Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Self-samling af komplekse Todimensionale Former fra Single DNA Fliser

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52486
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Introduction

Forrige nukleinsyre saml-selv arbejde 1-25 har ført til en vellykket opførelse af en bred vifte af komplekse strukturer, herunder DNA 2 - 5,8,10 - 13,17,23 eller RNA 7,22 periodiske 3,4,7, 22 og algoritmisk 5 todimensionale gitre, bånd 10,12 og slanger 4,12,13, 3D krystaller 17, polyedre 11 og finite, 2D former 7,8. En særlig effektiv metode afstivet DNA origami, hvorved en enkelt stillads streng foldes ved mange korte hjælpestoffer korte strenge til dannelse af et kompleks form 9,14 - 16,18 - 21,25.

Vi har for nylig rapporteret en metode til konstruktion af diskrete nanostrukturer med foreskrevne 2D figurer ved hjælp af enkelt-strengede fliser (SST), og demonstrerede strukturer med kompleksitet kan sammenlignes med DNA origami 26. Denne article er en tilpasning af vores tidligere arbejde 26 og beskriver detaljeret protokoller til at arrangere individuelt adresserbare SSTS i sofistikerede finite 2D figurer med præcist foreskrevne dimensioner (bredder og længder) og morfologier. En vigtig fordel ved SST metoden er dens modulopbygning. Hver komponent SST af en struktur fungerer som en modulopbygget enhed i forsamlingen, og forskellige delgrupper i disse SSTS producerer forskellige former. Således har vi etableret en generel platform til at konstruere nanostrukturer med foreskrevne størrelser og former fra korte, syntetiske DNA-strenge.

SSTS indeholder fire domæner, der hver 10 eller 11 nukleotider lang (figur 1A). De SSTS binder således, at deres parallelle helixer skabe en DNA gitter holdes sammen af ​​crossover-bindinger. Hver crossover er phosphatet mellem domænerne 2 og 3. phosphat strækkes kunstigt i diagrammerne for visuel klarhed. De delefiltre er fordelt to spiralformede drejninger (21 baser) fra hinanden (<strong> Figur 1B). De sammensatte rektangler er ved deres dimensioner, der er nævnt i antallet af spiraler og spiralformede sving. For eksempel, at et rektangel er seks helices bred og otte spiralformede vender længe er opført som et 6H × 8T rektangel. SSTS kan udelades, tilføjede, eller på anden måde omarrangeret til at skabe strukturer af vilkårlige former og størrelser (figur 1C). For eksempel kan et rektangulært design rulles til et rør med en ønsket længde og radius (figur 1D).

Alternativt kan den rektangulære SST gitter ses som en molekylær lærred består af SST pixels, hver 3 nm med 7 nm. I denne undersøgelse, bruger vi en molekylær lærred af 310 fuld længde interne SSTS, 24 fuld længde SSTS udgør de venstre og højre grænser, og 28 halvlange SSTS danner de øverste og nederste grænser. Lærredet har 24 dobbeltspiraler forbundet af delefiltre, og hver helix indeholder 28 spiralformede drejninger (294 baser) og er derfor omtalt som24 timer i × 28T rektangulære lærred. Den 24H × 28T lærred har en molekylvægt svarende til den af ​​en DNA origami struktur skabt ud fra en M13-fag stillads.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA Sequence Design

  1. Brug UNIQUIMER software 27 at designe en SST-finite struktur ved at angive antallet af dobbeltspiraler, længder af top og bund helix for hver dobbelt helix, og crossover mønster for at skabe en 24H × 28T lærred. Når du har defineret disse parametre, er den overordnede arkitektur (streng komposition og komplementariteten aftale) illustreret grafisk i programmet.
  2. Generere sekvenser for de strenge af den angivne struktur for at opfylde komplementaritet arrangement og yderligere krav (hvis nogen). Designe DNA-sekvenser ved at minimere sekvens symmetri 28 (for de fleste af de strukturer).
    1. Generer nukleotider (A, C, G og T) tilfældigt én efter én.
    2. Match nukleotider er komplementære til dem, der frembringes efter baseparring regel: A til T og vice versa; C til G og omvendt.
    3. Brug ikke gentagne segmenter ud over otte eller ni nukleotider. Når en sådan repspise segmenter dukke under design, mutere de senest genererede nukleotider indtil kravet gentage-segment er opfyldt.
    4. Brug ikke fire på hinanden følgende A, C, G eller T-baser.
    5. Anvende præ-specificerede nukleotider i de enkeltstrengede linkage point (f.eks T og G som det enogtyvende og toogtyvende nukleotider, henholdsvis for de fleste af strengene) for at undgå at glide baser omkring liftkontakterne punkter (f.eks, hvis begge enogtyvende og toogtyvende nukleotider var T, var det muligt for det enogtyvende nukleotid til at binde til nukleotidet, at den toogtyvende nukleotid formodes at binde til).
  3. Ændre DNA-sekvenser manuelt for streptavidin mærkning, omdannelsen af ​​rektangler i rør, dannelsen af ​​forskellige rektangler og rør på tværs af forskellige skalaer, og for at forhindre aggregering forårsaget af udsatte domæner på SST.
    1. Erstatte de udsatte domæner på grænsen af ​​den molekylære lærred med poly-T tracts.
    2. For streptavidin mærkning, designe håndtaget segmenter (den ekstra segment vedlagt komponent-strengen, som kan binde til en komplementær modstykke såsom et anti-håndtag streng), således at de kan rumme en anti-håndtag streng med 3'biotin modifikation.
    3. Ved omregning af et rektangel ind i et rør, fjernes de øverste og nederste rækker fra rektanglet og indsætte en ny række, hvis SSTS har særlig komplementaritet med de tilsvarende fliser på den anden til øverste række og den anden til nederste række.
    4. For en udsat enkeltstrenget domæne af forskellige former, erstatte med poly-T segmenter af 10-11 nukleotider længde eller dække med kant beskyttere, der supplerer den udsatte domæne og opsige med et 10-11 nukleotid lang poly-T segmenter.

2. Forberedelse af Molecular Canvas

  1. Opnå DNA komponent strenge af specificerede sekvenser opløst i RNase-frit vand fra en oligonucleotide producent i V bottom 96-brønds plader med oligonukleotider syntetiseret på en 10 nmol skala med standard afsaltning. Centrifuger plader med 96 brønde med DNA-strengene for ca. 10 sekunder ved 600 x g.
    1. Pipette 1 pi fra hver af de 362 brønde med DNA-strenge for 24H × 28T rektangel (figur 3A) ved 100 uM pr streng (fabrikant specifikation) til et 2 ml reagensglas. Tilføj 138 pi destilleret deioniseret H2O til 2 ml prøverør at lave en stamopløsning af strengen blandingen ved en koncentration på 200 nM per streng.
  2. Der tilsættes 50 pi af 200 nM stamopløsning af streng blanding, 10 pi 10X annealing buffer A (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCl2), og 40 pi destilleret deioniseret H2O til et 0,2 ml PCR-rør. Dette gør en 100 pi prøve af den molekylære lærred i 1X annealing buffer A (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl2).
  3. Annealere den sample i 17 timer i en thermal cycler afkøling fra 90 ° C til 25 ° C. Programmer den termiske variator som følger: rampe ned fra 90 ° C til 61 ° C ved en konstant hastighed på 5 min pr ° C; rampe ned fra 60 ° C til 25 ° C ved en konstant hastighed på 20 min pr ° C; og inkuberes ved 4 ° C, indtil prøven kan tages ud af det termiske cyklus.
  4. Forbered en indfødt 2% agarose gel.
    1. Måle 2,4 g agarose i et 600 ml bægerglas. Tilsættes 120 ml 0,5X TBE-puffer (44,5 mM Tris-borat, pH 8,3, 1 mM EDTA) og 30 ml destilleret deioniseret vand til bægerglasset.
    2. Mikroovn i 3 min (eller i 40 - 60 sekunder mere efter kogning). Tilføre tabt under afdampning ved tilsætning af 30 ml vand, som hjælper til at holde koncentrationen af ​​agarose i gelen ved 2% vand.
    3. Swirl indholdet af bægerglasset i 1 min i et koldt vandbad. Der tilsættes 1 ml 1,2 M MgCl2 (for at gøre en 10 mM MgCl2-koncentration i gelen) og præ-plette gelen with 6 pi SYBR Safe farvestof (1: 20.000).
    4. Hæld gelen opløsningen i en tør gel box og indsætte en 1,5 mm tyk 12 brønd gelelektroforese kam. Lad opløsningen størkne for 15-30 min på en jævn platform.
    5. Hæld gel kørende puffer (44,5 mM Tris-borat, pH 8,3, 1 mM EDTA og 10 mM MgCl2) i gelen kassen. Belastning 2 - 3 pi 1 kb DNA-stige ind i en brønd i agarosegel. Bland 4 pi 6X bromphenolblåt-farvestof (0,25% bromphenolblåt, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCI2 og 30% glycerol) med 20 pi af prøven af den molekylære lærred og indlæse opløsningen til en anden brønd på agarosegel.
  5. Kør den native 2% agarose i 2 timer ved 100 V i et isvandbad (bromphenolblåt, vist med blåt, kører hurtigere end komponent tråde, så det kan tjene som en indikator for, at hvis 2 timer køretid er relevant).
  6. Billede gelen under anvendelse af en gel scanner med et passende filter for SYBR sikker farvning (figur 2B
  7. På en blå lys transilluminator, udskære dominerende bånd med lignende mobilitet til båndet af 1500 basepar af 1 kb DNA-stige med en skarp ren barberblad. Placer den ønskede gel stykke (r) i et spin-søjle og derefter knuse gelen til fine stykker med en mikrorør støder. Centrifuger ved 438 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
  8. Måle koncentrationen af ​​DNA'et under anvendelse af en ultraviolet spektrofotometer ved 260 nm.
    1. Bruge 2 ul ultrarent DNase / RNase-Free destilleret vand som tomt for at kalibrere maskinen.
    2. Anvende en tilsvarende volumen af ​​den indsamlede prøve fra spin-kolonne for at få et estimat af DNA-koncentrationen. Den målte koncentration værdi ("a" = ng / pl) opnået ved en UV-absorption på 260 nm vil hjælpe med at bestemme fortyndingsfaktoren for AFM og TEM billeddannelse.
    3. Konverter den målte koncentration fra "a" (ng / pl) til "b" (nM) efter b = a × 10 6 / (330 &# 215; antal nukleotider).
      BEMÆRK: molekylvægt af et nukleotid er 330 g / mol. Den beregnede molære koncentration værdi vil bestemme fortyndingsfaktoren for AFM og TEM billeddannelse. Som i tilfælde af en 24H × 28T rektangel, den fælles måling for den oprensede prøve er omkring 10-60 ng / pl. Da antallet af nukleotider for en sådan struktur er 14616 Da, den molære koncentration er ca. 2-12 nM. Den endelige koncentration bestemmes ved udbyttet samling (~ 20 - 50%) fra centrifugering og volumenet af gelen båndet udskåret ud (jo højere lydstyrke, jo mere fortyndet oprenset prøve).

3. Atomic force mikroskopi Imaging

  1. Skræl off glimmer knyttet til en model metallisk disk ved hjælp tape for at få en flad overflade og placere prøven disk imaging scenen.
  2. Tilsæt 40 ​​pi 1X annealing buffer A efterfulgt af 5 pi (2 - 5 nm) af den oprensede prøve af 24H × 28Trektangel til den frisk spaltet glimmer overflade. Lad blandingen at sætte sig i ca. 2 min.
  3. Installere AFM siliciumnitrid cantilever chip på en cantilever indehaver. Brug en C trekantet spids (resonansfrekvens, f 0 = 40-75 kHz fjederkonstant k = 0,24 Nm-1) til billeddannelse.
  4. Billede en prøve i fluidet-aflytning tilstand. Brug følgende imaging parametre for scanning: scanne størrelse på 2 um, 1024 linjer for beslutningen, og en scanning hastighed på 0,5-1 Hz (figur 2C).
  5. Om nødvendigt tilsættes 10 pi eller flere af 10 mM NiCl2 løsning at øge styrken af DNA-glimmer binding 29.

4. Prøve Forberedelse til Streptavidin Mærkning

  1. Designe 24H × 28T rektangel således at håndtaget tråde på bestemte steder er indarbejdet til at være et supplement til de anti-håndtag tråde med biotin modifikation, som igen er i stand til at binde sig til streptavid manuelti specifikt.
    1. Ændre den molekylære lærred ved at fastgøre en 3'17-nukleotid-segment, der består af en to-nukleotidsekvens (TT) som et afstandsstykke og en 15-nukleotid håndtag (GGAAGGGATGGAGGA) til de 14 fliser på den øverste række og 14 fliser på bunden rækken af rektanglet (figur 3A) til at mærke grænsen. Denne sekvens er komplementær til en 3'biotin modificeret anti-håndtag streng (TCCTCCATCCCTTCC-biotin).
  2. For intern mærkning vedhæfte 3'17 nukleotidsegment til 8 interne fliser og 6 grænse fliser af rektanglet (figur 4A).
    1. Bland de 28 tråde med håndtag (grænse mærkning) med resten af ​​komponent strenge af 24H × 28T rektangel (334 tråde) til at lave en 200 nM stamopløsning. Bland de 14 strenge med håndtag (indre mærkning) med resten af ​​dets strenge af 24H × 28T rektangel (348 tråde) for at opnå en 200 nM stamopløsning.
  3. For Boundary mærkning, tilsættes 50 pi af 200 nM stamopløsning af strengene, 6 pi af 100 pM biotin modificeret anti-håndtag tråde, 10 pi 10X annealing buffer A, og 34 pi destilleret deioniseret vand til en 0,1 til 0,2 ml PCR reagensglas. Den endelige koncentration af komponenten streng er 100 nM, og den endelige koncentration af anti-håndtag biotin modificeret streng er 6.000 nM. Bemærk, at 28 molekyler af anti-biotin håndtere modificeret streng binder til en 24H × 28T rektangel således anti-håndtag biotin modificeret streng er på over 100% for at gøre bindende gunstige.
  4. Til intern mærkning, tilsættes 50 pi af 200 nM stamopløsning af strengene, 3 pi af det indre anti-håndtag biotin modificeret streng ved 100 uM, 10 pi 10X annealing buffer A, 37 pi destilleret deioniseret vand til en 0,1 - 0,2 ml PCR-reagensglas. Den endelige koncentration af komponenten streng er 100 nM, og den endelige koncentration af anti-håndtag biotin modifi ed Strand er 3.000 nM. Bemærk, at 14 molekyler af anti-håndtag biotin modificeret streng binder til en 24H × 28T rektangel således anti-håndtere biotin modificeret streng er på over 100% for at gøre bindende gunstige.
  5. Anneale begge prøver i en thermocycler i 17 timer under anvendelse af trinene beskrevet i 2.3.
  6. Forberede en nativ 2% agarosegel som beskrevet i trin 2.4.
  7. Rense begge prøver som beskrevet i trin 2.5.
  8. Bestemmelse af koncentrationen af ​​de ønskede DNA-strukturer som beskrevet i trin 2.6.

5. Atomic force mikroskopi For Streptavidin Mærkning

  1. Billede hver prøve under anvendelse af en AFM som beskrevet i trin 3 (fig 3B og 4B).
  2. Efter den første runde af billeddannelse, tilsættes 40 pi 1X annealing buffer A efterfulgt af 1 pi streptavidin ved 10 mg / ml til prøven. Lad blandingen at sætte sig i ca. 2 minutter, før reimaging (figurerne 3C og 4C).
_title "> 6. Konvertering et rektangel i et rør

  1. For at udforme et rør baseret på rektanglet, holde alle de indgående SSTS i sted undtagen de øverste og nederste rækker. Indføre en ny række, hvis SSTS er designet ved at sammenkæde den øverste og nederste halve fliser af deres respektive kolonner at ringslutte den oprindelige rektangel til et rør konformation (figur 5A).
  2. Bland den nye række af strenge (14 tråde) med komponenten strenge af 24H × 28T rektangel eksklusive de øverste og nederste rækker (336 strenge) for at opnå en 200 nM stamopløsning.
  3. Følg geloprensning trin 2,2-2,7 (figur 5B).

7. Transmission Electron Microscope Imaging

  1. 0,06 g uranyl formiat i 3 ml destilleret vand vejer at fremstille en 2% vandig uranyl formiat farveopløsning. Foretage 2% vandig uranyl formiat farveopløsning under anvendelse af et 0,2 um filter fastgjort til en sprøjte.
    1. Tilsæt 5 ul5 N NaOH til 1 ml filtreret farveopløsning. Kort fortalt vortexes opløsningen og centrifugeres ved 20.000 x g.
  2. Glow aflade kulstof-coatede gitre (belagt opad) med følgende indstillinger: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar og negative High Tension polaritet.
  3. Brug selvlukkende pincet til at få fat i en glød aflader behandlet gitter fra kanten.
  4. Pipette 3,5 ul prøve på nettet for 4 min. Brug et stykke filtrerpapir til at væge væk af prøven ved at bringe filterpapir i kontakt med gitteret fra siden.
  5. Straks tilføje 3,5 pi af pletten opløsningen på nettet i 1 min.
  6. Væge væk pletten som i 7.4, og hold filtrerpapiret mod gitteret til 1 - 2 min.
  7. Overfør gitteret til en TEM prøveholder og billede ved hjælp af et JEOL JEM-1400 betjent ved 80 kV med forstørrelse fra 10 K til 80 K (figur 5C).

8. Konstruktion Vilkårlige Former Brug af Molecular Canvas

  1. Identificere en form og vælge strengene, der svarer til formen på det molekylære lærred. For en trekant form for eksempel, skal du vælge 206 ud 362 tråde til den molekylære lærred.
  2. Erstatte den eksponerede domæne (dvs. langs hypotenusen i trekanten) med en poly-T-segmentet 10 - (design 1 i figur 6A) 11 nukleotider lange, eller tilføj en kantskåner som er komplementær til den eksponerede domæne og afslutte det med en 10 - 11 nukleotid lang poly-T-segmentet (design 2 i figur 6A) for at forhindre aggregering.
    BEMÆRK: Simply annealing af SSTS som svarer til de pixels af trekanten (uden brug protector strenge) vil føre til aggregering og ingen separat produkt band formation på en gel. Brug kantbeskytteren design for forskellige former, da det er mere ressourceeffektiv; det kræver kun fire ekstra sæt af tråde (figur 6c) sammenlignet med 14 ekstra sæt i erstatning design (Figure 6B).
  3. Opret en streng bibliotek for 310-pixel molekylære lærred, som omfatter det centrale sæt (362 SST lærred), Set 1 * (kant beskyttere, der binder til domæne 1 af en SST), der 2 * (kant beskyttere, der binder til domæne 2 af en SST), Indstil 3 * (kant beskyttere, der binder til domæne 3 af en SST), og Set 4 * (kant beskyttere, der binder til domæne 4 af SST) for at give i alt 1.344 kant beskyttere.
  4. Centrifuger plader med 96 brønde for de forskellige sæt for omkring 10 s. Pipetter de ønskede tråde fra pladerne for at gøre en stamopløsning til en bestemt form.
    1. For form af en trekant med kant beskyttere, pipette 1 pi 206 tråde fra det centrale sæt, 0 fra sæt 1 *, 0 fra sæt 2 *, 0 fra sæt 3 * og 24 strenge fra sæt 4 * i en 2 ml centrifuge rør. Der tilsættes 20 pi destilleret deioniseret vand til røret for at lave en 400 nM stamopløsning af DNA-strengene.
  5. Der tilsættes 50 pi af 400 nM stamopløsning af DNA stra NDS, 10 pi af 10X annealing buffer B (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCl2) stamopløsning og 40 pi destilleret deioniseret H2O til et 0,2 ml PCR-rør. Dette gør en 100 pi prøve af trekanten i 1X annealing buffer B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCI2) med tråde ved en koncentration på ca. 200 nM per streng.
  6. Anneale blandingen i en thermocycler i 17 timer som beskrevet i trin 2.3.
  7. Forberede en nativ 2% agarosegel som beskrevet i trin 2.4.
  8. Oprense prøven som beskrevet i trin 2.5.
  9. Måle koncentrationen af ​​DNA'et som beskrevet i trin 2.6.
  10. Billede prøven under AFM som beskrevet i trin 3 (figur 7C og 7D).
  11. Pluk og bland tråde til forskellige former ved hjælp af den samme streng biblioteket. Anneale de forskellige løsninger og kombinere oprensede prøver af forskellige former for at spare tid under AFM billeddannelse.
jove_title "> 9 Valgfrit:. Robot Automation Of form design og Liquid Mixing

  1. Brug et brugerdefineret MATLAB program til støtte udformningen af ​​komplekse former.
  2. Bruge softwaren til at levere vejledning i form af en pipettering sekvens til en robot flydende handler. Brug robotten væskehåndteringsenhed til at vælge og blande de tråde, der udgør målfaconen.
    BEMÆRK: Shape design og streng blanding blev automatiseret til at reducere menneskelige fejl og gøre byggeriet mindre arbejdskrævende.

10. rektangler og Rør tværs af forskellige skalaer

  1. Konstruere forskellige størrelser rektangler (figur 10) ved blot at ændre antallet af parallelle helixer (H) og antallet af skrueformede vindinger (T).
  2. Følg trin 3 til en bestemt størrelse rektangel.
  3. Følg trin 6 for en bestemt størrelse rør.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den selvsamling af SSTS (figur 1) vil give en 24H × 28T rektangel, som illustreret i figur 2. DNA-sekvenser for de forskellige SSTS kan modificeres / optimeret til at muliggøre streptavidin mærkning (figur 3 og 4), omdannelsen af en rektangel til et rør (figur 5), den programmerbare selvsamling af SSTS til dannelse rør og rektangler af varierende størrelser (figur 10), og opførelsen af 2D vilkårlige former ved hjælp af molekylær lærred (figur 8). To motiver (domæne substitution design og kantbeskytter design) blev testet som opløsninger sammenlægning langs udsatte domæner af vilkårlige former (figur 7). Begge designs har sammenlignelige gel udbytte og strukturel integritet, men kantbeskytteren design er mere omkostningseffektiv, da den kræver færre hjælpestoffer arter (figur 6).Streng plukning og blanding kan automatiseres, som vist i figur 9 for at reducere menneskelige fejl og spare tid.

Figur 1
Figur 1. Self-samling af Molecular Shapes Brug Single-strenget Fliser. (A) Den kanoniske SST motiv, tilpasset fra 12 (B) Venstre og midterste:. To skildringer af samlet SSTS. Indvendige SSTS har en fuld længde på 42 baser og er mærket "U", mens grænsen SSTS har 21 baser og er mærket "L". I venstre diagram, farver skelne mellem forskellige domæner. I midten diagram, farver skelne mellem forskellige tråde. Højre: En skematisk af mur visning af SST strukturer. Tykke mursten er fulde SSTS og tynde mursten er grænse SSTS. Afrundede kanter indikerer ingen supplerende parring. Som i midten figur, farver skelne enkelte fliser. I al diagvæddere, hver flise har en unik sekvens. (c) tilbageholdelse af et passende udvalg af strenge fra SST samlingen udgør rektanglet design i figur b resulterer i dannelsen af en anden ønsket form, såsom en trekant (venstre) eller en rektangulær ring (højre). (D) Konstruktionen af et rør med en forudbestemt bredde og længde. (E) Givet en forud syntetiseret pulje af SST-sekvenser (øverst), vilkårlige former (nederst) kan designes ved at vælge en delmængde af strenge til brug i strengen blanding (mørkeblå pixel) og fjerne resten (lyseblå pixel). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Design og AFM Billede af 24H × 28T rektangel. (A) Skematisk tegning af 24H × 28T rektangel. En zoomet-i betragtning er også vist for den detaljerede lokale struktur. Den enkelte SST segment arrangement er enten 10 nt - 11 nt - 11 nt - 10 nt (f.eks A2.13-b2.13-a1.13 * -b1.12 *) eller 11 nt - 10 nt- 10 nt - 11 nt (f.eks a3.12-b3.12-A2.13 * -b2.12 *). Trekanter på venstre side af rektanglet angiver rækker med en 10nt-11nt-11nt-10nt SST arrangement; de andre interne SSTS har 11 nt - 10 nt -10 nt- 11 nt i stedet (nt er en forkortelse for nukleotid). Siden 24H × 28T SST rektangel har lignende dimensioner til en DNA-origami struktur, kriteriet indført i DNA-origami arbejde og overveje en SST rektangel "velformet", hvis det ikke har nogen fejl i den forventede omrids større end 15 nm i diameter var vedtaget. Derudover en "velformet" rektangel struktur has ingen huller i dens indre er større end 10 nm i diameter var påkrævet. Efter ovennævnte kriterier, blev en "godt-dannelse" ratio på 55% (N = 163) opnået. En rød stjerne (*) angiver det nederste venstre hjørne af rektanglet her. (B) 2% nativ agarosegelelektroforese. U, urenset; P, oprenset (ved gel-ekstraktion fra bane U) (C) AFM billede af gitterstrukturen. (Scanning størrelse: 2 um × 2 um). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Boundary Mærkning af 24H × 28T rektangel. (A) Skematisk tegning af den specifikke biOtin-mærket 24H × 28T rektangel. Strengene fremhævet i blåt er håndtaget strenge. Strengene markeret med rødt er de anti-håndtag tråde mærket med 3 'biotin (sorte prikker). Streptavidin er afbildet som en orange kugle (B) AFM billede, før du tilføjer streptavidin (scanning størrelse: 1 um × 1 um).. (C) AFM billede efter tilsætning streptavidin (scanning størrelse: 1 um × 1 um). Indsat, en zoomet-in viser vellykket mærkning. Bemærk, at streptavidin optrådte som enten hvide prikker eller striber på grund af deres rejst højder. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Iekstern Mærkning af 24H × 28T rektangel. (A) Skematisk tegning af den specifikke biotin-mærket 24H × 28T rektangel. Strengene fremhævet i blåt er håndtaget strenge. Strengene markeret med rødt er de anti-håndtag tråde mærket med 3 'biotin (sorte prikker). Streptavidin er afbildet som en orange kugle (B) AFM billede, før du tilføjer streptavidin (scanning størrelse: 1 um × 1 um).. (C) AFM billede efter tilsætning streptavidin (scanning størrelse: 1 um × 1 um). Indsat, en zoomet-in viser vellykket mærkning. Bemærk, at streptavidin optrådte enten som hvide prikker eller striber på grund af de hævede højder. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26. Klik her for at se en større version af dette tal.

inden-side = "altid"> Figur 5
Figur 5. Design og TEM Billede af 24H × 28T Tube. (A) Skematisk tegning af 24H × 28T tønde. To zoomet-in visninger øverst og nederst viser detaljerede segment identiteter. Bemærk, at segmenter a24.x * (f.eks a24.13 *), og b24.x * (f.eks b24.12 *) i den øverste række er komplementære til segmenter a24.x (f.eks a24.13) og b24.x (f.eks b24.12), i den nederste række; forventes en sådan komplementaritet at resultere i dannelsen af den rørformede struktur. (B) 2% nativ agarosegelelektroforese. U, urenset; P, oprenset (ved gel-ekstraktion fra bane U) (C) TEM billede af cylinderen struktur (skala bar: 100 nm).. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26.ighres.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. To Designs at forhindre Aggregation forårsaget af Udsat Sticky domæner. (A) En side-by-side demonstration af to metoder til at dække udsatte domæner. Den uparrede klæbrig domæne (domæne 4) er angivet med en rød, stiplet boks. Design 1 er det domæne substitution design, hvor den uparrede domæne er substitueret med en poly-T-domæne (vist med rødt og mærket "T"). Design 2 er kantbeskytteren design, som indebærer dækker den uparrede domæne med en kantbeskytter streng (vist med rødt og mærket "T-4 *"). Kantbeskytteren strengen er sammensat af en poly-T-sektion og et supplement til den eksponerede domæne. (B) De forskellige mulige grænsebetingelser konfigurationer forbundet med domæne substitution (design 1).Der er 14 forskellige måder en intern SST (vist med blåt) kan forlade en udsat domæne eller domæner. De passende streng erstatninger er vist i rødt for hver situation. (C) Kanten protector design (design 2). Et internt SST (blå) kræver kun fire kantskåner tråde (rød) til at dække udsatte domæner ved hjælp af denne konstruktion. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. To-design for SST Trekant. (A) og (B) viser skemaer baseret på design 1 (domæne substitution) og design 2 (kantskåner) i figur 8 hhv. En poly-T region (T10 eller T11 i figuren) er afbildet somet afrundet hjørne i blokdiagrammet. Det indsatte viser et forstørret billede af strukturen vist med den stiplede boks. Scale barer, 100 nm. (C) og (D) er de AFM billeder. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26.

Figur 8
Figur 8. diagrammer og AFM Billeder af 100 forskellige former. Struktur design vises i de øverste paneler. Lyseblå farve angiver lærred tråde tilbage ud af blandingen, mens mørkeblå farve angiver de tråde inkluderet. For klarhedens skyld er kantbeskytter tråde udeladt. En tilsvarende AFM billede af hver struktur er vist nedenfor sit design. Hvert billede er 150 nm × 150 nm i området. Der er 100 unikke former. Inkluderet er 10 arabertal, de 26 store bogstaver i det latinske alfabet, 23 tegnsætningstegn og tasrd symboler, 10 humørikoner, 9 astrologiske symboler, 6 kinesiske tegn, og flere diverse symboler. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9
Figur 9. Robot Automation Flow Diagram. Dette diagram viser arbejdsgangen anvendes til at automatisere blandeprocessen. Først er en brugerdefineret MATLAB program anvendes til at designe den ønskede form. Igen, mørkeblå rektangler angiver strengene, der skal indgå i blandingen. Efter designet er afsluttet, programmet udlæser et sæt af pipettering instruktioner for robotic væskehåndteringsudstyr. Robotten pipetterer de korrekte koncentrationer af passende tråde for en bestemt form i en plate godt. Blandingen gennemgår derefter en pot annealing, efterfulgt af AFM billeddannelse af de resulterende former. (Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10
Figur 10. Self-Assembly of rektangler og Rør tværs af forskellige skalaer. (A) AFM billeder af SST rektangler med følgende designet dimensioner (fra venstre mod højre):. 4H × 4T, 6H × 7T, 10H × 10T, 12H × 14T, 18H × 20T, 24H × 28T og 36T × 34T ( B) Molekylvægtene af strukturerne er på en logaritmisk skala. Stjernen angiver vægten af en typisk M13 DNA origami struktur som reference. (C) TEM billederaf SST-rør med følgende designede dimensioner (fra venstre mod højre): 8H × 28T, 8H × 55T, 8H × 84T, 24H × 28T, og 12H × 177T. Alle skala søjler viser 100 nm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere offentliggjorte tal 26. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I strukturen dannelse trin, er det vigtigt at holde en passende koncentration af magnesium kationer (f.eks., 15 mM) i DNA-strengen blanding selvstændige samle DNA nanostrukturer. Ligeledes i agarosegelen karakterisering / oprensningstrin, er det vigtigt at holde en passende magnesium kation koncentration (f.eks., 10 mM) i gelen og gelen kørende buffer til at opretholde de DNA nanostrukturer under elektroforese. For 24H × 28T rektangel struktur, testede vi annealing i forskellige Mg ++ koncentrationer og fandt, at strukturen typisk dannet i området på 10 - 30 mM Mg ++ (med den bedste formation udbytte med ca. 20 mM Mg ++).

I modsætning til den afstivet origami struktur, SST struktur har en modulær arkitektur. Forskellige former kan designes fra samme lærred ved at vælge den relevante delmængde af SST fliser. Derudover er SST struktur samles from kun korte syntetiske DNA-strenge og ikke indebærer en lang stillads, der bruges i origami tilgang. Derfor er størrelsen af ​​SST strukturen ikke begrænset af længden af ​​den tilgængelige stilladset. Men mens DNA origami tilgang ofte kan optimeres til at frembringe enten foldede strukturer eller ufoldede monomerer kan SST resultere i delvist dannede strukturer og således kræve geloprensning til efterfølgende anvendelse. Derudover, på grund af manglen på et stillads streng, kan en SST struktur være mere "skør" end dens DNA origami modstykke. Både SST tilgang og DNA origami tilgang er hurtige udvikling, og en bruger rådes til at vælge en tilgang, der passer bedst til hans eller hendes særlige funktionelle behov.

Det er slående, at hundredvis af små monomerer medieret kun af lokale bindende interaktioner kan selv samle ind i en ordineret global form, som det fremgår af SST tilgang. De grundlæggende principper, der er vist i SST tilgang shoULD være generaliseres til materialer ved siden af ​​DNA-strenge, og den grundlæggende metode beskrevet i denne artikel, efter passende modifikation, bør gøre det muligt for konstruktioner af komplekse strukturer selv-samlet fra forskellige materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Kontoret for Naval Research Young Investigator Program Award N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF KARRIERE Award CCF1054898, NIH direktørens New Innovator Award 1DP2OD007292 og Wyss Instituttet for Biologisk Inspireret Engineering Faculty Startup Fund (til PY), og Tsinghua-Peking Center for Life Sciences Startup Fund (til BW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Strands  Integrated DNA Technology Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102 Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns BIO-RAD 731-6166 Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes Bruker AFM Probes SNL10 Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600 Section 3.6
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428 000.414 Section 3.6
Transmission Electron Microscope  Jeol Jem 1400 Section 7.4
Multimode 8 Veeco Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner GE Heathcare Life Sciences 28-9558-08 Section 3.5
Ultrapure Distilled water Invitrogen 10977-023 Section 3.7.1
Mica disk SPI Supplies 12001-26-2 Section 4.1
Steel mounting disk Ted Pella, Inc. 16218 Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM Electron Microscopy Sciences FCF400-Cu Section 7.2
tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 7.31
glow discharge system Quorum Technologies K100X Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler BIO-RAD PTC–0240G Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems ThermoScientific B2 Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G Lonza 50004 Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp ThermoScientific SM1333 Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer ThermoScientific Section 3.7
0.2 um filter Corning Inc. 431219 Section 7.1.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424 (2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Tags

Kemi saml-selv DNA fliser enkeltstrengede fliser molekylære lærred molekylær pixel programmerbare nanostrukturer DNA nanoteknologi
Self-samling af komplekse Todimensionale Former fra Single DNA Fliser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, B., Vhudzijena, M. K.,… More

Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles. J. Vis. Exp. (99), e52486, doi:10.3791/52486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter