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Biology

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。

Abstract

このようなリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、およびSUMO化などの翻訳後修飾(PTMを)は、多くのタンパク質の細胞機能を調節します。動原体DNAに関連付ける動原体タンパク質のPTMを、ゲノムの安定性を維持するために忠実な染色体分離を媒介します。このような質量分析およびウェスタンブロット分析のような生化学的アプローチは、最も一般的のPTMの同定のために使用されます。ここで、タンパク質精製法は、サッカロミセス·セレビシエに、Ndc10とNdc80、動原体タンパク質のSUMO化及びユビキチン化の両方の検出を可能にすることが記載されています。ポリヒスチジンFlagタグ付きSMT3(HF-SMT3)およびMyc標識Ndc10またはNdc80を発現株を構築し、私たちの研究のために使用しました。 SUMO化の検出のために、我々は、ニッケルビーズを用いて、HisタグSUMO化タンパク質をアフィニティー精製するためのプロトコルを考案し、SUMO化Ndc10 Aを検出するために抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用しましたND Ndc80。ユビキチン化の検出のために、我々はMyc標識タンパク質の免疫沈降のためのプロトコルを考案し、Ndc10とNdc80がユビキチン化されていることを示すために抗Ubの抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用していました。我々の結果は、彼のフラッグで目的のエピトープタグ化タンパク質はSMT3株は、複数のPTMの検出を容易にタグ付けされたことを示しています。今後の研究では、この技術の利用は、特定のPTMに依存しているタンパク質相互作用を同定し、特徴付けるために許可する必要があります。

Introduction

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それぞれ、標的タンパク質へ;(S.セレビシエ 1 SMT3 SUMO)ユビキチンとSUMO化は、ユビキチンと小さなユビキチン様修飾剤の結合を可能にします。動原体蛋白質のPTMは、忠実な染色体の分離を確実にするために、異なる細胞周期の段階でそれらの細胞レベルおよびタンパク質 - タンパク質相互作用に影響を与えます。例えば、Cse4 / CENP-Aと外側動原体タンパク質DSN1の細胞レベルは、ゲノムの安定性2-5を確保するためのユビキチンを介したタンパク質分解によって調節されています。不正な動原体微小管の添付ファイルの不安定化は、直接微小管6-8と対話DAM1とNdc80複合体をリン酸化するIPL1 /オーロラBキナーゼを必要とします。 70以上の動原体タンパク質の同定にもかかわらず、PTMを、 例えば 、ユビキチンおよびSUMOとのこれらのタンパク質の修飾を調査する非常に少数の研究があります。主な制限は、PTMを維持する能力であります精製およびそのようなSUMO化、リン酸化、メチル化、および他のようなPTMを検出するためのカスタム抗体の不足時にS。 SUMO化動原体タンパク質の特性はNdc10、Cep3は、BIR1、およびNdc80カスタム抗体9を利用ました。さらに、Ndc10は、ユビキチン化10の基質として関与しています。ヒトHec1(S. cerevisiaeにおけるNdc80)も、APC / C-hCdh1 E3リガーゼ11によって規制、ユビキチン化の基質です。したがって、Ndc10とNdc80はSにSUMO化とユビキチン化の両方を検出するためのプロトコルの最適化のための良好な候補でありますセレビシエ

SUMO化の識別を容易にするために、我々は、HF-SMT3とMyc標識Ndc10またはNdc80を発現する株を構築しました。エピトープタグ(HF:のHis6フラッグ)の使用は、頻繁に候補タンパク質に対するポリクローナル血清で観察された交差反応性に背景を最小限に抑えることができます。私たちは、親和性のプロトコルを考案しましたHF-SMT3複合体を精製した後、精製SMT3準備にsumolyated Ndc10とNdc80の存在を検出するために、市販の抗フラッグ及び抗Myc抗体を用いました。ユビキチン化のために、我々はmycタグ動原体タンパク質のユビキチン化を保持する修飾された免疫沈降プロトコルを考案し、Ndc10とNdc80のユビキチン化を検出するために、市販の抗Ubの抗体を用いたウエスタンブロット分析を行いました。

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Protocol

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酵母細胞の1成長

  1. 小さ ​​なフラスコにYPD( 表1)30mlに酵母細胞を接種します。振とうしながら30℃で一晩インキュベートします。
  2. YPD 50mlに600 nmの(OD 600 = 0.2)で0.2の光学濃度に細胞を希釈し、振盪しながら30℃でインキュベートします。
  3. 600 nmの(OD 600 = 1.0)で1.0の光学密度に文化を育てます。
  4. 2,000×gで5分間遠心操作し細胞と上清を捨てます。
  5. 細胞を洗浄するために2,000×gで5分間、40ミリリットル滅菌水と遠心機で細胞ペレットを再懸濁します。上清を捨て、-20℃で細胞ペレットを保存します。

タンパク質の2抽出

  1. またはNi-NTAスーパーフロービーズを用いたプルダウンアッセイの氷冷グアニジン緩衝液(表1)0.5mlに再懸濁細胞を、免疫沈降した( 表1)をバッファ。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。
  2. 2メートルへの転送Lスクリューキャップチューブ。
  3. ガラスビーズの同じ容量( 材料表)を追加します。
  4. 2-3分間氷上に置く、その後、室温で2分間のミニビーズビーター(材料表)で細胞をビーズ破りました。この3回繰り返します。
  5. 30〜60分間、4℃で高速の渦。細胞が溶解されていることを確認するために顕微鏡下で可視化して細胞を確認してください。
    注:溶解した細胞は、暗い幽霊が表示され、境界または規定された形状を欠くであろう。最適細胞の少なくとも80%が溶解されるべきです。
  6. 15ミリリットルコニカルチューブ(スクリューキャップが緩んでなければならない)コレクションに押しピンと場所を使用して、チューブの底に穴を穿刺。
  7. 溶解物を収集するために1分間1000×gで遠心分離します。
  8. マイクロ遠心チューブにライセートを移します。
  9. 4°Cで30分間15,000×gで遠心分離は、抽出されたタンパク質を回収します。
  10. タンパク質ASSAを用いて抽出されたタンパク質の濃度を測定しますYキット( 材料の表)と同量のタンパク質を含有するすべての抽出物を正規化します。適切な緩衝液で1ミリリットルの全容量を持参してください。
    注:総タンパク質の約5 mgを50 OD 600細胞から得られます。
  11. 全細胞抽出物(WCE)として(ステップ2.10から抽出した全タンパク質は、5mgである場合に250μgタンパク質)50μLを保存します。 2×Laemmliサンプルバッファー( 表1)の50μlを添加して、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。負荷ウエスタンブロット分析(第5節:ウェスタンブロット分析)のためのSDS-PAGEゲルの各サンプルを10μl。

HF-SMT3コンジュゲートの3精製

  1. 1分間低速遠心(800-1,500 XG)による実験(サンプルあたりのビーズを100μl)のために必要なのNi-NTAスーパービーズ( 材料表)を取得します。上清を取り除きます。
  2. 反転トップオーバー:洗浄ビーズを1mlのPBS(材料表)で5倍底ビーズを再懸濁されるまで、低速遠心分離によりビーズを収集し、上清を除去します。
  3. グアニジン緩衝液( 表1)1mlのビーズを中断し、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によりビーズを集め、上清を除去します。トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。
    注:トップオーバー底を反転させてよく、ビーズを混ぜます。
  4. のNi-NTAスーパービーズ100μlに:各サンプルについて、(タンパク質の抽出ステップ2.11から)残りのWCEの950μlを添加します。
  5. 少なくとも4時間、または4℃で一晩、ロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。
  6. 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。
  7. 上清(SUP)として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲルにおける負荷10μlの各サンプルを(セクション5:ウェスタンブロット肛門ysis)。
  8. ロッキングプラットフォーム上で5〜10分間、グアニジン緩衝液1mlで一回ビーズを洗浄します。
  9. 洗浄ビーズをロッキングプラットフォーム上で5〜10分間のバッファ( 表1)を破る1mlの5倍。
  10. 2×Laemmliサンプルバッファー90μlの再懸濁ビーズ。
  11. 1 Mイミダゾールの10μlを添加します。
    注:イミダゾールは、イミダゾールとビーズとの間の相互作用を競合に起因したNi-NTAビーズからのHisタグ化タンパク質を解離するのに役立ちます。
  12. 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。
  13. ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。
  14. ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル(:ウェスタンブロット分析セクション5)の各サンプルのロード10-20μL。
    注:WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。

Myc標識動原体タンパク質の4免疫沈降

  1. 抗c-Mycのアガロースアフ​​ィニティーゲルANを取得tibody( 材料表)低速遠心分離(800-1,500 XG)による実験(サンプルあたりの樹脂の25μl)をするために必要な。上清を取り除きます。
  2. 緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X:反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。
  3. 緩衝液A 1mlの樹脂をサスペンドし、処理対象のサンプルに対応する管の数にそれらをアリコート。低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。
    注:トップオーバー底を反転させて十分に樹脂を混ぜます。
  4. 樹脂の25μlに:(タンパク質の抽出ステップ2.11から)残りのWCEの950μlを添加します。
  5. 一晩4℃でロッキングプラットフォーム上でインキュベートします。
  6. 4°Cで1分間800-1,500×gで遠心分離します。
  7. 上清(SUP)として50μLを保存します。 2×Laemmliサンプル緩衝液50μlを添加し、3〜5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。ローウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル(:ウェスタンブロット分析セクション5)の各サンプルの10μlの広告。
  8. 緩衝液A 1mlで洗浄樹脂5X:反転トップオーバーボトム樹脂を再懸濁されるまで、低速遠心分離によって樹脂を集め、上清を除去します。
  9. SUMEBサンプル緩衝液( 表1)100μlの中に樹脂を再懸濁します。
    注:SUMEBサンプル緩衝液を8 M尿素および1%SDS(強い変性条件)を含みます。
  10. 3-5分間ヒートブロックで100℃でインキュベートします。
  11. ボルテックスし、30秒間13,000×gで遠心します。上清を新しいチューブに移します。
  12. ウェスタンブロット分析のためにSDS-PAGEゲル(:ウェスタンブロット分析セクション5)の各サンプルのロード10-20μL。
    注:WCEの5 mgを使用した場合、10〜20μlを、入力の0.5〜1.0ミリグラムに相当します。

5.ウェスタンブロット分析

  1. 4~12%のBis-Trisゲル(材料の表)とPERFにタンパク質抽出物をロードORM電気泳動は、90分間120 Vで(ランニング緩衝液: 材料の表)。
  2. 90分(: 材料の表転送バッファ)、30 Vで転写装置を用いてニトロセルロース膜( 材料表)にゲルからタンパク質を転送します。
  3. 室温で1時間の5%ミルク/ 1×TBST( 表1)で膜をブロックします。
  4. 4℃で一晩、5%ミルク/ 1×TBST中で一次抗体( 材料表)で膜をインキュベートします。千(抗Flagおよび抗Ubの抗体)または1:5,000(抗Myc抗体)一次抗体は、1の希釈を使用しています。
  5. 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。
  6. 室温で1時間、5%ミルク/ 1×TBSTで二次抗体( 材料表)で膜をインキュベートします。二次抗体の希釈5,000:1を使用してください。
  7. 1×TBSTで10分間ずつの膜3回洗浄します。
  8. ECL workiで膜をインキュベートngの溶液( 材料表)5分間。
  9. 青感性X線フィルムに膜( 材料表)を公開し、自動現像機( 材料表)を使用して開発しています。

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Representative Results

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以前9,12に記載されているように動原体タンパク質Ndc80とNdc10のSUMO化を検出するために、HF-SMT3とMyc標識動原体タンパク質(Ndc80またはNdc10)を有する株は、( 表2)を構築しました。 HF-SMT3結合体は、親和性のNi-NTAビーズを用いて精製しました。 HF-SMT3( 図1A及び図1Bに示すよう 、左パネル)を含まない対照株には存在しなかったSUMO基質のSUMO化形態の抗Flag抗体検出を可能と精製HF-SMT3のウエスタンブロット分析。予想されるように、SUMO基質の複数の形態は、HF-SMT3株で検出されました。 Ndc80とNdc10は抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析を行うことにより、精製されたHF-SMT3複合体中に存在している場合我々は、次を決定しました。 Ndc80またはNdc10より高い分子量のものであった複数のバンドがはっきりと( 図1Aおよび図1B、右側パネル)を検出しました。また、Ndc80とNdc10両方の複数のバンドノコダゾール処理細胞( 図1Cおよび1D)に減少しました。これらの結果は、以前9記載のタンパク質の精製およびウェスタンブロット分析は、ここで説明Ndc80とNdc10のSUMO化の検出を可能にすることを示しています。

Ndc80とNdc10のユビキチン化を検出するために、Myc標識Ndc80またはNdc10は(IP)で免疫沈降およびウェスタンブロット分析は、抗Myc及び抗Ubの抗体( 図2)を用いて行きました。全細胞抽出物(WCE)および上清(SUP)の分析は、Ndc80-MycおよびNdc10-Mycの( 図2A)の発現が確認されました。 WCE上の低分子量バンドは分解産物を表すことができます。抗Mycを用いてプローブIPサンプルはNdc80とNdc10のPTMは、が含まれていることを示唆している、複数の高分子量のバンドを示しました。抗Ubの抗体でプローブIPサンプルのラダーパターンがNdc80とNdc10がユビキチン化されていることを示した( 図2A、α-Ubの)。 Ndc80とNdc10のラダーパターンは、さらにこれらのバンドは、ポリユビキチン化を表していることを確認し、プロテアソーム阻害剤(MG132)( 図2B、α-Ubの)で処理することにより増強されました。代表的な結果はNdc80とNdc10両方がSでSUMO化とユビキチン化の基質であることを明らかにしましたセレビシエと記載されるタンパク質精製方法は、SUMO化及びユビキチン化などのPTMの検出に有用です。我々の知識によると、これは、SでNdc80最初の報告でありますヒトホモログHec1のユビキチン媒介タンパク質分解が以前に11を発表したがセレビシエは 、ユビキチン化の基質です。

図1
図1:sumolyated基質の精製は、SUMO基質として動原体タンパク質Ndc80とNdc10の同定を可能にするPr。oteinsを抽出し、HF-SMT3複合体は、SDS-PAGE分離後に調製し、ウェスタンブロット分析により分析しました。 (AB)Ndc80とNdc10がSUMO化されています。タンパク質はYPDにおける対数増殖細胞から抽出しました。左パネル:全SUMO基質は、抗Flag抗体を用いて検出しました。右パネル:抗Myc抗体でプローブしたときにSUMO化Ndc80またはNdc10はHF-SMT3コンジュゲートで検出されました。 (CおよびD)Ndc80とNdc10のSUMO化をノコダゾール処理細胞において減少します。 30℃で2時間、またはDMSO + 20 / mlのノコダゾール(+)( - )YPDで対数的に増殖している細胞は、DMSOで処理しました。 HF-SMT3コンジュゲートは、抗Myc抗体を用いたウエスタンブロット分析によって分析しました。使用同質遺伝子酵母株は、(AおよびC)YPH1800(Ndc80-Mycの)、YMB7862(彼-FLAG-SMT3 Ndc80-Mycの)と(BD)YPH1734(Ndc10-Mycの)、YMB7867(彼-FLでありますAG-SMT3 Ndc10-Mycの)。

図2
図2:動原体タンパク質Ndc80とNdc10のユビキチン化プロトコールに記載のタンパク質および免疫沈降の抽出を行いました。 (A)Ndc80とNdc10がユビキチン化されています。タンパク質はYPDにおける対数増殖細胞から抽出しました。全細胞抽出物(WCE)、上清(SUP)、免疫沈降(IP)画分をSDS-PAGEに供しました。ウェスタンブロットは、それぞれ、抗Myc及び抗Ubの抗体でMyc標識及びユビキチン化タンパク質を検出しました。 (B)Ndc80とNdc10のユビキチン化は、プロテアソーム阻害剤MG132で処理した細胞において増強されます。以前13に記載されているように、30℃で3時間、SDSの0.003%の存在下、またはDMSO + 50μMMG132(+)( - )YPD中で対数的に増殖している細胞をDMSOで処理しました

ソリューション コンポーネント
YPD 1%酵母エキス、2%バクトペプトン、2%グルコース
グアニジンバッファー 0.1 MのTris-HCl pH8.0の、6 M塩酸グアニジン、0.5MのNaCl
緩衝液A 50mMトリス塩酸pH7.5で、50mMのNaCl、0.2%トリトンX-100、1×プロテアーゼ阻害剤
ブレイキング·バッファ pH8.0の0.1 Mトリス-HCl、20%グリセロール、1mMのPMSF
SUMEBサンプルバッファー 1%SDS、8 M尿素、10 mMのMOPS pH6.8の、10mMのEDTA、0.01%ブロモフェノールブルー
2×Laemmliサンプルバッファー 100mMのトリス-HClpH6.8の4%SDS、20%グリセロール、0.2%ブロモフェノールブルー(使用前に200 mMの最終濃度にβ-メルカプトエタノール(BME)を追加)
1×TBST 137 mMの塩化ナトリウム、20mMのトリス塩酸pH7.5で、0.1%のTween-20

表1:ソリューション。

表本研究で用いた2酵母株を*。
遺伝子型リファレンス
BY4741 マタhis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0 オープンバイオシステムズ
BY4742 マタhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0 オープンバイオシステムズ
YMB7278 BY4741 / BY4742 マタhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ウルa3Δ0HF-SMT3 :: LEU2 この研究
YPH1734 MATA ura3-52 lys2-801 ade2-101his3Δ200leu2Δ1trp1Δ63NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit 、2006
YPH1800 MATA ura3-52 lys2-801 ade2-101his3Δ200leu2Δ1trp1Δ63NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit 、2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 マタHIS3、LEU2、URA3、ADE2、TRP1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Mycの:: His3MX6 この研究
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 マタHIS3、LEU2、URA3、TRP1 LYS2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Mycの:: kanMX6 この研究
*すべての酵母株は、サッカロマイセス·セレビシエS288Cから誘導されます。
表2:本研究で用いた酵母株。

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Discussion

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そのようなHA、Mycの、フラグ、GSTなどのエピトープタグは、広くタンパク質の生化学的分析のために使用されます。 HF-SMT3などNdc10やNdc80としてMyc標識動原体タンパク質、を有する株の構築は、SUMO化およびユビキチン化などのPTMの検出を容易にしています。 HF-SMT3アッセイをプルダウンNdc10とNdc80( 図1)、SUMO化動原体タンパク質の検出を可能にします。修飾タンパク質は、HF-SMT3ない対照株では検出されなかったように抗Flag抗体を用いたアフィニティー精製プロトコルおよびウェスタンブロット分析は、HF-SMT3と標的タンパク質との間の相互作用の特異性を確立します。タンパク質基質上のMycタグの使用は、HF-SMT3複合体におけるSUMO化Ndc10とNdc80の存在を検証します。また、Ndc10とNdc80両方のSUMO化は、ノコダゾール処理細胞( 図1Cおよび1D)に減少しました。ノコダゾールtreatmenに応じてNdc10のSUMO化の減少Tが、Ndc80は、以前Montpetit によって報告されたではない。9。これは、実験プロトコルおよびカスタム抗SUMO抗体の使用の違いによる可能性があります。動原体基質のSUMO化のための我々の結果は、同様のプロトコルが他の候補SUMO基質を調査するために使用できることを示唆しています。

ユビキチン化を検出するために、Myc標識動原体タンパク質は、最初に免疫沈降し、IP画分を、抗Ubの抗体( 図2)でプローブしました。細胞はこれらのタンパク質は、プロテアソームの基質であることを示す、プロテアソーム機能( 図2B)を阻害することがMG132で処理した場合とNdc10 Ndc80のラダーパターンが増加しました。 IP画分を抗Flagもしくは抗SMT3抗体を用いたウエスタンブロット分析にNdc10またはNdc80のSUMO化を検出することができなかった(データは示さず)。これは、IP画分またはinterferencでSUMO化基質のレベルのような技術的な理由が原因である可能性がありエピトープタグから電子。そのような塩およびウェスタンブロッティング条件の濃度としてIPプロトコルのさらなる最適化は、目的の任意のタンパク質の複数のPTMの検出を容易にすべきです。現時点では、SUMO化は、最良の候補SUMO基質のウェスタンブロット( 図1)に続いて、アッセイをプルダウンHF-SMT3によって検出されます。

いくつかの詳細は、タンパク質精製の効率とのPTMを検出する能力に影響を与えます。まず、すべてのチューブが指定された場合を除き、プロテアーゼを阻害するために氷上に保持する必要があります。第二に、1:ガラスビーズへの細胞懸濁液の1の比率は、ビーズビーターおよび/またはボルテックスにより細胞を破壊することが重要です。細胞溶解は、顕微鏡下で細胞を検査することによって監視されるべきです。第三に、プルダウンアッセイまたはIPのための清澄化ライセートを調製することは非常に重要です。ショートまたは低速遠心分離は、溶解物中の細胞破片の汚染に寄与することができ、これは、DETEする能力に影響を与えPTMをCT。最後に、1.5ミリリットルマイクロ遠心管に明らかな溶解物(約1ml)の大容量を有するビーズを激しく振盪し、ビーズが完全にプルダウンアッセイまたはIPアドレスのために中断されることが保証されます。要約すると、このようなここに記載されているようなタンパク質の精製および検出技術は、動原体タンパク質のPTMは、忠実な染色体分離14、15のためにそれらの構造およびアセンブリにどのように影響するかに重要なメカニズムの洞察を提供します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

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References

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出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術
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Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

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