहुत कुछ अध्ययन कर रहे हैं। एक प्रमुख सीमा PTM की रक्षा करने की क्षमता हैशुद्धि और इस तरह के sumoylation, फास्फारिलीकरण, मेथिलिकरण, और दूसरों के रूप में PTMs का पता लगाने के लिए कस्टम एंटीबॉडी की कमी के दौरान एस। Sumoylated kinetochore प्रोटीन की विशेषता Ndc10, Cep3, Bir1, और Ndc80 एक कस्टम एंटीबॉडी 9 का उपयोग किया। इसके अतिरिक्त, Ndc10 ubiquitination 10 के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में शामिल किया गया है। मानव Hec1 (एस cerevisiae में Ndc80) भी एपीसी / सी-hCdh1 E3 के ligase 11 द्वारा विनियमित, ubiquitination के लिए सब्सट्रेट है। इसलिए, Ndc10 और Ndc80 एस में sumoylation और ubiquitination दोनों का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए अच्छा उम्मीदवार हैं cerevisiae।

Sumoylation की पहचान की सुविधा के लिए, हम HF-Smt3 और Myc टैग Ndc10 या Ndc80 व्यक्त कि उपभेदों का निर्माण किया। मिलान टैग (HF: His6-ध्वज) के उपयोग की वजह से अक्सर एक उम्मीदवार प्रोटीन के खिलाफ उठाया पॉलीक्लोनल सीरम में मनाया जाता है कि पार जेट के लिए पृष्ठभूमि को कम करता है। हम समानता के लिए एक प्रोटोकॉल तैयारHF-Smt3 conjugates के शुद्ध और फिर शुद्ध Smt3 तैयारी में sumolyated Ndc10 और Ndc80 की उपस्थिति का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक विरोधी ध्वज और विरोधी Myc एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। Ubiquitination के लिए, हम Myc टैग kinetochore प्रोटीन की ubiquitination को बरकरार रखता है कि एक संशोधित immunoprecipitation प्रोटोकॉल तैयार कर लिया और Ndc10 और Ndc80 की ubiquitination का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शन किया।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

खमीर कोशिकाओं के 1. ग्रोथ

  1. एक छोटी सी कुप्पी में YPD (तालिका 1) के 30 मिलीलीटर में खमीर की कोशिकाओं को टीका लगाना। झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  2. YPD के 50 मिलीलीटर में 600 एनएम (600 आयुध डिपो = 0.2) पर 0.2 की एक ऑप्टिकल घनत्व कोशिकाओं पतला और झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. 600 एनएम (600 आयुध डिपो = 1.0) पर 1.0 की एक ऑप्टिकल घनत्व को संस्कृति विकसित।
  4. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. कोशिकाओं को धोने के लिए 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए 40 मिलीलीटर बाँझ पानी और अपकेंद्रित्र में सेल गोली Resuspend। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और -20 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली की दुकान।

प्रोटीन के 2. एक्सट्रैक्शन

  1. या नी NTA superflow मोती का उपयोग कर पुल से नीचे परख के लिए ठंडा guanidine बफर (तालिका 1) के 0.5 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं immunoprecipitation के लिए एक (तालिका 1) बफर। हर समय बर्फ पर ट्यूबों रखें।
  2. 2 मीटर करने के लिए स्थानांतरणएल पेंच टोपी ट्यूब।
  3. कांच के मोती के समान मात्रा (सामग्री की तालिका) जोड़ें।
  4. फिर 2-3 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए एक मिनी मनका डिब्बा में कोशिकाओं (सामग्री की तालिका) मनका हराया। इस तीन बार दोहराएँ।
  5. 30-60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उच्च गति पर भंवर। कोशिकाओं lysed रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे दृश्य द्वारा कोशिकाओं की जाँच करें।
    नोट: lysed कोशिकाओं के रूप में अंधेरे भूत दिखाई देते हैं और एक सीमा या परिभाषित आकार की कमी होगी। बेहतर कोशिकाओं के कम से कम 80% lysed किया जाना चाहिए।
  6. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (पेंच टोपी ढीला होना चाहिए) एक संग्रह में एक धक्का पिन और जगह का उपयोग ट्यूब के तल में एक छेद पंचर।
  7. Lysate इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  8. एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब lysate स्थानांतरण।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 XG पर अपकेंद्रित्र निकाले प्रोटीन लेने के लिए।
  10. प्रोटीन ASSA का उपयोग कर निकाला प्रोटीन की एकाग्रता उपायY किट (सामग्री की तालिका) और सभी निष्कर्षों को सामान्य प्रोटीन का एक ही राशि में होते हैं करने के लिए। उपयुक्त बफर के साथ 1 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाओ।
    नोट: कुल प्रोटीन का लगभग 5 मिलीग्राम 50 आयुध डिपो के 600 कोशिकाओं से प्राप्त किया जाता है।
  11. पूरे सेल निकालने (WCE) के रूप में (2.10 कदम से निकाले कुल प्रोटीन 5 मिलीग्राम अगर 250 माइक्रोग्राम प्रोटीन) 50 μl बचाओ। 2x Laemmli नमूना बफर (तालिका 1) के 50 μl जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। लोड वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण (धारा 5: पश्चिमी धब्बा विश्लेषण) के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल में प्रत्येक नमूना के 10 μl।

HF-Smt3 conjugates 3. शुद्धीकरण

  1. प्रयोगों 1 मिनट के लिए कम गति centrifugation (800-1,500 XG) से (नमूना प्रति मोतियों की 100 μl) के लिए आवश्यक नी NTA superflow मोती (सामग्री की तालिका) प्राप्त करते हैं। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  2. धो मोती पीबीएस (सामग्री की तालिका) के 1 मिलीलीटर के साथ 5x: उलटें शीर्ष खत्ममोती resuspended हैं जब तक नीचे, कम गति centrifugation द्वारा मोती जमा है, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  3. Guanidine बफर (तालिका 1) के 1 मिलीलीटर में मोतियों को निरस्त करने और संसाधित करने के लिए नमूने के लिए इसी ट्यूबों की संख्या में उन्हें विभाज्य। कम गति centrifugation द्वारा मोती ले लीजिए, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। शीर्ष ओवर inverting नीचे से अच्छी तरह से मोती मिलाएं।
    नोट: ऊपर से अधिक नीचे inverting द्वारा अच्छी तरह से मोती मिलाएं।
  4. नी NTA superflow मोतियों की 100 μl के लिए: प्रत्येक नमूना के लिए, (प्रोटीन के निष्कर्षण कदम 2.11 से) शेष WCE के 950 μl जोड़ें।
  5. कम से कम 4 घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल मंच पर सेते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 800-1,500 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. सतह पर तैरनेवाला (समर्थन) के रूप में 50 μl बचाओ। 2x Laemmli नमूना बफर के 50 μl जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। लोड वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण (धारा 5 के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल में प्रत्येक नमूना के 10 μl: पश्चिमी धब्बा गुदाysis)।
  8. एक कमाल मंच पर एक बार 5-10 मिनट के लिए guanidine बफर के 1 मिलीलीटर के साथ धो मोती।
  9. धो मोती एक कमाल मंच पर 5-10 मिनट के लिए बफर (तालिका 1) तोड़ने के 1 मिलीलीटर के साथ 5x।
  10. 2x Laemmli नमूना बफर के 90 μl में Resuspend मोती।
  11. 1 एम Imidazole की 10 μl जोड़ें।
    नोट: Imidazole कारण imidazole और मोतियों के बीच प्रतिस्पर्धा बातचीत करने के लिए नी NTA मोतियों से उनकी टैग प्रोटीन को अलग कर देना मदद करता है।
  12. 3-5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  13. भंवर, तो 30 सेकंड के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  14. (पश्चिमी धब्बा विश्लेषण धारा 5) वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल में प्रत्येक नमूने की लोड 10-20 μl।
    नोट: WCE की 5 मिलीग्राम प्रयोग किया जाता है अगर 10-20 μl, इनपुट का 0.5-1.0 मिलीग्राम से मेल खाती है।

Myc टैग Kinetochore प्रोटीन के 4. immunoprecipitation

  1. विरोधी सी Myc agarose आत्मीयता जेल एक प्राप्तtibody (सामग्री की तालिका) कम गति centrifugation (800-1,500 XG) द्वारा प्रयोगों (नमूना प्रति राल के 25 μl) के लिए आवश्यक है। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  2. बफर के 1 मिलीलीटर के साथ धोने राल 5x: राल resuspended है जब तक उलटें शीर्ष ओवर के नीचे, कम गति centrifugation द्वारा राल जमा है, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  3. बफर के 1 मिलीलीटर में राल को निरस्त करने और संसाधित करने के लिए नमूने के लिए इसी ट्यूबों की संख्या में उन्हें विभाज्य। कम गति centrifugation द्वारा राल ले लीजिए, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    नोट: ऊपर से अधिक नीचे inverting द्वारा अच्छी तरह से राल मिलाएं।
  4. राल के 25 μl के लिए: (प्रोटीन के निष्कर्षण कदम 2.11 से) शेष WCE के 950 μl जोड़ें।
  5. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कमाल मंच पर सेते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 800-1,500 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. सतह पर तैरनेवाला (समर्थन) के रूप में 50 μl बचाओ। 2x Laemmli नमूना बफर के 50 μl जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। लोविज्ञापन वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल (धारा 5: पश्चिमी धब्बा विश्लेषण) में प्रत्येक नमूना के 10 μl।
  8. बफर के 1 मिलीलीटर के साथ धोने राल 5x: राल resuspended है जब तक उलटें शीर्ष ओवर के नीचे, कम गति centrifugation द्वारा राल जमा है, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  9. SUMEB नमूना बफर (तालिका 1) के 100 μl में राल Resuspend।
    नोट: SUMEB नमूना बफर 8 एम यूरिया और 1% एसडीएस (मजबूत denaturing हालत) शामिल हैं।
  10. 3-5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  11. भंवर, तो 30 सेकंड के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  12. (पश्चिमी धब्बा विश्लेषण धारा 5) वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण के लिए एक एसडीएस पृष्ठ जेल में प्रत्येक नमूने की लोड 10-20 μl।
    नोट: WCE की 5 मिलीग्राम प्रयोग किया जाता है अगर 10-20 μl, इनपुट का 0.5-1.0 मिलीग्राम से मेल खाती है।

5. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. 4-12% बीआईएस Tris जैल (सामग्री की तालिका) और perf पर प्रोटीन के अर्क लोडORM वैद्युतकणसंचलन 90 मिनट के लिए 120 वी पर (बफर चल रहा है: सामग्री की तालिका)।
  2. 90 मिनट (: माल के पटल स्थानांतरण बफर) के लिए 30 वी में एक हस्तांतरण के उपकरण का उपयोग कर एक nitrocellulose झिल्ली (सामग्री की तालिका) को जेल से प्रोटीन स्थानांतरण।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% दूध / 1x TBST (Table1) में झिल्ली अवरुद्ध करें।
  4. 5% दूध / 1x TBST के लिए रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस में प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ झिल्ली सेते हैं। 1,000 (विरोधी ध्वज और विरोधी-UB एंटीबॉडी) या 1: 5,000 (विरोधी Myc एंटीबॉडी) प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए, एक 1 के कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
  5. 1x TBST के साथ 10 मिनट प्रत्येक के लिए झिल्ली 3x धो लें।
  6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% दूध / 1x TBST में माध्यमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका) के साथ झिल्ली सेते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी के 5,000 कमजोर पड़ने: एक 1 का प्रयोग करें।
  7. 1x TBST के साथ 10 मिनट प्रत्येक के लिए झिल्ली 3x धो लें।
  8. ईसीएल में काम कर रहे साथ झिल्ली सेतेएनजी समाधान (सामग्री की तालिका) 5 मिनट के लिए।
  9. नीले संवेदनशील एक्स-रे फिल्म के लिए झिल्ली (सामग्री की तालिका) बेनकाब और एक स्वचालित डेवलपर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर विकसित करना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पहले से 9,12 के रूप में वर्णित kinetochore प्रोटीन Ndc80 और Ndc10 की sumoylation का पता लगाने के लिए, HF-Smt3 और Myc टैग kinetochore प्रोटीन (Ndc80 या Ndc10) के साथ उपभेदों, (तालिका 2) का निर्माण किया गया। HF-Smt3 conjugates के संबंध नी NTA मोती का उपयोग कर शुद्ध किया गया। HF-Smt3 (चित्रा 1 ए और 1 बी, बाएं पैनल) के बिना नियंत्रण तनाव में अनुपस्थित थे कि सूमो substrates के sumoylated रूपों में से एक विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी की अनुमति दी पता लगाने के साथ शुद्ध HF-Smt3 के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। जैसी कि उम्मीद थी, सूमो substrates के कई रूपों HF-Smt3 तनाव में पता चला रहे थे। Ndc80 और Ndc10 एक विरोधी Myc एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण कर रही द्वारा शुद्ध HF-Smt3 साधना में मौजूद हैं अगर हम अगले निर्धारित की। Ndc80 या Ndc10 की तुलना में अधिक आणविक वजन के थे कि कई बैंड स्पष्ट रूप से (चित्रा 1 ए और 1 बी, सही पैनल) पाया गया। इसके अलावा, Ndc80 और Ndc10 दोनों के कई बैंडnocodazole इलाज कोशिकाओं (चित्रा 1C और -1) में कम हो गई थी। इन परिणामों के 9 पहले से वर्णित के रूप में प्रोटीन शुद्धि और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, यहाँ वर्णित Ndc80 और Ndc10 की sumoylation का पता लगाने की अनुमति है दिखाते हैं।

Ndc80 और Ndc10 के ubiquitination पता लगाने के लिए Ndc80 या Ndc10 (आईपी) immunoprecipitated गया था Myc टैग और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण विरोधी Myc और विरोधी-UB एंटीबॉडी (चित्रा 2) के साथ प्रदर्शन किया गया था। पूरे सेल अर्क (WCE) और सतह पर तैरनेवाला (समर्थन) का विश्लेषण Ndc80-Myc और Ndc10-Myc (2A चित्रा) की अभिव्यक्ति की पुष्टि की। WCE पर कम आणविक भार बैंड गिरावट उत्पादों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। विरोधी Myc के साथ जांच आईपी नमूने Ndc80 और Ndc10 PTMs होते हैं, सुझाव है कि कई उच्च आणविक भार बैंड दिखाया। विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ जांच आईपी नमूनों की एक laddering पैटर्न Ndc80 और Ndc10 ubiquitinated कर रहे हैं पता चला है कि (2A चित्रा, α-यूबी)। Ndc80 और Ndc10 की laddering पैटर्न आगे इन बैंड पाली ubiqutination का प्रतिनिधित्व करते हैं, पुष्टि है कि Proteasome अवरोध करनेवाला (MG132) (चित्रा 2 बी, α-यूबी) के साथ इलाज के द्वारा बढ़ाया गया। प्रतिनिधि परिणाम Ndc80 और Ndc10 दोनों एस में sumoylation और ubiquitination substrates के लिए कर रहे हैं कि पता चलता है cerevisiae और वर्णित प्रोटीन शुद्धि विधियों ऐसे sumoylation और ubiquitination के रूप में PTMs का पता लगाने के लिए उपयोगी होते हैं। हमारे ज्ञान के अनुसार, इस एस में Ndc80 कि पहली रिपोर्ट है मानव homolog Hec1 की ubiquitin मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस पहले से 11 प्रकाशित किया गया है, हालांकि cerevisiae, ubiquitination के लिए एक सब्सट्रेट है।

चित्र 1
चित्रा 1: sumolyated substrates के शोधन सूमो substrates के रूप में kinetochore प्रोटीन Ndc80 और Ndc10 की पहचान की अनुमति देता पीआर।oteins निकाले गए थे और HF-Smt3 conjugates के एसडीएस पृष्ठ जुदाई के बाद तैयार किया है और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया। (ए और बी) Ndc80 और Ndc10 sumoylated कर रहे हैं। प्रोटीन YPD में लघुगणकीय बढ़ कोशिकाओं से निकाले गए थे। बाएं पैनल: कुल सूमो substrates के एक विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी के साथ पाया गया। राइट पैनल: एक विरोधी Myc एंटीबॉडी के साथ जांच जब Sumoylated Ndc80 या Ndc10 HF-Smt3 conjugates में पाया गया था। Ndc80 और Ndc10 (सी और डी) Sumoylation nocodazole इलाज कोशिकाओं में कम हो जाता है। (-) Logarithmically YPD में बढ़ कोशिकाओं DMSO के साथ इलाज किया गया या DMSO के + / एमएल nocodazole (+) 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 20 माइक्रोग्राम। HF-Smt3 conjugates के विरोधी Myc एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया। इस्तेमाल किया Isogenic खमीर उपभेदों (ए और सी) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (उनकी फ्लैग-SMT3 Ndc80-Myc) और (बी और डी) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (उनकी-FL हैंएजी-SMT3 Ndc10-Myc)।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में kinetochore प्रोटीन Ndc80 और प्रोटीन और immunoprecipitation की Ndc10 निष्कर्षण के Ubiquitination प्रदर्शन किया गया। (ए) Ndc80 और Ndc10 ubiquitinated कर रहे हैं। प्रोटीन YPD में लघुगणकीय बढ़ कोशिकाओं से निकाले गए थे। पूरे सेल निकालने (WCE), सतह पर तैरनेवाला (समर्थन), और immunoprecipitated (आईपी) को भिन्न एसडीएस पृष्ठ के अधीन थे। पश्चिमी blots क्रमशः, विरोधी Myc और विरोधी-UB एंटीबॉडी के साथ-Myc टैग और ubiquitinated प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया। Ndc80 और Ndc10 (बी) Ubiquitination Proteasome अवरोध करनेवाला MG132 के साथ इलाज किया कोशिकाओं में बढ़ाया है। (-) YPD में logarithmically बढ़ कोशिकाओं DMSO के साथ इलाज किया गया या DMSO के पहले से 13 में वर्णित 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए एसडीएस की 0.003% की उपस्थिति में 50 माइक्रोन MG132 (+) के रूप में

समाधान अवयव
YPD 1% खमीर निकालने, 2% bacto-peptone, 2% ग्लूकोज
Guanidine बफर 0.1 एम Tris-एचसीएल पीएच 8.0, 6 एम guanidine क्लोराइड, 0.5 एम NaCl
बफर 50 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच, 50 मिमी NaCl, 0.2% ट्राइटन X-100, 1x प्रोटीज इनहिबिटर्स
आज की ताजा बफर 8.0 पीएच 0.1 एम Tris-एचसीएल, 20% ग्लिसरॉल, 1 मिमी PMSF
SUMEB नमूना बफर 1% एसडीएस, 8 एम यूरिया, 10 मिमी MOPS पीएच 6.8, 10 मिमी EDTA, 0.01% bromophenol नीला
2x Laemmli नमूना बफर 100 मिमी Tris-एचसीएलपीएच 6.8, 4% एसडीएस, 20% ग्लिसरॉल, 0.2% bromophenol नीला (प्रयोग करने से पहले: 200 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बी-mercaptoethanol (बीएमई) जोड़ने के लिए)
1x TBST 137 मिमी सोडियम क्लोराइड, 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.5, 0.1% बीच 20

तालिका 1: समाधान।

इस अध्ययन * में इस्तेमाल तालिका 2 खमीर उपभेदों।
खींच माता-पिता जीनोटाइप संदर्भ
BY4741 माता his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 ओपन Biosystems
BY4742 माता his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 ओपन Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 माता his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 उरa3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 यह अध्ययन
YPH1734 माता ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit एट अल।, 2006
YPH1800 माता ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit एट अल।, 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 माता HIS3 leu2 ura3 ade2 trp1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 यह अध्ययन
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 माता HIS3 leu2 ura3 trp1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 यह अध्ययन
* सभी खमीर उपभेदों Saccharomyces cerevisiae S288C से निकाली गई है।
तालिका 2: इस अध्ययन में इस्तेमाल खमीर उपभेदों।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस तरह हा, Myc, ध्वज, और जीएसटी के रूप में मिलान टैग व्यापक रूप से प्रोटीन की जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। HF-Smt3 और इस तरह के Ndc10 और Ndc80 के रूप में Myc टैग kinetochore प्रोटीन, साथ उपभेदों का निर्माण, ऐसे sumoylation और ubiquitination के रूप में PTMs का पता लगाने की सुविधा है। HF-Smt3 परख नीचे खींच sumoylated kinetochore प्रोटीन, Ndc10 और Ndc80 (चित्रा 1) का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी का उपयोग आत्मीयता शुद्धि प्रोटोकॉल और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण HF-Smt3 और लक्ष्य प्रोटीन के बीच बातचीत की विशिष्टता स्थापित करने, संशोधित प्रोटीन HF-Smt3 बिना नियंत्रण तनाव में नहीं पाया गया है। प्रोटीन substrates पर Myc टैग के उपयोग HF-Smt3 conjugates में sumoylated Ndc10 और Ndc80 की उपस्थिति पुष्टि की। इसके अलावा, Ndc10 और Ndc80 दोनों की sumoylation nocodazole इलाज कोशिकाओं (चित्रा 1C और -1) में कम हो गया था। Nocodazole उपचार के जवाब में Ndc10 की sumoylation में कमीT, लेकिन नहीं Ndc80, पहले Montpetit एट अल। 9 से सूचना मिली थी। इस वजह से प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और एक कस्टम विरोधी सूमो एंटीबॉडी के उपयोग में मतभेद हो सकता है। Kinetochore substrates के sumoylation के लिए हमारे परिणाम एक समान प्रोटोकॉल अन्य उम्मीदवार सूमो substrates के जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सुझाव।

Ubiquitination का पता लगाने के लिए, Myc टैग kinetochore प्रोटीन पहले immunoprecipitated गया और आईपी भिन्न के विरोधी-UB एंटीबॉडी (चित्रा 2) के साथ जांच कर रहे थे। कोशिकाओं Proteasome समारोह (चित्रा 2 बी) को बाधित करने के लिए MG132 के साथ इलाज किया गया जब Ndc10 और Ndc80 की laddering पैटर्न इन प्रोटीनों Proteasome की substrates के हैं यह दर्शाता है कि वृद्धि की गई थी। आईपी ​​भिन्न के विरोधी झंडा या विरोधी Smt3 एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में Ndc10 या Ndc80 की sumoylation पता लगाने में असफल (डेटा) नहीं दिखाया। इस तरह के आईपी अंश या interferenc में sumoylated सब्सट्रेट के स्तर के रूप में तकनीकी कारणों की वजह से हो सकता हैमिलान टैग से ई। ऐसे लवण और पश्चिमी सोख्ता स्थितियों की एकाग्रता के रूप में आईपी प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन हित के किसी भी प्रोटीन की कई PTMs का पता लगाने की सुविधा चाहिए। वर्तमान में, sumoylation सबसे अच्छा उम्मीदवार सूमो substrates के पश्चिमी blots (चित्रा 1) द्वारा पीछा परख नीचे खींच HF-Smt3 ने पता लगाया है।

कई विवरण प्रोटीन शोधन की क्षमता और PTMs पता लगाने की क्षमता प्रभावित करते हैं। सबसे पहले, सभी ट्यूबों निर्दिष्ट के रूप में छोड़कर प्रोटिएजों को बाधित करने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। दूसरा, एक 1: कांच के मोती सेल निलंबन के 1 के अनुपात मनका डिब्बा और / या vortexer द्वारा कोशिकाओं को बाधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की परीक्षा के द्वारा निगरानी की जानी चाहिए। तीसरा, यह नीचे खींच परख या आईपी के लिए एक स्पष्ट lysate तैयार करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। लघु या कम गति centrifugation के lysate में सेल मलबे के प्रदूषण के लिए योगदान कर सकते हैं और इस देते करने की क्षमता को प्रभावित करता हैPTMs सीटी। अंत में, एक 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्पष्ट lysate (लगभग 1 मिलीलीटर) की एक बड़ी मात्रा के साथ मोतियों की जोरदार झटकों के मोती पूरी तरह से नीचे खींच परख या आईपी के लिए निलंबित कर दिया है कि यह सुनिश्चित करता है। सारांश में, इस तरह यहाँ वर्णित है कि के रूप में प्रोटीन शुद्धि और पता लगाने की तकनीक kinetochore प्रोटीन की PTM वफादार गुणसूत्र अलगाव 14, 15 के लिए उनकी संरचना और विधानसभा को प्रभावित कैसे में महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

Tags

सूक्ष्म जीव विज्ञान अंक 99, Kinetochore प्रोटीन Ndc10 Ndc80 Sumoylation Ubiquitination बाद translational संशोधनों प्रोटीन अर्क
Sumoylation और नवोदित खमीर Kinetochore प्रोटीन Ndc10 और Ndc80 की Ubiquitination की जांच की अनुमति देता है कि प्रोटीन शोधन तकनीक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai,… More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter