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Biology

Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Este manuscrito descreve a detecção de sumoylation e ubiquitinação de proteínas cinetócoro, Ndc10 e Ndc80, na levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento.

Abstract

As modificações pós-traducionais (PTMs), tais como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação, e sumoilação, regular a função de muitas proteínas celulares. PTMs de proteínas cinetócoro que se associam com DNA centromeric mediar segregação cromossômica fiéis para manter a estabilidade do genoma. Abordagens bioquímicas, tais como espectrometria de massa e análise de transferência de western são mais comumente utilizado para a identificação de PTMs. Aqui, um método de purificação de proteínas está descrito que permite a detecção de ambos sumoilação e ubiquitinação das proteínas cinetocoro, Ndc10 Ndc80, e em Saccharomyces cerevisiae. Uma estirpe que expressa polihistidina-Flag-etiquetado Smt3 (HF-Smt3) e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80 foi construída e utilizada para os nossos estudos. Para a detecção de sumoylation, eu inventei um protocolo para purificar por afinidade proteínas sumoylated His-tag usando esferas de níquel e usado western blot com anti-Myc anticorpo para detectar sumoylated Ndc10 umnd Ndc80. Para a detecção de ubiquitinação, que concebido um protocolo para a imunoprecipitação das proteínas Myc-tag e utilizada a análise de Western blot com um anticorpo anti-Ub para mostrar que Ndc10 e Ndc80 são ubiquitinadas. Os nossos resultados mostram que o epitopo marcado com proteína de interesse na sua bandeira-tagged Smt3 estirpe facilita a detecção de vários PTMs. Estudos futuros deverão permitir a exploração desta técnica para identificar e caracterizar as interações proteína que são dependentes de um PTM específico.

Introduction

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Ubiquitinação e sumoilação permitir a conjugação de ubiquitina e modificador pequeno Ubiquitina-like (SUMO; Smt3 em S. cerevisiae 1) para uma proteína-alvo, respectivamente. PTMs de proteínas cinetócoro afectar os níveis celulares e interacções proteína-proteína durante as diferentes fases do ciclo celular para assegurar a segregação cromossómica fiel. Por exemplo, os níveis celulares de Cse4 / CENP-A e proteína cinetócoro exterior Dsn1 são regulados através de proteólise mediada por ubiquitina para assegurar a estabilidade do genoma 2-5. A desestabilização das ligações cinetócoro-microtúbulo incorrectas requer a IPL1 / Aurora B-quinase, que fosforila e Dam1 Ndc80 complexos que interagem directamente com os microtúbulos 6-8. Apesar da identificação de mais de setenta proteínas cinetócoro, há muito poucos estudos que investigam as modificações dessas proteínas com PTMs, por exemplo, ubiquitina e SUMO. Uma limitação importante é a capacidade de preservar a PTMs durante a purificação e a escassez de anticorpos para a detecção de mercadorias, tais como PTMs sumoilação, fosforilação, metilação, e outros. Caracterização de proteínas cinetócoro sumoylated Ndc10, Cep3, Bir1, e Ndc80 utilizou um anticorpo costume 9. Além disso, Ndc10 tem sido implicado como um substrato para ubiquitinação 10. Hec1 Humano (Ndc80 em S. cerevisiae) é também substrato para ubiquitinação, regulamentada pelo APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Portanto, Ndc10 e Ndc80 são bons candidatos para otimização do protocolo para detectar tanto sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae.

Para facilitar a identificação de sumoilação, construiu-se as estirpes que expressam HF-Smt3 e marcada com myc Ndc10 ou Ndc80. O uso de marcadores de epitopo (HF: His6-Flag) minimiza o fundo devido à reatividade cruzada que é frequentemente observada no soro policlonal criado contra uma proteína candidato. Eu inventei um protocolo de afinidadepurificar conjugados HF-Smt3 e, em seguida, utilizado anti-Flag comercial e anticorpos anti-myc para detectar a presença de sumolyated Ndc10 e Ndc80 na preparação Smt3 purificado. Para ubiquitination, eu inventei um protocolo de imunoprecipitação modificado que preserva ubiquitinação das proteínas cinetócoro Myc marcadas e realizadas análises de Western blot com o anticorpo anti-Ub comercial para detectar ubiquitination de Ndc10 e Ndc80.

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Protocol

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1. Crescimento de Células de Levedura

  1. Inoculação das células de levedura em 30 ml de YPD (Tabela 1) em um balão pequeno. Incubar a 30 ° C durante a noite com agitação.
  2. Dilui-se as células até uma densidade óptica de 0,2 a 600 nm (DO 600 = 0,2) em 50 ml de meio YPD e incubar a 30 ° C com agitação.
  3. Crescer a cultura a uma densidade óptica de 1,0 a 600 nm (DO600 = 1,0).
  4. Centrifugar células durante 5 min a 2000 xg e desprezar o sobrenadante.
  5. Ressuspender o sedimento celular em 40 ml de água estéril e centrifugar durante 5 minutos a 2000 x g para lavar as células. Descartar o sobrenadante e o sedimento de células armazenar a -20 ° C.

2. Extracção de proteínas

  1. Ressuspender as células em 0,5 ml de tampão de guanidina arrefecido em gelo (Tabela 1) para o ensaio suspenso usando pérolas de Ni-NTA Superflow ou tampão A (Tabela 1) para imunoprecipitação. Manter tubos em gelo em todos os momentos.
  2. Transferir a 2 ml tubo de tampa de rosca.
  3. Adicionar o mesmo volume de esferas de vidro (Tabela de Materiais).
  4. Conta-bater as células de uma mini-grânulo batedor (tabela de materiais) durante 2 min à temperatura ambiente, depois colocar sobre gelo durante 2-3 minutos. Repita isso três vezes.
  5. Vortex em alta velocidade, a 4 ° C durante 30-60 min. Verificar as células por visualização sob o microscópio para garantir que as células são lisadas.
    Nota: As células lisadas aparece como fantasmas escuros e não têm um limite ou uma forma definida. Optimamente, pelo menos, 80% das células devem ser lisadas.
  6. Perfurar um buraco no fundo do tubo usando um pino do impulso e coloque em uma coleção 15 ml tubo cônico (tampa de rosca deve ser solto).
  7. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para recolher o lisado.
  8. Transferir o lisado para um tubo de micro centrífuga.
  9. Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C para recolher as proteínas extraídas.
  10. Medir a concentração das proteínas extraídas utilizando a proteína assay kit (Tabela de Materiais) e normalizar todos os extractos de conter a mesma quantidade de proteína. Levar o volume total a 1 ml com tampão apropriado.
    Nota: Cerca de 5 mg de proteína total é obtida a partir de 50 OD600 células.
  11. Guardar a 50 ul (250 ug de proteína, se a proteína total extraído a partir do passo 5 é 2,10 mg) como extracto celular total (WCE). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x (Tabela 1) e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).

3. Purificação de HF-Smt3 Conjugados

  1. Obter os grânulos Superflow Ni-NTA (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (100 ul de contas por amostra) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg) durante 1 min. Remover o sobrenadante.
  2. Grânulos lavagem 5x com 1 ml de PBS (Tabela de Materiais): Inverter top-sobre-inferior até que as contas são novamente suspensas, coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
  3. Suspender pérolas em 1 ml de tampão de guanidina (Tabela 1) e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Coletar pérolas por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante. Misture as contas bem invertendo top-over inferior.
    Nota: Misture bem grânulos invertendo top-over inferior.
  4. Para cada amostra, adicionar 950 ul de WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 100 ul de contas de Ni-NTA Superflow.
  5. Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite.
  6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
  7. Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Carga de 10 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Anal Western blotysis).
  8. Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de guanidina durante 5-10 min sobre uma plataforma oscilante.
  9. Lavar as pérolas de 5x com 1 ml de tampão de Rebentamento (Tabela 1) durante 5-10 minutos numa plataforma de agitação.
  10. Grânulos Ressuspender em 90 ul de tampão de amostra Laemmli 2x.
  11. Adicionar 10 ul de 1 M de imidazol.
    Nota: Imidazole ajuda para dissociar a proteína marcada com His a partir das pérolas de Ni-NTA, devido à interacção entre a competir imidazole e os grânulos.
  12. Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos.
  13. Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
  14. Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
    Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado.

4. Immunoprecipitation de Myc-marcados kinetochore Proteínas

  1. Obter anti-c-Myc de afinidade em gel de agarose umtibody (Tabela de Materiais) necessários para os experimentos (25 ul de resina por exemplo) por centrifugação a baixa velocidade (800-1,500 xg). Remover o sobrenadante.
  2. Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
  3. Suspender a resina em 1 ml de tampão A e aliquotar-los para o número de tubos correspondentes a amostras a serem processadas. Recolha resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
    Nota: Misture a resina bem invertendo-bottom top-over.
  4. Adicionar 950 ul da WCE remanescente (a partir do Passo 2.11: Extracção de proteínas) com 25 ul de resina.
  5. Incubar numa plataforma de agitação a 4 ° C durante a noite.
  6. Centrifugar a 800-1,500 xg durante 1 min a 4 ° C.
  7. Economize 50 ul como sobrenadante (SUP). Adicionar 50 ul de tampão de amostra Laemmli 2x e incuba-se a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos. Load 10 uL de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
  8. Lavar 5x resina com 1 mL de tampão A: Inverter cima-baixo-cima até que a resina é ressuspensa, recolher resina por centrifugação a baixa velocidade, e remover o sobrenadante.
  9. Ressuspender a resina em 100 ul de tampão de amostra SUMEB (Tabela 1).
    Nota: tampão de amostra contém SUMEB Ureia 8 M e 1% de SDS (forte condição de desnaturação).
  10. Incubar a 100 ° C num bloco de aquecimento durante 3-5 minutos.
  11. Vortex, em seguida, centrifugar a 13.000 xg durante 30 seg. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
  12. Carga 10-20 ul de cada amostra num gel de SDS-PAGE para análise de Western Blot (Secção 5: Análise de Western blot).
    Nota: 10-20 ul corresponde a 0,5-1,0 mg de entrada, se 5 mg de EOC é usado.

5. Análise de mancha Ocidental

  1. Coloque os extratos de proteínas em 4-12% Bis-Tris géis (Tabela de Materiais) e perfeletroforese orm a 120 V durante 90 minutos (tampão corrente: Tabela de Materiais).
  2. Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose (Tabela de Materiais) usando um aparelho de transferência a 30 V durante 90 min (tampão de transferência: Tabela de Materiais).
  3. Bloquear a membrana em 5% leite / TBST 1x (Tabela 1) durante 1 h à temperatura ambiente.
  4. Incubar membrana com anticorpo primário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma diluição de 1: 1000 (os anticorpos anti-FLAG e anti-Ub) ou 1: 5000 (anticorpo anti-Myc).
  5. Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x.
  6. Incubar membrana com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) em 5% leite / TBST 1x durante 1 hora à temperatura ambiente. Usar uma diluição de 1: 5000 de anticorpos secundários.
  7. Lavar 3x membrana durante 10 min cada com TBST 1x.
  8. Incubar membrana com ECL workisolução ng (Tabela de Materiais) durante 5 min.
  9. Expor a membrana sensível ao azul filme X-Ray (Tabela de Materiais) e desenvolver usando um desenvolvedor automático (Tabela de Materiais).

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Representative Results

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Para detectar sumoilação de proteínas cinetócoro Ndc80 e Ndc10, estirpes com HF-Smt3 e proteínas cinetócoro marcada com myc (Ndc80 ou Ndc10) foram calculados (Tabela 2), como anteriormente descrito 9,12. HF-Smt3 conjugados foram purificados por afinidade utilizando esferas de Ni-NTA. A análise de Western blot de HF purificado-Smt3 com um anticorpo anti-Flag permitiu a detecção de formas sumoylated de substratos SUMO que estavam ausentes na estirpe de controlo, sem HF-Smt3 (Figura 1A e 1B, painel esquerdo). Como esperado, as múltiplas formas de substratos SUMO foram detectados na estirpe HF-Smt3. A seguir, determinado se Ndc80 e Ndc10 estão presentes no conjugado purificado HF-Smt3 fazendo análise de mancha de Western utilizando um anticorpo anti-Myc. Várias bandas que foram de peso molecular mais elevado do que o de Ndc80 ou Ndc10 foram claramente detectados (Figura 1A e 1B, painel da direita). Além disso, várias bandas de ambos Ndc80 e Ndc10foram reduzidos em células nocodazole tratados (Figura 1C e 1D). Estes resultados demonstram que a purificação de proteínas e análise Western blot descrita aqui permitem a detecção de sumoilação de Ndc80 e Ndc10, como previamente descrito 9.

Para detectar a ubiquitinação de Ndc80 e Ndc10, marcada com myc Ndc80 ou Ndc10 foi imunoprecipitada (IP) e a análise por Western blot foi realizada com anti-Myc e anti-Ub anticorpos (Figura 2). Análise de extractos celulares totais (WCE) e sobrenadante (SUP) confirmou a expressão de Ndc80-Myc e Ndc10-Myc (Figura 2A). As bandas de baixo peso molecular no WCE pode representar produtos de degradação. Amostras IP sondadas com anti-Myc mostrou múltiplas bandas de elevado peso molecular, o que sugere que Ndc80 e Ndc10 conter PTMs. Um padrão de laddering amostras IP sondadas com anticorpo anti-Ub mostrou que Ndc80 e Ndc10 são ubiquitinadas (Figura 2A, α-Ub). O padrão de laddering Ndc80 e Ndc10 foram amplificados pelo tratamento com inibidor do proteassoma (MG132) (Figura 2B, α-Ub), confirmando ainda que essas bandas representam poli-ubiqutination. Os resultados representativos revelam que tanto Ndc80 e Ndc10 são substratos para sumoylation e ubiquitination em S. cerevisiae e que os métodos de purificação de proteínas descritos são úteis para a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. De acordo com nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que Ndc80 em S. cerevisiae é um substrato para ubiquitinação, embora proteólise mediada por ubiquitina do homólogo humano Hec1 foi publicado anteriormente 11.

Figura 1
Figura 1: purificação de substratos sumolyated permite a identificação de proteínas e cinetócoro Ndc80 Ndc10 como substratos SUMO Pr.oteins foram extraídos e conjugados de HF-Smt3 foram preparados e analisados ​​por análise de Western blot após separação por SDS-PAGE. (A e B) e Ndc80 Ndc10 são sumoylated. As proteínas foram extraídas a partir de células em crescimento logarítmico em meio YPD. Painel esquerdo: Total de substratos SUMO foram detectados com um anticorpo anti-Flag. Painel da direita: Sumoylated Ndc80 ou Ndc10 foi detectada nos conjugados HF-Smt3 quando sondada com um anticorpo anti-Myc. (C e D) de sumoilação Ndc80 e Ndc10 é reduzida nas células tratadas nocodazole. Logaritmicamente células em crescimento em meio YPD foram tratadas com DMSO (-) ou DMSO + 20 ug / mL de nocodazole (+) durante 2 horas a 30 ° C. HF-Smt3 conjugados foram analisados ​​por análise de transferência de Western utilizando anticorpo anti-Myc. Estirpes isogénicas de levedura utilizadas são (A e C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) e (B e D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-FlAG-SMT3 Ndc10-Myc).

Figura 2
Figura 2:. Ubiquitinação de proteínas cinetócoro Ndc80 e Ndc10 Extracção da proteína e a imunoprecipitação foram realizados como descrito no protocolo. (A) e Ndc80 Ndc10 são ubiquitinadas. As proteínas foram extraídas a partir de células em crescimento logarítmico em meio YPD. Extracto de célula total (WCE), sobrenadante (SUP), e as fracções (IP) imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE. As transferências de Western foram usadas para detectar proteínas marcada com myc e ubiquitinadas com anti-Myc e anticorpos anti-UB, respectivamente. (B) Ubiquitinação de Ndc80 e Ndc10 é aumentada em células tratadas com inibidor de proteassoma MG132. Células de crescimento logarítmico em meio YPD foram tratadas com DMSO (-) ou DMSO + 50 uM MG132 (+), na presença de 0,003% de SDS durante 3 h a 30 ° C, tal como previamente descrito 13

Solução Componentes
YPD 1% de extracto de levedura, 2% de Bacto-peptona, 2% de glucose
Tampão de guanidina 0,1 M de Tris-HCl a pH 8,0, cloreto de guanidina a 6 M, 0,5 M de NaCl
Tampão A 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de NaCl, 0,2% de Triton X-100, os inibidores da protease 1x
Tampão de ruptura 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0, 20% de glicerol, 1 mM de PMSF
Tampão de amostra SUMEB SDS a 1%, 8 M de ureia, 10 mM de MOPS pH 6,8, 10 mM de EDTA, 0,01% de azul de bromofenol
2x tampão de amostra de Laemmli MM de Tris-HCl 100pH 6,8, 4% SDS, 20% glicerol, 0,2% de azul de bromofenol (Antes da utilização: adiciona b-mercaptoetanol (BME) a ​​uma concentração final de 200 mM)
1x TBST 137 mM de cloreto de sódio, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% de Tween-20

Tabela 1: Soluções.

Tabela 2. As estirpes de levedura utilizadas neste estudo *.
Cepas Principal Genótipo Referência
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Abrir Biosystems
BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Abrir Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Este estudo
YPH1734 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit et al., 2006
YPH1800 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATa ura3 Ieu2 his3 ADE2 trp1 HF-SMT3 :: LEU2 NDC80-Myc :: His3MX6 Este estudo
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATa ura3 Ieu2 trp1 his3 Iys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 Este estudo
* Todas as estirpes de levedura são derivadas a partir de Saccharomyces cerevisiae S288C.
Quadro 2: As estirpes de levedura utilizadas neste estudo.

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Discussion

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Marcadores de epitopo HA, tais como, Myc, Bandeira, e GST são amplamente utilizados para análise bioquímica de proteínas. Construção de estirpes com IC-Smt3 e proteínas cinetócoro Myc-tag, como Ndc10 e Ndc80, facilita a detecção de PTMs como sumoilação e ubiquitinação. HF-Smt3 puxar para baixo ensaio permite a detecção de proteínas cinetócoro sumoylated, Ndc10 e Ndc80 (Figura 1). O protocolo de purificação por afinidade e análise Western blot utilizando anticorpo anti-Flag estabelecer a especificidade da interacção entre a IC-Smt3 e proteínas alvo, tal como proteínas modificadas não foram detectados na estirpe de controlo, sem HF-Smt3. A utilização da marca Myc em substratos proteicos valida a presença de sumoylated Ndc10 e Ndc80 nos conjugados HF-Smt3. Além disso, de ambos sumoilação Ndc10 e Ndc80 foi reduzida nas células tratadas Nocodazole (Figura 1C e 1D). Diminuição sumoylation de Ndc10 em resposta a tratament nocodazolet, mas não Ndc80, foi anteriormente relatado por Montpetit et al. 9. Isto pode ser devido a diferenças no protocolo experimental e uso de um anticorpo anti-SUMO costume. Os nossos resultados para sumoilação de substratos cinetócoro sugerem que um protocolo semelhante pode ser usado para investigar outros substratos SUMO candidato.

Para detectar ubiquitinação, proteínas cinetócoro marcada com myc foram imunoprecipitados primeiro e as fracções IP foram sondadas com anticorpo anti-Ub (Figura 2). O padrão de laddering Ndc10 e Ndc80 foi aumentada quando as células foram tratadas com MG132 para inibir a função do proteassoma (Figura 2B), indicando que estas proteínas são substratos da proteassoma. As fracções IP falhou para detectar sumoilação de Ndc10 ou Ndc80 em análise Western blot com anti-Flag ou anti-Smt3 anticorpo (dados não apresentados). Isto pode ser devido a razões técnicas, tais como os níveis de substrato sumoylated na fração IP ou o interference desde os marcadores de epitopo. Além disso optimização do protocolo IP, tal como a concentração de sais e condições de transferência Western deve facilitar a detecção de vários PTMs de qualquer proteína de interesse. Actualmente, é melhor sumoilação detectado pelo HF-Smt3 puxar para baixo de ensaio seguido por Western blot dos substratos candidato SUMO (Figura 1).

Vários detalhes afectar a eficiência de purificação de proteínas e a capacidade de detectar a PTMs. Em primeiro lugar, todos os tubos devem ser mantidos em gelo para inibir as proteases, excepto conforme especificado. Em segundo lugar, uma proporção de 1: 1 de suspensão de células para os grânulos de vidro é essencial para romper as células por o batedor e / ou agitador grânulo. A lise celular deve ser monitorizada por análise das células ao microscópio. Em terceiro lugar, é muito importante para preparar um lisado clarificado para o ensaio de puxar para baixo ou IP. Curto ou centrifugação a baixa velocidade pode contribuir para a contaminação de detritos celulares no lisado e isto afecta a capacidade de detect o PTMs. Finalmente, a agitação vigorosa dos grânulos com um grande volume de lisado claro (cerca de 1 ml) num tubo de centrífuga de 1,5 ml de micro assegura que os grânulos são totalmente suspenso para puxar para baixo o ensaio ou IPs. Em resumo, a purificação de proteínas e detecção de técnicas, tais como os descritos aqui fornecem importantes descobertas mecanísticos sobre como PTM de proteínas cinetócoro afectar a sua estrutura e montagem para o cromossoma fiel segregação 14, 15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Técnica de purificação de proteína que permite a detecção de SUMOilação e Ubiquitination de brotamento Yeast kinetochore Proteínas Ndc10 e Ndc80
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Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

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