Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Самоорганизация сложных двумерных фигур из одноцепочечной ДНК Плитка

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52486
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Introduction

Предыдущая нуклеиновой кислоты самосборка работа 1-25 привел к успешному строительству различных сложных структур, в том числе ДНК 2 - 5,8,10 - 13,17,23 или РНК 7,22 периодическая 3,4,7, 22 и алгоритмическое 5 двумерные решетки, ленты и трубки 10,12 4,12,13, 3D кристаллы 17, 11 и многогранники конечными, 2D форм 7,8. Особенно эффективный метод ДНК-оригами scaffolded, в результате чего один эшафот нить сложена многими коротких вспомогательных цепей основных сформировать сложную форму 9,14 - 16,18 - 21,25.

Мы недавно сообщили, способ построения дискретных наноструктур с заданными 2D форм с использованием одноцепочечной плитки (SST), и продемонстрировал структуры со сложностью, сравнимой с ДНК-оригами 26. Это статьи обе адаптация нашей более ранней работе 26 и подробно описывает протоколы для организации индивидуально адресуемых SSTs в сложных конечных 2D форм с четко заданных размеров (длины и ширины) и морфологии. Одним из ключевых преимуществ метода SST является ее модульность. Каждый компонент ССТ структуры служит модульный блок строительства в сборке, а также различные подмножества этих ТПМ производить различные формы. Таким образом, мы установили общую платформу для построения наноструктур с заданными размерами и формами из коротких, синтетических нитей ДНК.

ТПМ содержит четыре области, каждая длиной 10 или 11 нуклеотидов (рис 1а). В ТПМ связать таким образом, что их параллельные спирали создать решетку ДНК удерживаемых вместе кроссовера связей. Каждый кроссовер фосфата между доменами 2 и 3. Фосфат растягивается искусственно на схемах для наглядности. Кроссоверы расположены два спиральных витков (21 баз) друг от друга (<сильный> 1В). Композитные прямоугольники называются по своим размерам в количестве спиралей и спиральных витков. Например, прямоугольник, что шесть спиралей в ширину и восемь витков спирали длиной ссылаются как 6H × 8Т прямоугольника. ТПМ могут быть опущены, добавляться или иначе переставить, чтобы создать структуры произвольных форм и размеров (рис 1в). Например, прямоугольная конструкция может быть свернута в трубку с нужной длины и радиуса (рис 1D).

В качестве альтернативы, прямоугольная ССТ решетки можно рассматривать как молекулярный холста из SST пикселей, каждый 3 нм 7 нм. В этом исследовании мы используем молекулярную полотно 310 полнометражных внутренних ТПМ, 24 ТПМ полнометражные составляющие левой и правой границы, и 28 половинной длины ТПМ, образующие верхние и нижние границы. Холст имеет 24 двойных спиралей ДНК, связанные с кроссоверов, и каждый спираль содержит 28 витков спирали (294 оснований) и, следовательно, называют24H × 28T прямоугольной холсте. 24H × 28T холсте имеет молекулярную массу, аналогичную из ДНК-оригами структуры, созданной из фага М13 эшафот.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ДНК последовательность дизайн

  1. Используйте программное обеспечение UNIQUIMER 27 проектировать SST-конечное структуру, указав количество двойных спиралей, длин верхней и нижней спирали для каждой двойной спирали, и образец кроссовера создать 24H × 28T холсте. После определения этих параметров, общая архитектура (нить состав и расположение комплементарность) показано графически в программе.
  2. Создание последовательностей для нитей заданной структуры для удовлетворения расположение дополнительности и дополнительные требования (если таковые имеются). Дизайн последовательностей ДНК путем минимизации симметрию последовательности 28 (для большинства структур).
    1. Создание нуклеотидов (А, С, G и T) случайным образом по одному.
    2. Соответствие нуклеотиды, комплементарные тем, генерируется по правилу спаривания оснований: Т и наоборот; С до G, и наоборот.
    3. Не используйте повторяющиеся сегменты за восемь или девять нуклеотидов. Когда такой представительесть сегменты появляются во время проектирования, мутировать наиболее недавно сформированные нуклеотидов до требование повторения сегмента не выполняется.
    4. Не используйте четыре последовательных A, C, G или Т баз.
    5. Используйте предварительно указанные нуклеотиды в точках одноцепочечных сцепления (например Т и G, как двадцать первой и двадцать второй нуклеотидов, соответственно, для большинства из нитей), чтобы избежать скольжения баз вокруг точек сцепления (например, если оба двадцать первого и двадцать второй нуклеотиды были T, это было возможно для двадцать первого нуклеотида связываться с нуклеотида, что двадцать второй нуклеотид должен связываться с).
  3. Изменение последовательности ДНК вручную стрептавидин маркировки, трансформации прямоугольников в пробирки, формирование различных прямоугольников и труб в различных масштабах, и для предотвращения агрегации, вызванной подверженных доменов на SST.
    1. Заменить открытые домены на границе молекулярной холсте с поли-Т TRACTS.
    2. Для стрептавидин- маркировки, дизайн сегменты ручку (дополнительную сегмента добавляется в компонент цепи, которые могут связываться с комплементарной коллегой, такие как анти-ручки нити) такие, что они могут разместиться анти-ручки прядь с 3 'модификации биотина.
    3. Для превращения прямоугольника в трубку, удалить верхние и нижние строки из прямоугольника и вставить новую строку которого ТПМ есть определенный взаимодополняемости в соответствующих плитки на второй верхней строке и второй нижней строке.
    4. Для открытой одноцепочечной области различных форм, заменить поли-Т сегментов 10-11 нуклеотидов длиной, или покрытия с защитой кромок, которые являются комплементарными к открытой области, и заканчиваться 10-11 нуклеотидов длинных сегментов поли-T.

2. Подготовка молекулярной Canvas

  1. Получить компонент нити ДНК указанных последовательностей, растворенных в РНКазы свободной воды из oligonucleotiде производителем в V нижних 96-луночных с олигонуклеотидов, синтезированных на 10 нмоль шкале со стандартным обессоливания. Центрифуга также пластины 96 с нитями ДНК примерно за 10 с при 600 х г.
    1. Пипетка 1 мкл из каждой из лунок с 362 нитей ДНК для 24H × 28T прямоугольника (фиг.3А) при 100 мкМ на нити (производитель спецификации) в 2 мл пробирку. Добавить 138 мкл дистиллированной деионизированной Н 2 О в 2 мл пробирку с получением концентрированного раствора в нити смеси в концентрации 200 нМ в цепи.
  2. Добавьте 50 мкл 200 нМ маточный раствор из нитей смеси 10 мкл 10X буфера А отжига (50 мМ Трис, рН 7,9, 10 мМ ЭДТА, 250 мМ MgCl 2), и 40 мкл дистиллированной деионизированной Н 2 O до 0,2 мл ПЦР трубки. Это делает 100 мкл пробы молекулярного холста в 1X отжига буфера А (5 мМ Трис, рН 7,9, 1 мМ ЭДТА, 25 мМ MgCl 2).
  3. Отжига SAMPLе течение 17 ч в термоциклере охлаждения от 90 ° С до 25 ° С. Программа термоциклер следующим образом: снижает частоту от 90 ° C до 61 ° C с постоянной скоростью 5 мин на ° C; снижает частоту от 60 ° C до 25 ° C с постоянной скоростью в течение 20 мин на ° C; и инкубируют при 4 ° С, пока образец не может быть выведен из термоячейке.
  4. Приготовьте родной 2% агарозном геле.
    1. Мера 2,4 г агарозы в 600 мл химический стакан. Добавить 120 мл 0.5X TBE буфере (44,5 мМ Трис-борат, рН 8,3, 1 мМ ЭДТА) и 30 мл дистиллированной деионизированной воды в химический стакан.
    2. Микроволновая печь в течение 3 мин (или 40 - 60 сек более после кипячения). Пополнение потери воды при испарении путем добавления 30 мл воды, что помогает поддерживать концентрацию агарозы в геле на уровне 2%.
    3. Вихревой содержимое стакана в течение 1 мин в бане с холодной водой. Добавить 1 мл 1,2 М MgCl 2 (чтобы концентрацию 10 мМ MgCl 2 в геле) и предварительно окрасить гель остроумиеH 6 мкл SYBR безопасной красителя (1: 20000).
    4. Вылейте гель решение в коробке сухой гель и вставьте 1,5 мм 12 а гель-электрофореза гребень. Дают раствору затвердеть в течение 15 - 30 мин на ровной платформе.
    5. Налейте гель рабочего буфера (44,5 мМ Трис-борат, рН 8,3, 1 мМ ЭДТА, и 10 мМ MgCl 2) в коробку геля. Нагрузка 2 - 3 мкл 1 кб ДНК лестницы в лунку агарозном геле. Смешайте 4 мкл 6X бромфенолового синего красителя (0,25% бромфенолового синего, 5 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ MgCl 2 и 30% глицерина) с 20 мкл образца молекулярной холста и загрузить решение в другой скважине агарозном геле.
  5. Запуск родной 2% агарозном в течение 2 ч при 100 V в бане с ледяной водой (бромфенола синего, показанном на синий, работает быстрее, чем компонент нитей, так что может служить индикатором, что если 2 ч время работы уместно).
  6. Изображение геля с использованием сканера гель с соответствующим фильтром для SYBR безопасной пятна (фиг.2В
  7. На синего света трансиллюминаторе, вырезать доминирующую группу с аналогичным мобильности полосы 1500 пар оснований 1 кб ДНК лестницы, используя острый чистый лезвие. Поместите нужный кусок геля (ы) в колонке спина, а затем разгромить гель на мелкие части, используя микропробирку пестик. Центрифуга при 438 мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
  8. Измерить концентрацию ДНК с использованием ультрафиолетового спектрофотометра при длине волны 260 нм.
    1. Используйте 2 мкл сверхчистой ДНКазы / РНКазы дистиллированной воды, заготовка для калибровки машины.
    2. Использование эквивалентный объем собранного образца из колонки спина, чтобы получить оценку концентрации ДНК. Измеренное значение концентрации ("" = нг / мкл), полученные при УФ поглощению на длине волны 260 нм поможет определить коэффициент разбавления для АСМ и ПЭМ изображения.
    3. Преобразование измеренной концентрации от "а" (нг / мкл), чтобы "б" (нМ) после б = × 10 6 / (330 &# 215; число нуклеотидов).
      Примечание: Молекулярная масса нуклеотида 330 г / моль. Рассчитывается молярное значение концентрации будет определить коэффициент разбавления для АСМ и ПЭМ изображений. Как в случае с 24H × 28T прямоугольника, общая измерения для очищенной пробы составляет около 10 - 60 нг / мкл. В число нуклеотидов для такой структуры 14616 Да, молярная концентрация составляет примерно 2 - 12 нм. Конечная концентрация определяется выходом сбора (~ 20 - 50%) от центрифугирования и объема полосы гель вырезали (чем больше объем, тем более разбавленной очищенного образца).

3. Атомно-силовая микроскопия изображений

  1. Лупиться слюду, прикрепленный к металлической образец диска с помощью скотча, чтобы получить плоскую поверхность и поместите образец диска на этапе визуализации.
  2. Добавить 40 мкл 1X буферного отжига А затем 5 мкл (2 - 5 нм) очищенного образца 24H × 28Tпрямоугольник на свежем сколе слюды. Разрешить смесь урегулировать в течение примерно 2 мин.
  3. Установите АСМ нитрида кремния кантилевера чип на держатель кантилевера. Используйте треугольный наконечник C (резонансную частоту, F 0 = 40 - 75 кГц; пружины K = 0,24 Нм -1) для визуализации.
  4. Изображение образец в режиме жидкости разговоров. Используйте следующие параметры изображения для сканирования: сканирование размер 2 мкм, 1024 линий для разрешения, и скорость сканирования 0,5 - 1 Гц (рис 2С).
  5. Если необходимо, добавить 10 мкл или более 10 мм раствор NiCl 2 чтобы повысить прочность ДНК-связывающего слюды 29.

4. Подготовка проб для маркировки Стрептавидином

  1. Вручную дизайн 24H × 28T прямоугольника таким образом, что ручка пряди на определенных местах включены, чтобы быть дополнением к анти-ручки нитей с модификацией биотином, которые в свою очередь способны связываться с streptavidв частности.
    1. Изменить молекулярную полотно присоединение ", сегмент 3 17 нуклеотидов, состоящую из последовательности нуклеотидов двух (TT) в качестве разделителя и 15 нуклеотидов ручку (GGAAGGGATGGAGGA) к 14 плиток в верхнем ряду и 14 плиток на дне строка прямоугольника (рис 3а) для обозначения границы. Эта последовательность комплементарна 3 'биотин модифицированной анти-ручки нити (TCCTCCATCCCTTCC-биотин).
  2. Для внутреннего маркировки, прикрепить 3 "17 нуклеотидов сегмент 8 внутренних плитки и плитки 6 граничных прямоугольника (рис 4а).
    1. Смешайте 28 прядей с ручками (краевой) маркировки с остальными составными прядей 24H × 28T прямоугольника (334 прядей), чтобы сделать 200 нМ маточного раствора. Смешайте 14 прядей с ручками (внутренние маркировки) с остальной частью компонентов прядей 24H × 28T прямоугольника (348 прядей), чтобы получить 200 нМ маточного раствора.
  3. Для боundary маркировки, добавить 50 мкл 200 нМ маточный раствор из нитей, 6 мкл 100 мкМ биотина изменены анти-ручки нитей, 10 мкл 10X буфера А отжига и 34 мкл дистиллированной деионизированной водой до 0,1 - 0,2 мл ПЦР пробирки. Конечная концентрация компонента нити 100 нМ, а конечная концентрация анти-биотин ручка модифицированной нить 6000 нМ. Следует отметить, что 28 молекулы анти-биотин обработки модифицированного нити связываются с 24H × 28T прямоугольника так анти-биотин обработки модифицированного нити превышает 100%, чтобы сделать связывание благоприятным.
  4. Для внутреннего маркировки, добавить 50 мкл 200 нМ маточный раствор из нитей, 3 мкл внутреннего анти-биотин обработки модифицированного нити на 100 мкм, 10 мкл 10-кратного буфера А отжига, 37 мкл дистиллированной деионизированной водой до 0,1 - 0,2 мл ПЦР пробирки. Конечная концентрация компонента нити 100 нМ, а конечная концентрация анти-биотин ручкой modifi ред прядь 3000 нМ. Обратите внимание, что 14 молекул анти-ручка биотин изменены нити связываются с 24H × 28T прямоугольника так анти-биотин обработки модифицированной цепи превышает 100%, чтобы сделать обязательным благоприятным.
  5. Отжиг образцов в обе термоциклере в течение 17 ч, используя шаги, описанные в разделе 2.3.
  6. Приготовьте родной 2% агарозном геле, как описано в шагах 2,4.
  7. Очищают как образцы, как описано в шагах 2.5.
  8. Измерьте концентрации желаемых структур ДНК, как описано в шагах 2.6.

5. Атомно-силовая микроскопия Для Стрептавидином маркировки

  1. Изображение каждый образец с использованием АСМ, как описано в шаге 3 (фиг.3В и 4В).
  2. После первого раунда изображений, добавить 40 мкл 1X буферного отжига А затем 1 мкл стрептавидина на 10 мг / мл в образце. Разрешить смесь урегулировать в течение примерно 2 минут до reimaging (цифры 3C и 4C).
_title "> 6. Преобразование прямоугольника в трубку

  1. Для разработки трубку на основе прямоугольника, сохранить все составные ТПМ в месте, за исключением верхней и нижней строк. Введение новой строки которого ТПМ разработаны путем конкатенации верхние и нижние половины плитки их соответствующих столбцов с образованием циклического исходного прямоугольника в трубку конформации (фиг.5А).
  2. Смешайте новую строку нитей (14 прядей) с составных прядей 24H × 28T прямоугольника исключением верхних и нижних рядов (336 прядей), чтобы получить 200 нМ маточного раствора.
  3. Следуйте очистка гель шаги 2.2 - 2.7 (рис 5б).

7. Трансмиссия электронный микроскоп изображений

  1. Взвешивают 0,06 г формиата уранила в 3 мл дистиллированной воды, чтобы приготовить 2% -ного водного раствора формиата уранила пятен. Фильтр 2% водный формиат уранила пятна раствора с использованием 0,2 мкм фильтр, прикрепленный к шприцу.
    1. Добавьте 5 мкл5 N NaOH до 1 мл отфильтрованного раствора красителя. Кратко вихрь решение и центрифуги при 20000 х г.
  2. Тлеющего разряда углеродных покрытием сетки (сторона с покрытием вверх) со следующими настройками: 25 мА, 45 с, 0,1 мбар, и отрицательной полярности высокого напряжения.
  3. Используйте самозакрывающиеся щипцы, чтобы захватить свечение разрядника обработанную сетку от края.
  4. Внесите 3,5 мкл образца на сетке в течение 4 мин. Используйте кусок фильтровальной бумаги впитывать от образца путем приведения фильтровальную бумагу в контакте с сеткой со стороны.
  5. Сразу добавить 3,5 мкл окрашивающим раствором на сетке в течение 1 мин.
  6. Фитиль от пятна, как в 7.4 и удерживайте фильтровальную бумагу против сетки за 1 - 2 мин.
  7. Перевести сетку в ТЭМ держателя образца и изображения, используя JEOL JEM-1400 работает при 80 кВ с увеличением в диапазоне от 10 К до 80 К (рис 5C).

8. Построение произвольных форм Использование MoleculAR Холст

  1. Определить форму и выбрать нити, которые соответствуют форме на молекулярном холсте. Для треугольной формы, например, выбрать 206 OUT 362 прядей для молекулярной холсте.
  2. Заменить подвергается домен (то есть, вдоль гипотенузы треугольника) с сегментом поли-T 10 - 11 нуклеотидов (конструкции 1 на фиг.6А), или добавить ребро протектора, комплементарную к открытой области, и завершить его с 10 - 11 нуклеотидов длиной поли-Т сегмент (конструкция 2 на рис 6A) для предотвращения агрегации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Просто отжига SSTs, которые соответствуют пикселям треугольника (без использования протектор пряди) приведет к агрегации и образованию отдельной не группы продукции на геле. Используйте дизайн край протектор для различных форм, как это эффективно более ресурсов; она требует только четырех дополнительных наборов нитей (рис 6в) по сравнению с 14 дополнительных наборов в дизайне замены (фигуре 6В).
  3. Создать нити библиотеки для 310 пикселей молекулярной холсте, который включает в себя базовый набор (362 SST холст), набор 1 * (краевые протекторы, которые связываются с доменом 1 из SST), набор 2 * (краевые протекторы, которые связываются с доменом 2 из SST), набор 3 * (краевые протекторы, которые связываются с доменом 3 в SST), и набор из 4 * (краевые протекторы, которые связываются с доменом 4 в SST), чтобы дать в общей сложности 1344 края покровителей.
  4. Центрифуга также пластины 96 для различных наборов для примерно 10 сек. Пипеткой из желаемых нити из пластин для того, чтобы сделать исходный раствор для определенной формы.
    1. Для форме треугольника с защитой кромок, пипетки 1 мкл 206 прядей из основного набора, 0 из множества 1 *, 0 из множества 2 *, 0 из множества 3 * и 24 прядей из множества 4 * в 2 мл центрифуге труба. Добавьте 20 мкл дистиллированной деионизированной воды к трубке, чтобы сделать 400 нм исходного раствора из цепей ДНК.
  5. Добавьте 50 мкл 400 нМ маточного раствора ДНК Стра NDS, 10 мкл 10X буфера В отжига (50 мМ Трис, рН 7,9, 10 мМ ЭДТА, 125 мМ MgCl 2) и исходный раствор 40 мкл дистиллированной деионизированной Н 2 O до 0,2 мл ПЦР-пробирку. Это делает 100 мкл пробы треугольника в 1X отжига буфера В (5 мМ Трис, рН 7,9, 1 мМ ЭДТА, 12,5 мМ MgCl 2) с нитей в концентрации примерно 200 нм в цепи.
  6. Отжиг смеси в термоциклере в течение 17 ч, как описано в шаге 2.3.
  7. Приготовьте родной 2% агарозном геле, как описано в шаге 2.4.
  8. Очищают образец, как описано в шаге 2.5.
  9. Измерить концентрацию ДНК, как описано в шаге 2.6.
  10. Изображение образец под АСМ, как описано в шаге 3 (рис 7С и 7D).
  11. Выберите и смешайте пряди для различных форм с помощью той же библиотеки нитей. Отжига различные решения и объединить очищенные образцы различных форм, чтобы сэкономить время АСМ.
jove_title "> 9 Дополнительно:. Робот автоматизации дизайн формы и жидких Смешивание

  1. Использование программы пользовательского MATLAB, чтобы помочь конструкцию сложной формы.
  2. Использование программного обеспечения для доставки инструкции в виде последовательности пипетирования к обработчику робота жидкости. Используйте жидкий обработчик робота, чтобы выбрать и смешать нити, которые составляют целевую форму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: дизайн Форма и прядь смешивания был автоматизирован, чтобы уменьшить человеческие ошибки и сделать строительство менее трудоемким.

10. Прямоугольники и трубы в различных масштабах

  1. Построить различных размеров прямоугольников (рисунок 10), просто изменяя число параллельных спиралей (H) и число витков спирали (Т).
  2. Следуйте шаг 3 для конкретного размера прямоугольника.
  3. Следуйте шаг 6 для конкретного размера трубы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Самосборка ТПМ (рисунок 1) даст 24H × 28T прямоугольника, как показано на рисунке 2. Последовательности ДНК для различных ТПМ могут быть изменены / оптимизированы для того, чтобы стрептавидин маркировку (рисунок 3 и 4), преобразование прямоугольник в трубочку (Рисунок 5), программируемый самосборка ТПМ в трубки и прямоугольники различных размеров (рисунок 10), и строительство 2D произвольных форм с помощью молекулярной холст (рисунок 8). Две конструкции (домен дизайн замена и дизайн края протектора) тестировали, как решения для агрегации по подверженных областей произвольной формы (рисунок 7). Обе конструкции имеют сравнимую выход гель и структурную целостность, но дизайн края протектора является более экономически эффективным, так как он требует меньше вспомогательных видов (рисунок 6).Strand сбор и смешивание может быть автоматизирован, как показано на фиг.9, чтобы уменьшить ошибки человека и сэкономить время.

Фигура 1
Рисунок 1. Самоорганизация молекулярных форм с помощью одноцепочечной плитки. () Каноническим SST мотив, взято из 12 (В) Левая и средняя:. Два Изображения собранных ТПМ. Внутренние ТПМ есть полная длина 42 оснований и помечены "U", а граничные ТПМ есть 21 баз и помечены "L". В левой схеме, цвета различают различные домены. В средней диаграммы, цвета различать различные направления. Справа: схема представления кирпичной стене SST структур. Толстые кирпичи полные ТПМ и тонкие кирпичи граничные ТПМ. Округлые края указывают на отсутствие дополнительную спаривание. Как и в средней фигуре, цвета различать отдельные плитки. Во всех DIAGбаранов, каждая плитка имеет уникальную последовательность. (C) Удержание соответствующий выбор нитей из коллекции SST, составляющих конструкцию прямоугольник на рисунке б приводит к образованию другой желаемой формы, такие как треугольник (слева) или прямоугольного кольца (справа). (D) Конструкция трубки с заданной ширины и длины. (Е) с учетом предварительно синтезированного пул последовательностей SST (вверху), произвольной формы (внизу) могут быть разработаны путем выбора подмножества нитей с использовать в цепи смеси (темно-синий пикселей) и исключая все остальное (голубые пикселей). Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Проектирование и АСМ Изображение 24H × 28T прямоугольник. () Схематическое изображение 24H × 28T прямоугольника. Увеличенной в вид также показано для детального локальной структуры. Расположение отдельный сегмент SST либо 10 нт - 11 нт - 11 нт - 10 нт (например, A2.13-b2.13-a1.13 * -b1.12 *) или 11 нт - 10 NT- 10 нт - 11 нт (например, a3.12-b3.12-A2.13 * * -b2.12). Треугольники на левой стороне прямоугольника указывают строки с расположением 10nt-11nt-11nt-10nt SST; другие внутренние ТПМ есть 11 нт - 10 нт -10 нт NT- 11 вместо (NT является аббревиатурой нуклеотида). Поскольку 24H × 28T SST прямоугольника имеет аналогичные размеры в структуру ДНК-оригами, критерий введены в ДНК-оригами работы и считают ССТ прямоугольник "хорошо сформирован", если он не имеет дефект в ожидаемой контура больше, чем 15 нм в диаметре был принят. Кроме того, "хорошо формируется" прямоугольник структура гаS Нет отверстия в его интерьере больше, чем 10 нм в диаметре требуется. После вышеуказанных критериев, была получена "хорошо образование" отношение 55% (N = 163). Красной звездочкой (*) указывает на нижний левый угол прямоугольника здесь. (B) 2% родной электрофореза в агарозном геле. U, нерафинированный; Р, очищенный (путем экстракции геля от полосы U) (C) АСМ-изображения структуры решетки. (Размер сканирования: 2 мкм × 2 мкм). Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Граница Маркировка 24Н × 28T прямоугольник. () Схематическое изображение конкретного биotin меченных 24H × 28T прямоугольника. Пряди выделенные синим цветом, являются ручек пряди. Пряди красным цветом выделены анти-ручки пряди с маркировкой 3 'биотина (черных точек). Стрептавидин изображен в виде оранжевого шара (Б) АСМ-изображение перед добавлением (размер сканирования: 1 мкм × 1 мкм) стрептавидин.. (C) АСМ-изображение после добавления стрептавидина (размер сканирования: 1 мкм × 1 мкм). Врезка, увеличенной в вид, показывающий успешное маркировки. Обратите внимание, что стрептавидин появились либо как белыми точками или полосками из-за их повышенной высоты. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Ввнешнее Маркировка 24Н × 28T прямоугольник. () Схематическое изображение конкретного биотина с надписью 24H × 28T прямоугольника. Пряди выделенные синим цветом, являются ручек пряди. Пряди красным цветом выделены анти-ручки пряди с маркировкой 3 'биотина (черных точек). Стрептавидин изображен в виде оранжевого шара (Б) АСМ-изображение перед добавлением (размер сканирования: 1 мкм × 1 мкм) стрептавидин.. (C) АСМ-изображение после добавления стрептавидина (размер сканирования: 1 мкм × 1 мкм). Врезка, увеличенной в вид, показывающий успешное маркировки. Обратите внимание, что стрептавидин появились либо в виде белых точек или полос в связи с повышенными высот. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

в-странице = "всегда"> Рисунок 5
Рисунок 5. Проектирование и ПЭМ-изображение 24H × 28T Tube. () Схематическое изображение 24H × 28T баррель. Два увеличенной в вид на верхней и нижней шоу подробные тождества сегмента. Обратите внимание, что сегменты a24.x * (например, a24.13 *) и b24.x * (например, b24.12 *) в верхнем ряду дополняют сегментов a24.x (например, a24.13) и b24.x (например, b24.12) в нижнем ряду; например комплементарность, как ожидается, приведет к образованию из трубчатой ​​структуры. (В) 2% коренных электрофорез в агарозном геле. U, нерафинированный; Р, очищенный (путем экстракции геля от полосы U) (С) ПЭМ-изображение структуры ствола (масштаб бар: 100 нм).. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26.ighres.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. Два Конструкции для предотвращения агрегации вызванные Exposed Sticky доменов. (А) бок о бок демонстрации из двух методов покрытия подвергается домены. Непарный липким домена (домен 4) указывается с красной пунктирной, коробки. Дизайн 1 является конструкция замещение домена, в котором неспаренный домена замещен доменом поли-T (показано красным и помечены "Т"). Дизайн 2 Дизайн край протектор, который включает в себя покрытие непарный домен с края протектора цепи (показано красным и надписью "Т-4 *"). Края протектора нить состоит из поли-T секции и в дополнение к открытой области. (Б) различные возможные граничные конфигурации, связанные с замещением области дизайна (1).Есть 14 различных способов внутреннего SST (показаны синим цветом) можете оставить открытую домен или домены. Соответствующие прядь замены показаны красным для каждой ситуации. (С) дизайн края протектора (конструкция 2). Один внутренний SST (синий) требуется только четыре края протектора пряди (красные), чтобы покрыть открытые домены, используя эту конструкцию. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7. Две конструкции для SST треугольника. (А) и (Б) изображают схемы, основанные на дизайне 1 (замещение домена) и дизайн 2 (край протектора) на рисунке 8, соответственно. Поли-Т область (Т10 или Т11 на рисунке), как изображенозакругленный угол на блок-схеме. Вставка показывает увеличенный вид указанной структуре с пунктирным прямоугольником. Масштабные бары, 100 нм. (C) и (D) являются АСМ-изображения. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26.

Рисунок 8
Рисунок 8. Диаграммы и АСМ-изображения 100 различных форм. Структура конструкции отображаются в верхней панели. Светло-голубой окраски указывает на холст пряди, оставленные из смеси при синее окрашивание указывает на пряди включены. Для ясности, кромки протектора нити опущены. Соответствующее АСМ изображение каждой структуры показана ниже его конструкции. Каждое изображение 150 нм × 150 нм в области. Есть 100 уникальных форм. Включены 10 арабские цифры, то 26 буквы латинского алфавита, 23 знаков препинания и keyboaй символы, 10 смайликов, 9 астрологические символы, 6 китайских иероглифов, и несколько разные символы. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9
Рисунок 9. Робот Автоматизация Схема. Эта диаграмма отображает рабочий процесс, используемый для автоматизации процесса смешивания. Во-первых, пользовательские программы MATLAB используется для проектирования желаемую форму. Еще раз, синие прямоугольники показывают нити должны быть включены в смеси. После завершения конструкции, программа выдает набор инструкций для пипеток робота жидкости обработчика. Робот пипетки правильные концентрации соответствующих нитей для отдельной форме в Плате хорошо. Смесь затем подвергают отжигу в одном сосуде, а затем АСМ визуализации полученных форм. (Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 10
Рисунок 10. Самоорганизация прямоугольников и труб в различных масштабах. () АСМ изображения SST прямоугольников со следующими размерами (предназначен слева направо):. 4H × 4T, 6H × 7т, 10ч × 10Т, 14T 12ч ×, × 18Н 20T, 28T × 24H, 36H и × 34T ( B) молекулярные массы структур по логарифмической шкале. Звездочка указывает на вес типичного М13 ДНК-оригами структуры в качестве эталона. (C) ПЭМ-изображенияЕСН труб со следующими размерами (предназначенных слева направо): 8H × 28T, 55T × 8H, 8H × 84T, 28T × 24H, 12H и × 177T. Все масштабные линейки показать 100 нм. Эта цифра была изменена с ранее опубликованной рисунке 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

На стадии формирования структуры, важно поддерживать соответствующую концентрацию катионов магния (например., 15 мМ) в цепи ДНК смеси самосборке ДНК-наноструктур. Аналогичным образом, на стадии агарозном геле характеристика / очистки, важно, чтобы соответствующее концентрацию катионов магния (например., 10 мМ) в геле и буфере геля проточной сохранить наноструктур ДНК при электрофорезе. Для 24H × 28T структуры прямоугольника, мы протестировали отжиг в различных концентрациях ++ Mg и обнаружили, что структура, как правило, формируется в диапазоне 10 - 30 мМ Mg ++ (с лучшим выходом пласта с около 20 мМ Mg ++).

В отличие от scaffolded структуры оригами, структура SST имеет модульную архитектуру. Различные формы могут быть разработаны с той же холст, выбрав соответствующую подмножество SST плитки. Кроме того, структура ССТ собран сюдам только короткие синтетические нити ДНК и не предполагает длительный каркас, который используется в подходе оригами. Таким образом, размер структуры SST не ограничивается длиной имеющихся строительные леса. Тем не менее, в то время как ДНК-оригами подход часто могут быть оптимизированы для получения либо складчатых структур или развернутые мономеры, ССТ может привести к частично сформированных структур и, следовательно, может потребовать очисткой на геле для последующего использования. Кроме того, из-за отсутствия лесов нити, структура ССТ может быть более "хрупкими", чем его аналог ДНК-оригами. Оба подхода SST и подход ДНК-оригами быстро развивается, и пользователю рекомендуется выбрать подход, который наилучшим образом соответствует его или ее отдельных функциональных потребностей.

Поразительно, что сотни маленьких мономеров опосредованных только местных вяжущих взаимодействий может самостоятельно собрать в установленном глобальной форме, как показано на подходе SST. Основные принципы, представленные в подход шо SSTÜLD быть обобщены с материалами рядом нитей ДНК, и основной методике, описанной в этой статье, после соответствующей модификации, необходимо включить конструкций сложных структур самоорганизующихся из различных материалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Управлением военно-морских исследований молодого исследователя Program Award N000141110914, Управления военно-морских исследований Гранта N000141010827, NSF КАРЬЕРА Award CCF1054898, NIH директора премии Нью-Новатор 1DP2OD007292 и Висс института Биологически Вдохновленный инженерного факультета Startup фонда (в PY) и Центр наук о жизни Startup фонда (в BW) Цинхуа-пекински.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Strands  Integrated DNA Technology Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102 Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns BIO-RAD 731-6166 Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes Bruker AFM Probes SNL10 Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600 Section 3.6
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428 000.414 Section 3.6
Transmission Electron Microscope  Jeol Jem 1400 Section 7.4
Multimode 8 Veeco Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner GE Heathcare Life Sciences 28-9558-08 Section 3.5
Ultrapure Distilled water Invitrogen 10977-023 Section 3.7.1
Mica disk SPI Supplies 12001-26-2 Section 4.1
Steel mounting disk Ted Pella, Inc. 16218 Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM Electron Microscopy Sciences FCF400-Cu Section 7.2
tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 7.31
glow discharge system Quorum Technologies K100X Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler BIO-RAD PTC–0240G Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems ThermoScientific B2 Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G Lonza 50004 Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp ThermoScientific SM1333 Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer ThermoScientific Section 3.7
0.2 um filter Corning Inc. 431219 Section 7.1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424 (2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Tags

Химия выпуск 99 самосборка плитка ДНК одноцепочечных плитки молекулярные холст молекулярная пикселей программируемые наноструктуры нанотехнологии ДНК
Самоорганизация сложных двумерных фигур из одноцепочечной ДНК Плитка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, B., Vhudzijena, M. K.,… More

Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. J. Vis. Exp. (99), e52486, doi:10.3791/52486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter