Summary
多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。
Abstract
細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。
Introduction
細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。
また、微粒子としても知られている電気自動車は、細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセス1の多様な調節を助けている体液中に見出される小さな膜由来の小胞である。 4 -様々な表面マーカーおよび/ または生物学的物質の直接転写の発現を介して、電気自動車は、細胞間コミュニケーションに2を活性化または抑制の役割のいずれかを再生するためにレシピエント細胞の機能を変化させることができる。他の腫瘍metastaを促進するから、広範な条件に寄与することが示されているが、臨床的に、血小板由来電気自動車は、強力な抗凝固活性5を有することが知られている病気7からの保護にSIS 6。電気自動車は、発電8のサイズやメカニズムに応じて、そのようなエキソソームと微小胞（MVの）などの細胞由来の小胞の小さいカテゴリーに分類することができる。細胞由来の小胞の集団の命名法は、MVSは1,000百大きいながらしかし、エキソソームは、一般的に、形質膜とエンドソームの融合に由来し、小さな、40から100ナノメートルの粒子として記載されている、現在進行中の議論8,9の話題であり続け原形質膜10の脱落によって形成さ以下の粒子。ここで、一般的な用語「電気自動車」とは、細胞によって放出される細胞外の生物小胞の全てのタイプを指すために使用される。
全血からのEVの単離は、多段階の手順であり、多くの異なる処理変数は、保存温度および期間11,12を含む、EVの内容に影響することが示されている、抗凝固剤/防腐剤13を使用し遠心法14を用いた。これらの変数の標準化の必要性は、適切な血液処理とEV分離手順のための血栓止血科学と標準化委員会（ISTH SSC）に関する国際学会勧告15,16につながっている、まだ、最適なプロトコル上の研究者の間でコンセンサスは存在しない12を使用する。最も厳密に制御前分析変数は、正確で再現性のあるデータのために重要であることが同意する。
電気自動車を分析するために、研究者らは、透過型電子顕微鏡17、走査型電子顕微鏡18,19、原子間力顕微鏡、20,21およびウェスタンブロッティング22,23を動的光散乱を含む様々な方法を利用している。 FCMは、多くの研究9,24のための選択の方法であるが-高いスループット能力に起因26、FCMを用いた電気自動車の分析がされている32 -そのサイズと離散正の集団27の欠如に難しいことで知ら。細胞の分析に比べて、必要となる粒子当たりの抗原の少ない数に起因して放出された1）以下蛍光電気自動車結果のサイズが小さく、後染色洗浄2）限られた可能性は、バックグラウンド蛍光を減少させる。研究者の間で共通の課題は、免疫グロブリン凝集体27,28および抗体29の自己凝集から生じる信号を含む。さらに、長い処理時間と現在のプロトコル33,34の多くで使用される長い洗濯/単離方法は、高スループットのアプリケーションに理想的で、それらが少なくなって、少数のサンプルを分析するために、マルチ日の時間のコミットメントを必要とする。一部の研究者は、正確にBACを評価するため、蛍光マイナス1（FMO）と抗体アイソタイプ役に立たないとして伝統的に使用されるFCMネガティブコントロールのレンダリング、完全に洗浄ステップを見送るkground蛍光30。
抗体凝集体および他の非小胞、非結合抗体を除去するのに難しさ、および識別可能な正の集団の不足から生じる信号：我々のプロトコルは、EVの適切なFCM分析を妨げることができる3つの一般的な問題に対処する。ここで説明される技術は、一般に市販の調製物に見られる抗体凝集体を排除する信号対雑音比を増加させると、バックグラウンド蛍光の検出を最小限にする合理的な方法でゲートを設定することで支援する。二つの異なる検出方法がここに提示されている：第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。
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Protocol
注：以下のプロトコルが人間の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインを遵守して行われてきた。すべてのヒト被験サンプルは、治験審査委員会（IRB）承認のプロトコルの下で被験者のインフォームドコンセントを用いて試験した。
1.方法A：個々の検出方法
EVの血液サンプル/単離の1.1）処理
- 以下の2段階の分画遠心プロトコルを使用して（30分以内に最大）直ちにACD-A液1.5 mlまたは他の適当な抗凝固剤及びプロセスを含む2つの10 mlのガラスチューブ中にドナー/患者から血液を引き込む。
注：このプロトコルは、採取した血液の組み合わせ〜17ミリリットルから約10ミリリットル乏血小板血漿（PPP）のが得られます。多かれ少なかれPPPが必要な場合には、採血管の数は、それに応じて調整することができる。 - RTで10分間1500×gでサンプルを遠心軟膜と赤血球から血漿を分離する。軟膜と赤の細胞を含む下層を乱さないように注意しながら、1.5ミリリットル遠心管にプラズマ上清1.2mlのアリコートを転送します。
- 血小板および大型細胞片を除去し、室温で10分間、13000×gでスピン。慎重にペレットを乱さないよう、新しいチューブにPPPを追加するために、200μlの後ろに残して、PPPを転送する。
- この時点で、後の分析のために、最大2つの年（概要については、 図1Aを参照）のために、-80℃で分析したり、新しい1.5ミリリットル遠心管に1.0ミリリットル分量で転送して保存のためにすぐにPPPを使用しています。
- 精製された電気自動車は、機能的実験のために必要な場合、超遠心管にPPPの転送6ミリリットルし、0.2μm濾過したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）28mlを追加します。スイングバケットローターを備えた超遠心機を使用してRT 100,000×gで60分間スピン。上清を吸引し再懸濁EVペル1.5ミリリットルのメディアでみましょう。
注：最高の再現性のために、血液サンプルをドナーにドナーからのように一貫して可能な限り処理されるべきである。 EV分離法における任意の変動が大きく、検出EVの数と種類に影響を与える可能性がある。
1.2）分析のためのサンプルを調製
注：この時点から、ステップは3つのパネルで14マーカーの12個のサンプルを分析するためのハイスループットプロトコルを説明する。しかし、抗体の他の組み合わせは、ここで使用することができる。プロトコルは、関心のあるそれらのために提案マーカーを置換することによって、他のEV集団を研究するために適合させることができる。
- （-80℃で保存した場合）冷凍庫から12のサンプルを取り出し、37℃で解凍。
- ピペットの内容を上下に数回混合する。各サンプルから320μlのを削除し、96ウェルプレートの一番上の行に追加します。
注：幅調節可能なマルチウェルピペットは、このとお尻の多くの他のステップのために非常に便利です一度に複数のサンプルを分析する場合は特に、AY。
1.3）染色EVのサンプル
- 染色前に、陽性シグナルが発生する可能性があり、凝集体を除去するためにすべての抗体（ABS）をフィルタリングする。
- 2分間、室温で固定角度シングルスピード遠心分離機（〜750×gで）を使用して別個の0.22μmの遠心フィルターチューブと遠心分離機に3パネルの各々に使用される抗体を結合、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過するまでと全く抗体液がフィルターの表面上に残っていない。ストアのAb 2週間まで冷蔵庫でカクテルが、再フィルタ使用前に毎回。
- よく行2の各フィルタのAb混合物の適切な量を追加します（ 例えば 、私はそれぞれのAbの2μLで染色されているパネルのサンプルは、そのようにフィルタリングのAbカクテル12μlの合計は、2行するウェルに添加されている）。提案のプレートマップの概要については、図1（b）を参照してください。これらの追加を繰り返します以上のパネルが実行された場合の下の行へのS（ここでは、ウェル4を行にパネルIIIカクテルの3及び11μL/行する8μL/ウェルパネルIIカクテルの追加、特定のパネル情報のための材料リストを参照してください）。
- マルチチャンネルピペットを用いて、上下の行1にPPPのサンプルを混合し、2ミックス上下の行のウェルに、行1のウェルから100μlを移す。ヒントを変更して、繰り返して、30分間の行4℃で3と4のインキュベートに行1から100μLを転送する。
1.4）洗浄MVサンプル
- 4℃から96ウェルプレートを取り外し、生物学的安全キャビネットに移す。マルチチャンネルピペットを用いて、6-8（ステンドPPPを含むウェルを洗浄/すすぎのために使用される）の行に/ウェルのPBS 220μlを添加する。
- 抗体の3つのパネル、12×3 = 36フィルターチューブで、12サンプルについて幅が調整可能なマルチチャンネルピペットを（使用して予め標識遠心フィルターチューブに、各ウェルの内容を転送します）が必要とされる。同じヒントを使用して、洗浄行から200μlのPBSを除去し、PPPがちょうど除去された対応するウェルに追加します。
- アップミックスダウン井戸をすすぎ、PPPが以前に添加した同じフィルタにリンス液を転送する。遠心分離フィルターのクローズトップス。変更のヒント。
- すべての染色のPPP試料は遠心分離フィルターへのリンスソリューションと一緒に転送されるまで、残りの染色したサンプルで、このプロセスを繰り返します。
- RTで3分間850×gで固定されたロータの遠心機とスピンに遠心分離フィルターを転送します。
注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のPPPサンプルが効果的にフィルターを介して移動するために、より長い遠心分離時間が必要な場合があります。 - 遠心フィルターチューブを外し、生物学的安全キャビネットに戻る。マルチチャンネルピペットを用いて、PBS300μlのフィルターのトップを懸濁します。再懸濁内容が即時のFCM解析のためのチューブを標識事前に転送します。
注：これは、サンプル間の変動を避けるために、サンプル間で一貫ピペットプランジャ窪みの力と数を維持することが非常に重要である。これは、理想的にピペッティングし、各サンプルのために特定のボリューム（ 例えば 、280μl）を正確な回数（ 例えば 、8回）上下するようにプログラムされた電子ピペットを用いて行われるべきである。
1.5）サイトメーターのセットアップ
- FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。
- EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。
- 事前に補償ビーズの2滴を追加します。チューブ（各蛍光標識抗体のための1管）標識抗体の、推奨量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。
- PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。
- 楽器に付属のソフトウェアフローサイトメーターを用いて、各補償チューブを実行し、5-十年のログスケールで約10 4で各ピークを配置するために、蛍光電圧を調整します。蛍光ピークは、他のすべてのチャネルと比較して、独自の蛍光チャネルにおいて（最も明るい）が最も高く、かつ必要に応じて再度蛍光パラメータの電圧を調整すること。確実に各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。
- その後選択して "、実験」タブを選択し、「報酬」を、すべてのサンプルに補正値を適用するために「計算補正」を選択します。
- 0.22μmのフィルターPBSのチューブの実行中に、（ すなわち 、単にイベント発生率が5イベント/秒を上回るなる電圧閾値より下）バックグラウンドノイズの大部分を排除し、最も高い値にFSC＆SSC電圧を調整します。
- 必要に応じて、PBSで希釈した1.0μmのビーズ、 - 次に、0.2ミクロンを含むチューブを実行します。 SSCプロット対FCSでは、0.2〜1.0μmの間でイベントをキャプチャするためにビーズ集団の周りにゲートを描きます。また、SSC-Hヒストグラムで、1.0μmのビーズよりも小さいすべてのイベントが含まれるようにゲートを描く。
- 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定します。ビーズチューブ（またはビーズの既知の濃度を含有する他のチューブ）を使用する直前まで、フローサイトメーター上での流量調整ツマミntの速度は約200イベント/秒に達する。同じ流速で、すべてのサンプル管を読み、その流速が実行間の一貫性を維持確保するために将来の実験で同じビーズ濃度を使用しています。
- PBSで希釈した虹の蛍光粒子のチューブを実行します。 5000のイベントを取得します。 FSC、SSC、および各カラーチャンネルの平均強度値を記録します。蛍光強度は、実験間の整合性を保つことを保証するために将来の実験で電圧を調整するために、これらの値を使用してください。
1.6）サンプル読書
- 「LO」（約8〜12μL/分）にサイトメーターの流量を設定し、正確に1または2分間、各サンプルを実行します。
- 最初の読み取りの後、各サンプルに10％のNP-40の20μlを添加、ピペット上下、及びで検出された陽性事象の減算を可能にするために同じ時間（1または2分）再読み込み同じ時間枠で溶解サンプル。
注：それは非常にIMPですサンプルはピペットのではなく、ボルテックスを用いて混合することがortant。我々の経験では、ボルテックスはEV-模倣陽性事象につながる、いくつかの抗体の自己凝集を引き起こす可能性があります。 - 一旦全てのサンプルが読み取られてからFCM解析ソフトウェアを使用してさらに分析するために使用される別のファイルにすべて.fcsファイルを書き出す。
1.7）データ解析
- FCM解析ソフトウェアを開きます。新しい実験ファイルに.fcsファイルをすべてインポートします。
- ビーズのみのチューブを開きます。 SSC-プロット対FSC-Aには、0.2μm程度と1.0μmの間で大きさのすべてのビーズをゲートを描く。これは、EVゲートである。すべてのサンプルに追加するドラッグします。
- 陰性対照として、溶解したサンプルを使用して、使用する各蛍光チャネルにおけるバックグラウンド蛍光の端にゲートを描く。各対応する非溶解サンプルのEVゲートへの蛍光ゲートをドラッグします。
注：この時点で、それはまた、デュアル蛍光双方向パラメータプロットを検討することは有用である。ロケットの形で二重陽性象限凝集または他の小胞模倣事象からアーチファクトを示すことができる、マーカーは無関係の細胞型上に存在することが知られている場合は特に、（ 図8参照）。 - 各蛍光マーカーの場合は、非溶解サンプル内のイベント数から溶解サンプル中のイベントの数を引く。必要に応じて、％正の値を取得するために非溶解されたEVゲート内EVの総数でこの数を割る。
2.方法B：ビーズ法
EVの血液サンプル/単離の2.1）処理
- 方法A（1.1節）に記載の血液処理方法を参照してください。
2.2）分析のためのサンプルを調製
- 必要に応じて、エキソソームと微小胞にPPPまたは超遠心のEVを分画。 0.22μmの遠心フィルターにPPPまたは超遠心EVの250μlを添加して、750 xで固定されたロータの遠心機とスピンに移転RTで2分間グラム。
注：液体がフィルターのトップスに残っていないことを確認してください。遠心分離した後、フィルターを上に残っている目に見える流体層と「ドライ」であることが表示されます。そうしながら、特定のサンプルが効果的にフィルターを介して移動する流体のためにわずかに長い遠心分離時間が必要な場合があります。 - 2ミリリットルでコーティングされていない6μmのポリスチレンビーズ（ 例えば 、負のABCビーズ）RPMI培地で2回、再懸濁を洗ってください。各FACSチューブに6000ビーズを追加します。ネガティブコントロール管に、ビーズに一人でRPMI培地400μlのを追加します。他のすべてのチューブに、PPPまたは超遠心のEV（またはその留分）を200μlとRPMI培地200μlを加える。
- メディア400μlに全てのチューブの最終容量を調整し、シェーカー上、4℃で一晩インキュベートする。
- 翌朝は、メディアの2ミリリットルでビーズを洗浄する。上清を吸引除去する。
- 4＆で3時間培地（400μl）を、5％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックし＃176; Cシェーカー上。
- メディアの2ミリリットルでビーズを洗ってください。 100μlの培地で吸引し、ペレットを再懸濁し。
2.3）染色EVのサンプル
- すべての抗体をフィルタリングします。方法Aで使用したのと同じ抗体のパネルを使用し、又は所望の場合に限り、それらの蛍光色素が互いに互換性があるように、抗体の異なる組み合わせを作成する。
- 0.22μmの遠心フィルターチューブに単一のパネルで使用されるすべての抗体を組み合わせる。 2分間、または抗体の混合物のすべてがフィルターを通過してない抗体液がフィルタの表面に残っていないまで、固定角シングルスピード遠心分離機を用いて遠心機。
- すべてのチューブに濾過抗体カクテルの適切なボリュームを追加し、4℃で30分間インキュベートする。
- フローサイトメーター上でメディア400μlのメディア、再懸濁の2ミリリットルでビーズを洗浄し、すぐに実行（または同じ日以内）。
2.4）セットアップとサンプル読書サイトメーター
- FCMソフトウェアを開きます。 （製造者の指示に従って）機器のセットアップビーズを使用して毎日の機器較正およびセットアップを実行し、セットアップを実験の前に。
- EVサンプルは、複数の抗体で染色されており、複数の蛍光色素を一度に測定する場合、次のように、補正値を算出する。
- 予め標識するための補償ビーズの2滴のチューブ（各蛍光標識抗体のための1チューブ）を追加し、抗体の推奨される量を追加します。染色していない補償制御として使用する別のチューブに負の補償ビーズの2滴を追加します。 PBS400μlのPBSに再懸濁で洗浄し、30分間4℃でインキュベートする。
- FCMソフトウェアを使用して、各補償チューブを実行し、5年間の対数スケールで約10 4における各ピークを配置する蛍光の電圧を調整する。蛍光ピークが他のすべてのチャネルに比べて、独自の蛍光チャネルで（最も明るい）最高であることを確認し、必要に応じて再び蛍光パラメータの電圧を調整します。各個別に染色されたCOMPチューブを実行し、チューブあたり少なくとも5000のイベントをキャプチャします。
- すべてのサンプルに補正値を適用するには、タブ「実験、 "その後"の報酬、「その後」の計算補正」を選択します。
- 規模を記録し、それぞれのサイトメーター（FSC = 200およびSSC = 200）で許可されている最低のしきい値を選択するためのFSCとSSC電圧パラメータを変更します。
- 実行したサンプル、一重ビーズ集団に対するゲートと、このゲートで2000のイベントを取得する。エクスポート.fcsファイル。
- ファイルを.fcs分析するFCM解析ソフトウェアを使用してください。一重ビーズ上のゲート。各蛍光色素のための幾何平均蛍光強度（MFI）を計算し、ネガティブコントロールのMFIと比較。
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Representative Results
図1は 、ビーズベースの方法または個々の検出方法のいずれかを使用してEVの分離および検出のための全体的な処理方式の概要を説明します。 FCMを使用したEVの個々の検出は、より大きな電気自動車の分析に適していますが、ほとんどのサイトメーターは、個別にエキソソームと小さい粒子を検出することができない。ビーズベースのアプローチは、一般的に、表1に概説されるが、この方法を使用することに関連する欠点が存在する、小さな電気自動車が検出することができる電気自動車の分離超遠心分離を使用して（またはスクロース勾配分画法の添加なし）である電気自動車は、機能的アッセイのために必要とされている場合、推奨。超遠心は、血清タンパク質と機能的な実験の成果に影響を与えることができるプラズマ、から他の可溶性の汚染物質を含む不純物を除去する。しかしながら、超遠心分離は、時間がかかり、EVの量と質12を変更することができる。
">二つの検出アッセイのための期待される結果を図2-3に示されている。対応する非溶解サンプルのためのゲート（一番上の行を設定するために使用される個々の検出アッセイ、溶解されたコントロール（下の行、 図2）は、 図2）。イベントの大半は、EVゲート内に入る必要があります。比較して、二つのマーカーは、通常、同じセルで発見されていない場合クアドラントゲートは二重陽性事象を明らかにしてはならない。 図2の右側biparameterプロットは、マーカーCD108aとCD235aを表示、細胞上に共存することが知られている2つの赤血球細胞マーカーである。ここでは、電気自動車には、予想通り陽性事象の半分以上が、両方のマーカーに対して陽性である。同様に、公知の細胞表面マーカーは、同じ細胞上に存在するべきであるCD235aのこの分析では、センターbiparameterプロットは細胞上に共存しないことが知られている2つのマーカーのEVの発現を示す。電気自動車をダブル陽性の類似したパターンを示す（赤する当館dは細胞のマーカー）及びCD41a（血小板マーカー）、電気自動車は、異なる細胞タイプから来るので、予想される別個の、独立した、正の集団を示す。溶解した場合には、正のイベントが消えるはずです。一般に、溶解後に残っている任意の正のイベントは、非小胞、粒子、凝集体、および/ または界面活性剤耐性、電気自動車からの信号の存在を示す。ビーズに基づく検出方法を使用して結果を予想3に示す図 。個々の検出方法とは異なり、これらのデータは、/二パラメータプロットに見るべきではないことはできない。上側ドットプロットでは、正と負の集団間の分離は存在しない、およびイベントは、それらが正常に起因EVの両タイプに結合するという事実のために、同じ細胞型に見出されていなくても、二重陽性の象限に表示され単一のビーズ。ビーズに基づく検出方法では、データは最善の（ドットプロットの下に示されている）を陰性対照とのヒストグラムのオーバーレイを使用して分析される。陽性IマーカーのMFIを用いて測定（平均蛍光強度）および陰性対照と直接比較する。■。試料は、問題のマーカーについて陽性である場合、そのMFIは、陰性対照よりも高い。ビーズ法の陰性対照は、単に同じ抗体で染色し、EV-コーティングされたビーズと一緒に洗浄されたBSAでブロックしたビーズ（無電気自動車を添加しない）である。 2つの方法を使用して、期待される結果の比較を図4に見ることができる。適切にEVの表現型を評価するための個々の検出アッセイの能力は、バックグラウンド蛍光からのAb陽性のイベントを分離するために正しいゲーに大きく依存しています。したがって、最も適切に模倣/所与のサンプルについてのバックグラウンド蛍光を予測ネガティブコントロールを選択することが重要である。染色された電気自動車を読み取る前に洗浄されていない場合、一般的に使用される負の対照（ 例えば 、アイソタイプ）を正確に背景fluorescencを予測することができないすべてのマーカーのためのE（ 図5A）。洗浄がオプションでない場合、これらの場合には、溶解したサンプルは、バックグラウンド蛍光を予測するためにうまく機能する傾向がある。染色された電気自動車（この場合には、遠心濾過を使用して）を読み出す前に洗浄されているときには、陰性対照（アイソタイプ及び溶解したサンプル）の両方がサンプル（ 図5A）のバックグラウンド蛍光を予測するために働く。しかし、注目すべきであるそれらは（ 例えば 、界面活性剤耐性、非小胞関連のイベントおよび/ または凝集体の存在）のサンプルについての追加情報を提供するため、すべての陰性対照」作業は、「溶解されたコントロールが好ましいが、そのこと非EV陽性シグナルをもたらし、不適切にAbの数を膨らませることができます。染色されたサンプルは、アイソタイプ対照抗体で染色した同じサンプルよりも少ない正のイベントは、図5（b）に示すように、また、アイソタイプ対照は、時には、さらに洗浄した試料において、信頼できない可能性がある。 非結合抗体を徹底的に除去することなく、いくつかのEVマーカーのFCMドットプロットは、その高度に蛍光性の背景（ 図6、上のプロット）と区別できない薄暗い蛍光粒子の雲のように見える、解釈することはほぼ不可能である。背景と陽性マーカー信号間の分離は、遠心フィルタを使用して染色したサンプルを強化洗浄（ 図6、下のプロット）。しかしながら、小さなEVやエキソソームは、フィルタの孔を通して失われることがある。
洗剤の溶解工程の使用は、免疫複合体およびタンパク質凝集体21からの正ベシクル模倣事象を明らかにする。 PPPは、個々の検出を用いて分析されたときに、溶解して消滅しない陽性事象に遭遇することはかなり頻繁に起こることである。これらの界面活性剤耐性のイベントは、多くの場合、両方の単一のパラメータとbiparameterプロットのように不審な、高度に蛍光性の対角の信号を表示されます（ 図7）。臨床的には、これらのタンパク質複合体および/ または不溶性の免疫複合体は、関節リウマチ28、ネフローゼ症候群19、および全身性エリテマトーデス29として種々の疾患21、罹患した患者においてより一般的である。そのため、研究の目的に応じて、1つは対角の信号が形成することができるanalysis.Anotherの道からそれらを含めるか、削除することもでき、特に溶解試薬 （ 図8）を添加した後、サンプルをボルテックスすることによってである。試料は常に凝集体の形成を防止するためにピペットで上下に混合されるべきである。
図1：ビーズベースの方法又は個々の検出方法のいずれかを使用して、電気自動車の単離および検出のための全体的な処理方式。 （A）全血をまずPPPに加工される。からPPPは、単離された電気自動車を生成する超遠心分離を用いてさらに処 理されるか、個々の検出またはビーズベースのアッセイにおいてそのまま用いてもよく、再。個々の検出方法を用いてハイスループット試料分析の推奨プレートマップの（B）の概要。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
図2：個々の検出のために期待される結果ドットプロットフローサイトメトリーを溶解し、未溶解のEVサンプルの代表染色を示す。値は正のイベントの割合を示している。事象の大部分は、EVゲート内に入る。右biparameterプロットに示されているイベントは、左のFSC / SSC EVゲート内にある。溶解サンプル（一番下の行）は、EAのための蛍光ベースのゲートを設定するために使用されているchの（非溶解した）サンプルを対応する。比較した二つのマーカーは、通常、同じセルで発見されていない場合にクワッドゲートが二重陽性事象を明らかにしてはならない。ここでは、biparameter CD235aとCD41aプロットは赤血球マーカーを発現するEVや血小板細胞マーカーを発現するものとの間に明確な分離を示す。同様に、同じ細胞上に存在することが知られている細胞表面マーカーは、電気自動車をダブル陽性の同様のパターンを表示する必要があります。右biparameterプロットはCD235a陽性EVの上半分は、二次赤血球（RBC）マーカーCD108a陽性であることを示している。溶解した場合には、正のイベントが消えるはずです。溶解後に残った陽性事象は、非小胞または洗剤性粒子および/または凝集体からの信号の存在を示す。
図3：ビーズベースの検出を使用して予想される結果方法。陰性対照としてBSAでブロックしたビーズと比較したドットプロットは、ビーズに結合された電気自動車の代表的な染色を示すフローサイトメトリー。値は正のイベントの割合を示している。右biparameterプロットに示されているイベントは、左のFSC / SSCビーズゲート内にある。ビーズに基づく検出方法では、データは最善の（ドットプロットの下に示されている）を陰性対照ヒストグラムオーバーレイを用いて分析する。陽性マーカーのMFIを用いて測定（平均蛍光強度）および陰性対照と直接比較される。
図4：ビーズを使用して期待される結果との比較対個々の検出フローサイトメトリープロットは個々の検出（下の行）を使用して分析する電気自動車に比べて、ビーズ（一番上の行）に結合されたEVの代表染色を示す点在しています。イベントプロットは左のFSC / SSCビーズゲート内にあるbiparameter右に示す。
図5：個々の検出分析の異なるネガティブコントロールの比較値は、陽性事象の割合を示している。示すイベントは、FSC / SSCのEVゲート内にある。洗っていない対中ネガティブコントロールの（A）比較のサンプルを洗浄した。アイソタイプまたは溶解されたコントロールは、完全に染色された試料（下列）、2つの異なるマーカーにわたってバックグラウンド蛍光の適切な表示を提供するそれらの能力について評価した。各マーカーのゲイツ溶解サンプル（一番上の行）を使用して作られ、その後の下の行にコピーされました。洗浄した試料を、後の染色濾過を用いて洗浄した。サンプルの染色のWiよりも正のイベントを有するアイソタイプ対照で染色した試料の（B）の例実際の抗体を番目。
図6：個々の検出におけるポスト汚れ洗浄の効果値は、陽性事象の割合と数字を示しています。示すイベントは、FSC / SSCのEVゲート内にある。 各サンプルのゲートは、各サンプルの溶解されたカウンターパート（;洗浄されたサンプル対未洗浄でゲート·設定の前の図を参照して示されていない）を用いて行った。高いバックグラウンド蛍光がネガティブイベント困難（上のプロット）からポジティブを区別します。洗浄したときに、未結合の蛍光抗体が除去され、バックグラウンド蛍光が（下のプロット）が低減されるように、しかし、陽性集団が明らかにされる。
図7：洗剤溶解は、非EV sの存在を確認する示さignals。イベントには、FSC / SCCのEVゲート内にある。値は正のイベントの割合を示している。染色されたEVサンプル前（左の列）が読み出され、界面活性剤（右欄）を添加した後、免疫複合体および他の非EV関連事象によって引き起こされる陽性シグナルを識別する。
図8：ボルテックスは、非EV信号の出現を引き起こし示すイベントがFSC / SCCのEVゲート内にある。。値は正のイベントの割合を示している。染色されたEVサンプルを前（左列）および界面活性剤（右欄）を添加した後に読み取った。サンプルを混合するために渦を使用すると、EV-模倣、対角集団が（一番上の行）を形成することがあります。穏やかにピペットを用いて、ダウン混合されたとき、しかし、これらの集団の形成は、（下の行）を回避することができる。ボルテックスは、それが、LEAいくつかのサンプルで凝集を引き起こす可能性がありますように、混合のために推奨されていません対角に見える、陽性の集団に丁。一般的には、正のゲート内のイベント数が溶解した後増加べきではありません。
| ビーズに基づく検出 | 個々の検出 | |
| EVサイズ | のみ<100 nmのために推奨 | > 100 nmのために推奨のみ |
| 時間 | 一晩のインキュベーションを必要とする | 1日<で完了することができます |
| 感度 | クラスタ検出 | 単一粒子の検出 |
| その結果 | 質的 | 定量的な |
| 洗濯 | シンプルな、標準の遠心分離 | 遠心フィルターを必要とし |
| 負の制御 | BSAでコーティングしたビーズ | 溶解したサンプル |
表1：両方の検出方法の長所と短所。
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Discussion
EVの単離、処置および分析のための2つの異なるプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示された。使用する最も適切な方法を選択することは必ずしも容易ではなく、興味のある個々の亜集団と同様にテストされているサンプルを理解する必要があります。最も適切な方法を選択する際にさらに、取得のために使用されるサイトメーターの感度を考慮しなければならない。多くの場合ではなく、メソッドの組み合わせは単独のいずれかの方法よりサンプルに関する詳細な情報を提供し、使用するための単一の最良のプロトコルがありません。理想的には、いくつかの異なる単離および検出技術は、特定のEV集団が研究されてに関してパフォーマンスサイトメーター考慮個体にかかるテーラードプロトコルを開発するために最初に評価されるべきである。代替分離技術は、超遠心分離、ショ糖密度分画、免疫磁気Bを含むEAD分離、クロマトグラフィー、およびアフィニティー精製12、代替の検出方法は、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡法、動的光散乱、及びウェスタンブロッティング8を含んでいる。異なる技術を組み合わせることで、ここに提示される方法は、関心のある様々なEV集団を研究するための最適なプロトコルを作成するために適合させることができる。
一般的には、FCMを使用してEVの個々の検出は、より大きな電気自動車の分析に適していますが、電気自動車が小さくなるように感度を失う。個々の検出は、より大きな電気自動車の検出に、より一貫性ですが、ビーズベースの検出は、より大きなEVやエクソソームのためのより高感度の検出において感度が低い。大きな電気自動車は、ポスト染色濾過により容易に洗浄し、FCMを介して単独で検出することができる。小さいEVやエキソソームは、他の一方で、FCMを使用して、個別にも検出され、はるかに困難後染色を洗浄するためにあるされていません。ビーズキャプチャープロトコルは、電気自動車を簡単に洗浄するために、複数の電気自動車は、FCMによって検出可能な大きな正の信号を作成するために一緒に測定することができるように、これらの問題の両方を解決します。しかし、 表1に概説されるように、この方法を使用することに関連する欠点がある。
感度の低いサイトメーターを使用する場合は、個々の検出のための容量が限られている。 EV分析の前に、フローサイトメーターの感度は0.1〜1.0ミクロンの範囲のビーズサイズの混合物を使用して決定されるべきである。 1.0ミクロン未満の粒子の大部分を検出するためのフローサイトメーターの故障は、ビーズベースのプロトコルの使用を必要とするであろう。高度に発現されるマーカーは、容易にどちらのプロトコルを使用して検出される。蛍光の明るさ、サンプルのEV：ビーズrは稀集団は時々単一粒子検出プロトコルではなく、ビーズ捕捉プロトコルを使用して検出することが容易であるが、これはこのような変数に依存して変化し得るatio、希少細胞表面マーカーを保有するEVのサイズ。単一粒子上の複数のマーカーの検出は、個々の検出方法の使用を必要とする。ビーズに基づく方法は、個々のEV検出することができない。個々の検出方法は、より定量的なデータを与えるつつ、ビーズベースのプロトコルは、本質的に、より定性的なデータが得られる。
電気自動車は、ダウンストリームアプリケーションのために必要とされるたびに追加の分離技術を利用しなければならない。血漿中の可溶性血清タンパク質が機能的な実験の結果に影響を与えることができるので、機能的アッセイにおいて使用される電気自動車は、3段の差動遠心分離プロトコルを用いて遠心分離されるべきである。この追加されたステップは、EV質と量に影響を与える可能性があるため、電気自動車の特徴付けのために、しかし、超遠心分離は、粒子12に与え、大きな力に、お勧めしません。
個々の検出プロトコルは、sが含まれているを含む高スループット試験用に最適化されたeveral重要なステップ、：アブ凝集体によって引き起こさ陽性事象を迅速かつ効果的に除去するための遠心分離フィルターの1）の実装、2）超遠心分離またはショ糖勾配画に、より実用的な代替としてのフィルタの使用EVサンプルポスト染色、および非電気自動車に起因する正のイベントを明らかにしたが、描画のための負の集団からポジティブ区別するために、バックグラウンド蛍光の良好な近似を提供するだけではなく、陰性コントロール、などの界面活性剤溶解の3）利用から未結合の抗体を洗浄するためのゲート。個々の検出プロトコルは、それが一日で行うことができるように、ビーズに基づく方法は、一晩のインキュベーションを必要とするのに対し、多数のサンプルが、テストを必要とするたびに推奨される。
各プロトコルにおける陰性対照は、異なる利点及び使用される検出方法に依存して欠点を有する。ビーズベースαを使用することの一つの利点ssayは、同一のモノクローナル抗体は、負および正のチューブに使用することができ、同一の陰性対照は、すべてのサンプルに使用することができることである。個々の検出方法は、一方では、試験した各試料について読み取られる個別の制御を必要とする。個々の検出プロトコルで使用されるネガティブコントロールは、追加の抗体の使用/消費を必要としませんが、各チューブが溶解剤添加後の二回目を読んですることを要求ん溶解したサンプルを、使用しています。溶解されたコントロールは、免疫複合体21の非小胞関連のイベントに起因する正のシグナルの比率を特定することができるという付加的な利点を有する。ビーズベースアッセイは、真陽性のEVから生じる信号と非小胞から生じるものとの間にこの能力のtodistinguishがありません。
技術の限界
EVの単離のための標準化された方法は存在しないが、差動遠心分離は、EVの研究者の間で広く使われている手法である。ここで説明した差動遠心分離法は、10〜30分間10,000-13,000 XGとの間に2回目の遠心分離に続いて、通常、細胞を除去するために10〜20分間1,200-1,500 XGとの間の最初の遠心分離を必要とするPPPを、単離するための一般的なプロトコルに基づいています血小板35を削除する。ここに記載されているプロトコルは、10分間13000×gで遠心分離し、続いて10分間1500×gで遠心分離を使用しています。 25,000〜100,000×gでのより高い力が、典型的には電気自動車をペレット化するために必要とされるが、より大きな電気自動車のいくつかは、我々が提示した分画遠心分離プロトコルを用いて除去することができる。
FCMによって検出された電気自動車の90％まで100,000×gで（データは示していない）で1時間超遠心分離して失われる。この悪影響サンプルの組成に影響を与える可能性がある、より長い遠心時間が、慎重にもかかわらず、考慮されるべきである。追加の処理はF必要な場合または特徴付けの研究は、濾過は、さらに粒子サイズに基づいて、サンプルを分画する（染色前）2段階の遠心分離後に行うことができる。超遠心分離と同様に、濾過は、ポジティブマーカーのイベントの50％までが失われることができ、FCMによって検出された全粒子の90％まで（データは示さず）。信号対雑音比の増加が明らかに有益であるが、任意の洗浄または単離する方法を考慮するとき、より小さな電気自動車の損失は重大な制限を表す。
最後に、採血時に（例えば 、ヘパリン、ACD、エチレンジアミン四酢酸（EDTA））を用い、抗凝固は、EVコンテンツの質と量に影響を与える可能性がある。 ACDは我々の研究のために良いと信頼性の高い抗凝固剤であることが証明されているが、複数のソリューションをテストすることは、アプリケーションに最も適した抗凝固剤が選択されることを確実にすることをお勧めします。電気自動車は、下流アッセイにおいて使用される場合に特に重要であるどこで使用される抗凝固剤は、結果に影響を与えることができます。例えば、いくつかの抗凝固剤（ 例えば 、EDTAおよびヘパリン）は、他の（ 例えば 、テオフィリン、アデノシンおよびジピリダモール）は、血小板12からEVの放出を阻害することが示されているが、PCR反応を妨げることが知られている。
かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。最終的には、電気自動車を分析するための最良の方法は、研究が行われて研究者に利用可能なツールに依存します。
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Disclosures
著者らは、開示することは利害関係のない。
Acknowledgments
著者は、機器の設定、フローサイトメーターとの彼の助けのための血液システム開発センターからデイルHirschkornに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成金HL095470とU01 HL072268と国防総省の契約W81XWH-10-1-0023とW81XWH-2から0028によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
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