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Chemistry

Auto-assemblage de formes bidimensionnelles complexes de l'ADN simple brin Tuiles

Published: May 8, 2015 doi: 10.3791/52486
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

Introduction

Acide nucléique précédent travail d'auto-assemblage 1-25 a conduit à la construction réussie d'une variété de structures complexes, y compris l'ADN 2 - 5,8,10 - 13,17,23 ou d'ARN 7,22 3,4,7 périodique, 22 et algorithmique 5 bidimensionnelles treillis, rubans 10,12 et tubes 4,12,13, cristaux 3D 17, 11 et polyèdres finis, formes 2D 7,8. Une méthode particulièrement efficace est échafaudée l'ADN origami, par lequel un seul brin d'échafaudage est plié par de nombreux courts brins de base auxiliaires pour former une forme complexe 9,14 - 16,18 - 21,25.

Nous avons récemment rapporté une méthode pour construire des nanostructures discrètes avec des formes 2D prescrites en utilisant les tuiles simple brin (SST), et démontré la complexité des structures comparables à l'ADN origami 26. Cette article est une adaptation de notre travail antérieur 26 et décrit des protocoles détaillés pour organiser SST adressables individuellement dans des formes 2D finis sophistiqués avec des dimensions précisément prescrites (largeurs et longueurs) et morphologies. Un avantage clé de la méthode SST est sa modularité. Chaque SST composant d'une structure sert d'unité de construction modulaire dans l'assemblée, et les différents sous-ensembles de ces SST produire des formes distinctes. Ainsi, nous avons créé une plate-forme générale pour construire des nanostructures avec des tailles et des formes prescrites à partir de courts brins d'ADN synthétiques.

SST contiennent quatre domaines, chacun 10 ou 11 nucléotides de long (figure 1A). Les SST lient de telle sorte que leurs hélices parallèles créent un réseau d'ADN maintenus ensemble par des liens croisés. Chaque croisement est le phosphate entre les domaines 2 et 3. Le phosphate est étiré artificiellement dans les schémas pour la clarté visuelle. Les croisements sont espacés deux spires hélicoïdales (21 bases) d'intervalle (<strong> Figure 1B). Les rectangles composites sont désignés par leurs dimensions dans le nombre d'hélices et les spires hélicoïdales. Par exemple, un rectangle qui est six hélices de large et huit spires hélicoïdales longue est référencé comme un rectangle 6H × 8T. SST peut être omis, ajoute, ou autrement réarrangés pour créer des structures de formes et de tailles (figure 1C) arbitraires. Par exemple, une forme rectangulaire peut être enroulée dans un tube à une longueur souhaitée et du rayon (figure 1D).

Alternativement, le SST réseau rectangulaire peut être considérée comme une toile moléculaire constitué de SST pixels, chaque 3 nm de 7 nm. Dans cette étude, nous utilisons une toile moléculaire de 310 pleine longueur SST internes, 24 SST-métrages qui composent les limites gauche et droite, et 28 demi-longueur SST constituent les limites supérieure et inférieure. La toile a 24 doubles hélices reliées par des croisements et chaque hélice contient 28 spires hélicoïdales (294 bases) et est donc appeléune 24H × 28T toile rectangulaire. Le 24H × toile 28T a un poids moléculaire similaire à celle d'une structure de l'ADN origami créé à partir d'un phage M13 échafaudage.

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Protocol

1. Séquence ADN Conception

  1. Utilisez un logiciel UNIQUIMER 27 de concevoir une structure SST-finis en spécifiant le nombre de doubles hélices, des longueurs de hélice haut et en bas pour chaque double hélice, et le motif de croisement pour créer une 24H × toile de 28T. Après avoir défini ces paramètres, l'architecture générale (composition de brin et l'agencement de la complémentarité) est illustrée graphiquement dans le programme.
  2. Générer des séquences pour les brins de la structure spécifiée pour répondre à la disposition de la complémentarité et des exigences supplémentaires (le cas échéant). Concevoir des séquences d'ADN en minimisant la symétrie d'ordre 28 (pour la plupart des structures).
    1. Générer des nucleotides (A, C, G et T) de manière aléatoire une par une.
    2. nucléotides Match complémentaires à celles générées suivant la règle d'appariement de bases de A à T et vice versa; C à G et vice versa.
    3. Ne pas utiliser des segments à répétition au-delà de huit ou neuf nucléotides. Lorsqu'une telle repmanger segments émergent lors de la conception, muter les nucléotides générés le plus récemment jusqu'à ce que la condition de répéter-segment est satisfait.
    4. Ne pas utiliser quatre bases A, C, G ou T consécutifs.
    5. Utilisez nucléotides pré-spécifiés aux points de liaison simple brin (par exemple T et G comme les vingt et unième et vingt-deuxième nucléotides, respectivement, pour la plupart des brins) pour éviter bases coulissant autour des points de liaison (par exemple, si les deux vingt et unième et vingt-deuxième nucléotides T étaient, il était possible pour la vingt-premier nucléotide de se lier à la séquence nucléotidique que la vingt-deuxième nucléotide est censé lier à).
  3. Modifier manuellement les séquences d'ADN pour le marquage de la streptavidine, la transformation des rectangles dans des tubes, la formation de différents rectangles et les tubes à travers des échelles différentes, et pour empêcher l'agrégation provoquée par les domaines apparentes SST.
    1. Remplacer les domaines exposés à la limite de la toile moléculaire avec poly-T tracts.
    2. Pour le marquage de la streptavidine, la conception des segments de poignée (le segment supplémentaire annexée à la mèche de composant qui peut se lier à une contrepartie complémentaire tel qu'un brin anti-handle) de manière à pouvoir accueillir un brin anti-poignée avec 3 'modification de la biotine.
    3. Pour la conversion d'un rectangle dans un tube, enlever les lignes du haut et du bas du rectangle et insérer une nouvelle ligne dont le SST ont complémentarité spécifique aux tuiles correspondantes sur la seconde à la première rangée et la seconde à rangée du bas.
    4. Pour un domaine simple brin exposée de différentes formes, remplacer avec de la poly-T segments de 10-11 nucléotides de longueur, ou couvrir par des protecteurs de bord qui sont complémentaires au domaine exposée et se terminent avec un 10-11 nucléotides longs segments poly-T.

2. Préparation des Toile moléculaires

  1. Obtenir brins constitutifs d'ADN de séquences spécifiées dissous dans l'eau exempte de RNases à partir d'un oligonucleotide fabricant dans V bas plaques à 96 puits avec des oligonucléotides synthétisés à une échelle de 10 nmol avec dessalage standard. Les Centrifuger les plaques à 96 puits avec les brins d'ADN pour environ 10 s à 600 x g.
    1. 1 ul de chacun des 362 puits avec des brins d'ADN pour le 24H × 28T rectangle (figure 3A) à 100 uM par brin (spécification du fabricant) dans un tube de 2 ml d'essai. Ajouter 138 pi d'eau distillée H 2 O déminéralisée au tube 2 ml d'essai pour obtenir une solution stock de mélange de brins à une concentration de 200 nM par brin.
  2. Ajouter 50 pi de la solution 200 nM du stock de mélange de brins, 10 pl de 10X recuit tampon A (Tris 50 mM, pH 7,9, EDTA 10 mM, 250 mM MgCl 2), et 40 pi de l'eau distillée déminéralisée 2 O à un 0,2 Tube ml PCR. Ce qui fait un échantillon de 100 ul de la toile moléculaire dans 1X tampon de recuit A (Tris 5 mM, pH 7,9, 1 mM d'EDTA, 25 mM de MgCl2).
  3. Recuire le sample pendant 17 heures dans un cycleur thermique de refroidissement de 90 ° C à 25 ° C. Programmer le thermocycleur comme suit: rampe vers le bas à partir de 90 ° C à 61 ° C à une vitesse constante de 5 ° C par minute; rampe vers le bas à partir de 60 ° C à 25 ° C à une vitesse constante de 20 ° C par minute; et incuber à 4 ° C jusqu'à ce que l'échantillon peut être prélevé sur le thermocycleur.
  4. Préparer un gel d'agarose natif de 2%.
    1. Mesurer 2,4 g d'agarose dans un bécher de 600 ml. Ajouter 120 ml de tampon TBE 0,5X (44,5 mM de Tris-borate, pH 8,3, EDTA 1 mM) et 30 ml d'eau désionisée distillée dans le bécher.
    2. Micro-ondes pendant 3 minutes (ou 40 - 60 sec après ébullition). Reconstituer l'eau perdue pendant l'évaporation par addition de 30 ml d'eau, ce qui contribue à maintenir la concentration d'agarose dans le gel à 2%.
    3. Agiter le contenu du bécher pendant 1 minute dans un bain d'eau froide. Ajouter 1 ml de 1,2 M MgCl 2 (pour faire un mM MgCl 2 10 concentration dans le gel) et pré-colorent l'esprit de gelh 6 pi de colorant SYBR Safe (1: 20.000).
    4. Verser la solution de gel dans une boîte de gel sec et insérez un 1,5 mm 12 et électrophorèse sur gel peigne épaisse. Que la solution se solidifier pendant 15 - 30 min sur une plate-forme encore.
    5. Verser le tampon du gel de roulement (44,5 mM de Tris-borate, pH 8,3, EDTA 1 mM et MgCl2 10 mM) dans la surface du gel. Charge 2 - 3 pi de 1 kb échelle d'ADN dans un puits du gel d'agarose. Mélanger 4 pl de colorant bleu de bromophénol 6X (0,25% de bleu de bromophénol, 5 mM de Tris, 1 mM d'EDTA, 10 mM de MgCl 2 et 30% de glycerol) avec 20 ul de l'échantillon de la toile moléculaire et charger la solution dans un autre puits de la gel d'agarose.
  5. Exécutez le natif agarose à 2% pendant 2 heures à 100 V dans un bain d'eau glacée (bleu de bromophénol, en bleu, est plus rapide que de brins constitutifs de sorte qu'il peut servir d'indicateur que si le temps de 2 h de marche est approprié).
  6. L'image du gel en utilisant un scanner de gel avec un filtre approprié pour la tache sûre de SYBR (figure 2B
  7. Sur une lumière transilluminator bleu, exciser la bande dominante à mobilité semblable à la bande des 1 500 paires de bases de l'ADN échelle de 1 kb en utilisant une lame de rasoir propre pointu. Placez le morceau de gel souhaité (s) dans une colonne de centrifugation et ensuite écraser le gel en petits morceaux à l'aide d'un pilon de microtubes. Centrifuger à 438 g pendant 3 min à 4 ° C.
  8. Mesurer la concentration de l'ADN en utilisant un spectrophotomètre ultra-violet à 260 nm.
    1. Utilisez 2 pi de ultrapure DNase / eau distillée RNase-Free comme blanc pour calibrer la machine.
    2. Utiliser un volume équivalent de l'échantillon prélevé à partir de la colonne de centrifugation pour obtenir une estimation de la concentration d'ADN. La valeur mesurée de concentration ("a" = ng / ul) obtenu à une absorption des UV de 260 nm aidera à déterminer le facteur de dilution pour l'AFM et l'imagerie TEM.
    3. Autre mesurée à partir de la concentration "a" (ng / ul) à "b" (nM) suivant b = a × 10 6 / (330 &# 215; nombre de nucleotides).
      NOTE: Le poids moléculaire d'un nucléotide est 330 g / mol. La valeur de concentration molaire calculée permettra de déterminer le facteur de dilution pour l'AFM et TEM imagerie. En ce qui concerne le cas d'un rectangle 28T x 24H, la mesure commun pour l'échantillon purifié est de l'ordre de 10 à 60 ng / ul. Comme le nombre de nucleotides d'une telle structure est 14 616 Da, la concentration molaire est d'environ 2 à 12 nM. La concentration finale est déterminée par le rendement de collecte (~ 20 à 50% de) de centrifugation et le volume de la bande de gel excisée out (plus le volume, le plus dilué l'échantillon purifié).

Imagerie 3. microscopie à force atomique

  1. Décoller mica attaché à un disque échantillon métallique à l'aide de ruban adhésif pour obtenir une surface plane et placez le disque de l'échantillon sur la scène de l'imagerie.
  2. Ajouter 40 ul de tampon d'hybridation 1X Un suivi par 5 ul (2-5 nM) de l'échantillon purifié de la 24H x 28Trectangle à la surface du mica fraîchement clivé. Laisser le mélange reposer pendant environ 2 min.
  3. Installez AFM puce cantilever de nitrure de silicium sur un support en porte à faux. Utiliser un embout C triangulaire (fréquence de résonance, f 0 = 40 à 75 kHz; constante de rappel, k = 0,24 Nm -1) pour l'imagerie.
  4. L'image d'un échantillon dans le mode de fluide de taraudage. Utilisez les paramètres d'imagerie suivantes pour la numérisation: numérisation taille de 2 pm, 1024 lignes de la résolution, et une vitesse de balayage de 0,5 à 1 Hz (figure 2C).
  5. Si nécessaire, ajouter 10 ul de solution mM ou plus de 10 NiCl 2 pour augmenter la force de liaison de 29 l'ADN-mica.

4. Préparation d'échantillons pour Streptavidin étiquetage

  1. Concevoir manuellement le 24H × 28T rectangle de telle sorte que les brins de poignée à des endroits spécifiques sont incorporés à être complémentaire aux brins anti-poignée avec la modification de la biotine, qui à leur tour sont capables de se lier à streptaviden particulier.
    1. Modifier la toile moléculaire par fixation d'un «segment 3 de 17 nucleotides qui consiste en une séquence nucléotidique de deux (TT) d'entretoise et une poignée 15 nucleotides (GGAAGGGATGGAGGA) pour les tuiles 14 de la rangée supérieure et les 14 tuiles sur le fond rangée du rectangle (figure 3A) pour étiqueter la frontière. Cette séquence est complémentaire d'un brin anti-modifié de la poignée 3 'de la biotine (biotine-TCCTCCATCCCTTCC).
  2. Pour le marquage intérieur, fixer le segment en 3 'de nucleotides 17 à 8 tuiles internes et six carreaux aux limites du rectangle (figure 4A).
    1. Mélanger les 28 brins avec poignées (étiquetage limite) avec le reste des brins constitutifs 24H × 28T rectangle (334 brins) pour faire une solution stock de 200 nM. Mélanger les 14 brins avec poignées (étiquetage interne) avec le reste des brins constitutifs 24H × 28T rectangle (348 brins) pour obtenir une solution stock de 200 nM.
  3. Pour boundary étiquetage, ajouter 50 ul de la solution mère de 200 nM de brins, 6 pi des 100 uM biotine modifiée brins anti-poignée, 10 ul du tampon A recuit 10X et 34 ul d'eau distillée désionisée à un de 0,1 à 0,2 tube à essai ml PCR. La concentration finale du brin composant est de 100 nM et la concentration finale de l'anticorps anti-biotine poignée brin modifié est de 6000 nM. Notez que 28 molécules de la poignée anti-biotine modifiée brin se lient à une 24H × 28T rectangle de sorte que le brin anti-biotine gérer modifié est supérieur à 100% pour faire la liaison favorable.
  4. Pour l'étiquetage interne, ajouter 50 pi de la nM solution stock 200 des brins, 3 pi de l'anti-gérer biotine brin interne modifié à 100 um, 10 ul du tampon 10X de recuit A, 37 pi d'eau déminéralisée distillée à un 0,1 - 0,2 ml tube à essai PCR. La concentration finale du brin composant est de 100 nM et la concentration finale de l'anticorps anti-biotine poignée modifi ed brin est de 3000 nM. Notez que 14 molécules de la poignée anti-biotine modifiée brin se lient à une 24H × 28T rectangle de sorte anti-biotine gérer brin modifié est supérieur à 100% pour faire la liaison favorable.
  5. Recuire les deux échantillons dans un cycleur thermique pendant 17 heures en utilisant les étapes décrites à la section 2.3.
  6. Préparer un gel d'agarose natif de 2%, comme décrit dans les étapes 2.4.
  7. Purifier les deux échantillons comme décrit dans les étapes 2.5.
  8. Mesurer les concentrations des structures d'ADN désirées, comme décrit dans les étapes 2.6.

5. microscopie à force atomique pour l'étiquetage Streptavidin

  1. Image chaque échantillon en utilisant un AFM comme décrit dans l'étape 3 (figures 3B et 4B).
  2. Après le premier tour de formation d'image, ajouter 40 ul de tampon d'hybridation 1X A suivie par une pi de streptavidine à 10 mg / ml de l'échantillon. Laisser le mélange reposer pendant environ 2 min avant reimaging (figures 3C et 4C).
_title "> 6. Conversion d'un rectangle dans un tube

  1. Afin de concevoir un tube sur la base du rectangle, garder tous les SST de composants en place, sauf les rangées supérieures et inférieures. Introduire une nouvelle ligne dont le SST sont conçus par la concaténation des demi-carreaux supérieure et inférieure de leurs colonnes respectives pour cycliser le rectangle original dans une conformation de tube (figure 5A).
  2. Mélanger la nouvelle ligne de brins (14 brins) avec les brins constitutifs 24H × 28T rectangle excluant les rangées supérieures et inférieures (336 brins) pour obtenir une solution stock de 200 nM.
  3. Suivre la purification sur gel les étapes 2.2 à 2.7 (figure 5B).

7. Transmission Electron Microscope Imaging

  1. Peser 0,06 g de formiate d'uranyle dans 3 ml d'eau distillée pour préparer une solution à 2% du formiate de tache d'uranyle aqueux. Filtrer la solution de teinture aqueuse de formiate d'uranyle à 2% en utilisant un filtre de 0,2 um fixée à une seringue.
    1. Ajouter 5 pi deN NaOH 5 à 1 ml de la solution de colorant filtrée. Vortex brièvement la solution et centrifuger à 20 000 x g.
  2. Décharge luminescente les grilles revêtues de carbone (face enduite vers le haut) avec les paramètres suivants: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar, et Haute Tension polarité négative.
  3. Utilisez une pince à fermeture automatique pour saisir une grille traitée lueur de décharge à partir du bord.
  4. Introduire à la pipette 3,5 pi d'échantillon sur la grille pendant 4 min. Utiliser un morceau de papier filtre pour évacuer hors de l'échantillon en amenant le papier filtre en contact avec la grille à partir du côté.
  5. Immédiatement ajouter 3,5 ul de la solution de colorant sur la grille pendant 1 min.
  6. Wick la tache que dans 7.4 et maintenez le papier filtre contre la grille pour 1 - 2 min.
  7. Transférer la grille à un titulaire TEM de l'échantillon et de l'image en utilisant un JEOL JEM-1400 fonctionnant à 80 kV avec un grossissement allant de 10 K à 80 K (figure 5C).

8. Construire des formes arbitraires Utilisation du Molecular Toile

  1. Identifier une forme et sélectionner les brins qui correspondent à la forme sur la toile moléculaire. Pour une forme de triangle par exemple, sélectionner 206 sur 362 brins pour la toile moléculaire.
  2. Remplacer le domaine exposé (qui est, le long de l'hypoténuse du triangle) avec un segment de 10 poly-T - 11 nucleotides de long (conception 1 sur la figure 6A), ou ajouter un protège-bord qui est complémentaire au domaine exposé et y mettre fin avec 10 - longue poly-T segment de 11 nucleotides (de conception 2 sur la figure 6A) pour empêcher l'agrégation.
    NOTE: Il suffit de recuire les SST qui correspondent aux pixels du triangle (sans utiliser brins protecteurs) va conduire à l'agrégation et aucune formation de bande de produits distinct sur un gel. Utilisez la conception bord de protection pour diverses formes car il est plus efficace des ressources; il ne nécessite que quatre autres ensembles de brins (figure 6C), comparativement à 14 jeux supplémentaires dans la conception de remplacement (Figure 6B).
  3. Créer une bibliothèque de brin pour la toile moléculaire 310-pixel qui inclut l'ensemble de base (la toile 362 SST), Set 1 * (protecteurs de bord qui se lient au domaine 1 d'un SST), Set 2 * (protecteurs de pointe qui se lient au domaine 2 d'un SST), Set 3 * (protecteurs de bord qui se lient au domaine 3 d'un SST) et Set 4 * (protecteurs de bord qui se lient au domaine 4 d'un SST) pour donner un total de 1 344 cornières.
  4. Centrifuger les plaques à 96 puits pour les différents ensembles pendant environ 10 s. Pipet les Les brins désirées dans les plaques afin de rendre une solution de stock pour une certaine forme.
    1. Pour la forme d'un triangle avec des protecteurs de pointe, 1 ul de 206 brins de l'ensemble de base, 0 from set 1 *, 0 de la série 2 *, 0 du jeu 3 * et 24 brins de série 4 * dans un 2 ml centrifugeuse tube. Ajouter 20 pi d'eau déminéralisée distillée au tube pour faire un nM solution stock des brins d'ADN 400.
  5. Ajouter 50 pi de la solution 400 nM boursier de l'ADN stra nds, 10 ul du tampon 10X de recuit B (Tris mM, pH 7,9, EDTA 10 mM, 125 mM MgCl2 50) solution stock et 40 pl distillée déminéralisée H 2 O à un tube de 0,2 ml PCR. Ce qui fait un échantillon de 100 ul du tampon 1X en triangle de recuit B (Tris 5 mM, pH 7,9, 1 mM d'EDTA, 12,5 mM de MgCl2) avec des brins à une concentration d'environ 200 nM par brin.
  6. Recuire le mélange dans un cycleur thermique pendant 17 heures comme décrit dans l'étape 2.3.
  7. Préparer un gel d'agarose natif de 2% comme décrit dans l'étape 2.4.
  8. Purifier l'échantillon tel que décrit dans l'étape 2.5.
  9. Mesurer la concentration de l'ADN comme décrit dans l'étape 2.6.
  10. L'image de l'échantillon sous AFM telle que décrite à l'étape 3 (Figure 7C et 7D).
  11. Choisissez et des brins de différentes formes en utilisant la même bibliothèque brin mélanger. Recuire les différentes solutions et de combiner échantillons purifiés de différentes formes pour gagner du temps lors de l'imagerie AFM.
jove_title "> 9 Facultatif:. Robot automatisation de conception de forme et de liquide de mélange

  1. Utilisez un programme de MATLAB personnalisé pour aider à la conception de formes complexes.
  2. Utiliser le logiciel pour transmettre des instructions sous la forme d'une séquence de pipetage pour un manipulateur de liquide robotisé. Utiliser le gestionnaire d'liquide de robot pour mélanger et sélectionner les torons qui constituent la forme de la cible.
    REMARQUE: la conception de la forme et de brin mélange a été automatisé pour réduire l'erreur humaine et de faire la construction de moins de main-d'œuvre.

10. Les rectangles et les Tubes à différentes échelles

  1. Construire différents rectangles de taille (figure 10) en modifiant simplement le nombre d'hélices parallèles (H) et le nombre de spires hélicoïdales (T).
  2. Suivez l'étape 3 pour un rectangle de taille spécifique.
  3. Suivez l'étape 6 pour un tube de taille spécifique.

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Representative Results

L'auto-assemblage de SST (figure 1) donnera une 24H x 28T rectangle, comme illustré sur la Figure 2. Les séquences d'ADN pour les différents TDDS peuvent être modifiés / optimisé pour permettre l'étiquetage de la streptavidine (figure 3 et 4), la transformation d'un rectangle dans un tube (figure 5), l'auto-assemblage programmable de SST pour former des tubes et des rectangles de différentes tailles (figure 10), et la construction de formes arbitraires 2D à l'aide de la toile moléculaire (figure 8). Deux conceptions (domaine de la conception et de design de substitution bord de protection) ont été testés comme des solutions à l'agrégation long de domaines exposés de formes arbitraires (figure 7). Les deux modèles ont un rendement comparable de gel et l'intégrité structurelle, mais la conception bord de protection est plus rentable car elle nécessite moins d'espèces auxiliaires (Figure 6).cueillette de Strand et le mélange peuvent être automatisées, comme indiqué dans les figures 9 à réduire l'erreur humaine et de gagner du temps.

Figure 1
Figure 1. L'auto-assemblage de formes moléculaires en utilisant des tuiles simple brin. (A) Le motif de SST canonique, adapté de 12 (B) de gauche et du milieu:. Deux représentations de SST assemblés. SST intérieures ont une longueur de 42 bases et sont étiquetés "U", tandis que les SST limites ont 21 bases et sont étiquetés "L". Dans le schéma de gauche, les couleurs distinguent différents domaines. Dans le schéma milieu, couleurs distinguent différents volets. Droite: Un schéma de la vue de mur de briques de structures SST. Briques épais sont SST complètes et briques minces sont SST limites. Les bords arrondis indiquent pas appariement complémentaire. Comme dans la figure du milieu, les couleurs distinguent carreaux individuels. Dans tous diagbéliers, chaque tuile a une séquence unique. (C) Retenue une sélection appropriée des brins de la collection SST qui composent la conception du rectangle dans la figure b conduit à la formation d'une forme souhaitée différente, comme un triangle (à gauche) ou un anneau rectangulaire (à droite). (d) la conception d'un tube avec une largeur et une longueur prédéterminée. (E) Etant donné un bassin de pré-synthétisé des séquences SST (en haut), des formes arbitraires (de fond) peut être conçu en sélectionnant un sous-ensemble de brins de utiliser dans le mélange de brins (sombres de pixels bleus) et en éliminant le reste (lumière de pixels bleus). Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Conception et AFM Image de la 24H × 28T Rectangle. (A) Schéma du 24H × 28T rectangle. Une vue zoomée est également indiqué pour la structure locale détaillée. L'arrangement individuel de segment de SST est soit 10 nt - 11 nt - 11 nt - 10 nt (par exemple, A2.13-B2.13-A1.13 * -b1.12 *) ou 11 nt - 10 nt- 10 nt - 11 nt (par exemple, A3.12-B3.12-A2.13 * -b2.12 *). Triangles sur le côté gauche du rectangle indiquent les lignes avec un arrangement 10nt-11nt-11nt-10nt SST; les autres SST internes ont 11 nt - 10 nt -10 nt- 11 nt place (nt est un acronyme pour nucléotide). Depuis 24H × 28T SST rectangle a des dimensions similaires à une structure ADN origami, le critère introduit dans le travail de l'ADN origami et d'envisager une SST Rectangle "bien formé" si elle n'a pas de défaut dans le schéma prévu de plus de 15 nm de diamètre était adopté. En outre, un "bien formé" la structure ha rectangles pas de trous dans son intérieur plus grand que 10 nm de diamètre a été nécessaire. Après les critères ci-dessus, un «bien-formation« ratio de 55% (N = 163) a été obtenu. Un astérisque rouge (*) indique le coin inférieur gauche du rectangle ici. (B) électrophorèse sur gel d'agarose natif de 2%. U, non purifié; P, purifié (par extraction sur gel de voie U) (C) de l'image AFM de la structure en treillis. (Taille de balayage: 2 pm x 2 pm). Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Boundary étiquetage des 24H × 28T Rectangle. (A) Schéma du bi spécifique24H x 28T Otin rectangle marqué. Les brins surlignés en bleu sont les brins de poignée. Les brins surlignés en rouge sont les brins anti-poignées marqués avec 3 'biotine (points noirs). Streptavidine est dépeint comme une boule orange l'image (B) de l'AFM avant d'ajouter (format de numérisation: 1 um x 1 um) streptavidine.. (C) AFM image après l'ajout de streptavidine (format de numérisation: 1 um x 1 um). En médaillon, une vue zoomée montrant étiquetage succès. Notez que la streptavidine soit apparu comme points blancs ou des bandes en raison de leurs hauteurs soulevées. Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Dansinterne étiquetage des 24H × 28T Rectangle. (A) Représentation schématique de la biotine spécifique marqué 24H x 28T rectangle. Les brins surlignés en bleu sont les brins de poignée. Les brins surlignés en rouge sont les brins anti-poignées marqués avec 3 'biotine (points noirs). Streptavidine est dépeint comme une boule orange l'image (B) de l'AFM avant d'ajouter (format de numérisation: 1 um x 1 um) streptavidine.. (C) AFM image après l'ajout de streptavidine (format de numérisation: 1 um x 1 um). En médaillon, une vue zoomée montrant étiquetage succès. Notez que la streptavidine soit apparu sous forme de points blancs ou des rayures dues à des hauteurs soulevées. Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

within-page = "always"> Figure 5
Figure 5. Conception et Image MET de 24H × 28T Tube. (A) Schéma du 24H × 28T baril. Deux points de vue zoomée en haut et en bas affichent les identités de segments détaillées. Notez que les segments a24.x * (par exemple, a24.13 *) et b24.x * (par exemple, b24.12 *) de la rangée supérieure sont complémentaires aux segments a24.x (par exemple, a24.13) et b24.x (par exemple, b24.12) de la rangée du bas; cette complémentarité devrait conduire à la formation de la structure tubulaire. (B) l'électrophorèse sur gel d'agarose natif de 2%. U, non purifié; Image TEM de la structure de canon P, purifié (par extraction de gel de voie U) (C) (barre d'échelle: 100 nm).. Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26.ighres.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Deux Designs pour empêcher l'agrégation causés par Exposed Post Domaines. (A) Une démonstration côte-à-côté de deux méthodes pour couvrir les domaines apparentes. Le domaine collante non apparié (domaine 4) est indiqué avec une boîte rouge pointillée. Design 1 est la conception de substitution de domaine, dans lequel le domaine non apparié est substitué par un domaine poly-T (en rouge et étiqueté "T"). Design 2 est la conception bord de protection, qui consiste à couvrir le domaine non apparié avec un brin bord de protection (en rouge et étiqueté "T-4 *"). Le brin bord de protection est composé d'une section poly-T et un complément au domaine exposée. (B) Les différentes configurations de limites possibles associés à la substitution de domaine (conception 1).Il ya 14 façons différentes d'un SST interne (en bleu) peuvent laisser un domaine ou des domaines exposés. Les substitutions de brins appropriées sont indiquées en rouge pour chaque situation. (C) La conception bord de protection (conception 2). Un SST interne (bleu) ne nécessite que quatre brins bord protecteurs (rouge) pour couvrir les domaines exposés à l'aide de cette conception. Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Deux conceptions pour le Triangle SST. (A) et (B) représentent des schémas basés sur la conception 1 (domaine substitution) et la conception 2 (protecteur de bord) à la figure 8, respectivement. Une région poly-T (T10 ou T11 dans la figure) est dépeint commeun coin arrondi dans le diagramme. L'encart montre une vue agrandie de la structure indiquée à la case en pointillés. Les barres d'échelle, 100 nm. (C) et (D) sont les images AFM. Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26.

Figure 8
Figure 8. Diagrammes et AFM Images de 100 formes différentes. Dessins de structure sont affichés dans les panneaux supérieurs. Coloration bleu clair indique les brins de toile à gauche sur le mélange tout en colorant bleu foncé indique les brins inclus. Pour plus de clarté, brins bord protecteurs sont omis. Une image de l'AFM correspondant de chaque structure est représentée ci-dessous sa conception. Chaque image est × 150 nm à 150 nm dans la région. Il ya 100 formes uniques. Inclus sont 10 chiffres arabes, les 26 lettres majuscules de l'alphabet latin, 23 signes de ponctuation et Keyboard symboles, 10 émoticônes, 9 symboles astrologiques, 6 caractères chinois, et plusieurs symboles divers. Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9. Schéma Robot automatisation de flux. Ce schéma représente le flux de travail utilisé pour automatiser le processus de mélange. Tout d'abord, un programme MATLAB personnalisé est utilisé pour concevoir la forme désirée. Une fois de plus, les rectangles bleu foncé indiquent les brins à être inclus dans le mélange. Après la conception est terminée, le programme génère un ensemble d'instructions de pipetage pour le manipulateur de liquides robotique. Le robot Pipettes les concentrations correctes des brins appropriés pour une forme particulière dans un plate bien. Le mélange est ensuite soumis à un recuit de pot, suivi par imagerie AFM des formes obtenues. (Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10. Auto-assemblage de rectangles et tubes à différentes échelles. (A) images AFM de rectangles SST avec les dimensions suivantes conçu (de gauche à droite):. 4H × 4T, 6H × 7T, 10H × 10T, 12H × 14T, 18H × 20T, 24H × 28T et 36H × 34T ( B) Les poids moléculaires des structures sont sur ​​une échelle logarithmique. L'astérisque indique le poids d'une structure de l'origami ADN M13 typique comme une référence. (C) des images de TEMdes tubes SST avec les dimensions suivantes conçus (de gauche à droite): 8H × 28T, 55T × 8H, 8H × 84T, 28T × 24H et 12H × 177T. Toutes les barres d'échelle montrent 100 nm. Ce chiffre a été modifié à partir d'un chiffre déjà publié 26. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans l'étape de formation de la structure, il est important de maintenir une concentration appropriée de cations de magnésium (par ex., 15 mM) dans le mélange de brin d'ADN de nanostructures d'ADN auto-assembler. De même, dans l'étape de caractérisation gel d'agarose / purification, il est important de maintenir une concentration de cations de magnésium approprié (par ex., 10 mM) dans le gel et le tampon du gel de fonctionnement pour retenir les nanostructures d'ADN durant l'électrophorèse. Pour la structure de 28T x 24H rectangle, nous avons testé un recuit dans différentes concentrations de Mg ++ et on a trouvé que la structure formée typiquement dans la plage de 10 à 30 mM de Mg ++ (avec le meilleur rendement de formation avec environ 20 mM de Mg ++).

Contrairement à la structure de l'origami échafaudage, la structure SST a une architecture modulaire. Différentes formes peuvent être conçus de la même toile en sélectionnant le sous-ensemble approprié de carreaux SST. En outre, la structure est assemblé en arrière SSTM uniquement courts brins d'ADN synthétiques et ne nécessite pas une longue échafaudage qui est utilisé dans l'approche de l'origami. Par conséquent, la taille de la structure SST est pas limité par la longueur disponible de l'échafaudage. Cependant, alors que l'approche de l'ADN origami peut souvent être optimisé pour produire soit des structures plissées ou de monomères dépliées, SST peut entraîner des structures partiellement formés et donc peut exiger la purification de gel pour une utilisation ultérieure. En outre, en raison du manque d'un brin d'échafaudage, une structure SST peut être plus "fragiles" que son homologue de l'ADN origami. Tant l'approche SST et l'approche de l'ADN origami évoluent rapidement, et un utilisateur est conseillé de choisir une approche qui convient le mieux à ses besoins fonctionnels particuliers.

Il est frappant de constater que des centaines de petits monomères médiation que par les interactions de liaison locales peuvent auto-assembler en une forme prescrite mondiale, comme en témoigne l'approche SST. Les principes fondamentaux figurant dans l'approche sho SSTULD être généralisables à des matériaux à côté des brins d'ADN, et la méthode de base décrite dans cet article, après modification appropriée, devrait permettre les constructions de structures complexes auto-assemblés à partir de matériaux divers.

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Acknowledgments

Ce travail a été financé par le Bureau du Programme de recherche navale Young Investigator N000141110914 Award, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF CAREER Award CCF1054898, New Innovator Award 1DP2OD007292 de directeur des NIH et l'Institut Wyss pour Biologiquement Inspirée Fonds de démarrage Faculté de génie (PY) et Tsinghua de Pékin-Centre pour le Fonds de démarrage sciences de la vie (BW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA Strands  Integrated DNA Technology Section 3.1
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen S33102 Section 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns BIO-RAD 731-6166 Section 3.6
Bruker's Sharp Nitride Lever Probes Bruker AFM Probes SNL10 Section 4.3
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator Invitrogen G6600 Section 3.6
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428 000.414 Section 3.6
Transmission Electron Microscope  Jeol Jem 1400 Section 7.4
Multimode 8 Veeco Section 4
Typhoon FLA 9000 Laser Scanner GE Heathcare Life Sciences 28-9558-08 Section 3.5
Ultrapure Distilled water Invitrogen 10977-023 Section 3.7.1
Mica disk SPI Supplies 12001-26-2 Section 4.1
Steel mounting disk Ted Pella, Inc. 16218 Section 4.1
carbon coated copper grid for TEM Electron Microscopy Sciences FCF400-Cu Section 7.2
tweezers Dumont 0203-N5AC-PO Section 7.31
glow discharge system Quorum Technologies K100X Section 7.2
DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler BIO-RAD PTC–0240G Section 3.3
Owl Easycast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems ThermoScientific B2 Section 3.4.3
Seekam LE Agarose 500G Lonza 50004 Section 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder, Ready-To-Use 75-20000bp ThermoScientific SM1333 Section 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis Spectrophotometer ThermoScientific Section 3.7
0.2 um filter Corning Inc. 431219 Section 7.1.2

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References

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